CC BY
112
УДК 575.21:579.834.114.616.98.-07
ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАГЕННОГО И ОБЩЕТОКСИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ 1,1-ДИМЕТИЛГИДРАЗИНА И ПРОДУКТОВ ЕГО ТРАНСФОРМАЦИИ НА КЛЕТКИ БИОСЕНСОРНЫХ ШТАММОВ E. COLIИ КЛЕТКИ ЭУКАРИОТ
Анатолий Борисович БЕКЛЕМИШЕВ1, Игорь Алексеевич ЛАВРИНЕНКО1,
Александр Владимирович РЯБЧЕНКО1, Виктор Иванович ТКАЧЕНКО1,
Светлана Есимбековна БАТЫРБЕКОВА2, Валентина Александровна ЛАВРИНЕНКО3,
Алина Витальевна БАБИНА3
НИИ биохимии СО РАМН
630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
2Казахский национальный университет им. аль-Фараби, Центр физико-химических методов анализа 050012, г. Алматы, ул. Карасай батыра, 95а
3ГОУ ВПО Новосибирский государственный университет 630090, г. Новосибирск, ул. Пирогова, 2
Цельноклеточный биосенсор — штамм E. coli BL-21(DE3), содержащий рекомбинантную плазмиду pRAC-GFP, отвечает на воздействие 1,1-диметилгидразина (1,1-ДМГ) и продуктов его трансформации — диметилгидразо-нацетальдегида, перекиси водорода и формальдегида, — индуцированным синтезом белка GFP. Индукция обусловлена включением системы SOS-репарации путем активации промотора recA, под регуляцией которого находится в составе плазмиды pRAC-GFP ген gfp. SOS-ответ клеток биосенсора на 1,1-ДМГ, перекись водорода и формальдегид носит дозозависимый характер. 1-метил-1Н-1,2,4-триазол, 1,1,4,4-тетраметил-2-тетразен и нитро-зодиметиламин не были генотоксичны, однако в присутствии окислителей оказывали существенное цитотокси-ческое воздействие на клетки цельноклеточного биосенсора, несущие плазмиду pETm-GFP, регистрируемое по подавлению синтеза белка GFP.
Ключевые слова: цельноклеточный биосенсор, E. coli BL-21(DE3), плазмида pRAC-GFP, плазмида pETm-GFP, генотоксиканты, экотоксиканты, SOS-репарация, recA промотор, 1,1-диметил-гидразин.
Запуски космических ракет во многих стра- нанс, хроматография высокого давления) и генети-нах осуществляются с использованием в качестве ческие методы (Ames-тест, Mutatox-анализ, umu-жидкого ракетного топлива 1,1-диметилгидразина тест, гес-1ас-тест, SOS-хромотест, Pro-tox-анализ), (1,1-ДМГ). В результате аварий и при падении позволяющие оценить мутагенный потенциал первых ступеней тяжелых ракетных носителей в этих соединений, требуют дорогостоящего обо-окружающую среду может попасть от нескольких рудования, квалифицированного персонала и не сот килограммов до нескольких тонн этого опасно- пригодны для рутинного использования. В этой го экотоксиканта, что создает значительный риск связи создание и применение высокочувстви-для здоровья людей. Детальный механизм цито- тельных биосенсоров, позволяющих осуществлять токсического эффекта 1,1-ДМГ изучен недоста- быстрый скрининг исследуемых образцов веществ точно полно [1—6]. Не выяснен и вопрос, оказы- на их гено- и цитотоксичность, является актуаль-вают ли 1,1-ДМГ и продукты его трансформации ной задачей экологии и биотехнологии. мутагенное воздействии на геном клетки эукариот Цель настоящей работы — конструирование цель-
и прокариот. Существующие физико-химические ноклеточных биосенсоров на основе рекомбинант-методы определения содержания гидразинов в ных штаммов E. coli BL-21(DE3) для обнаружения организме и окружающей среде (спектрометрия, гено- и экотоксикантов в объектах окружающей газовая хроматография, ядерный магнитный резо- среды и оценка токсического и возможного мутаген-
Беклемишев А.Б. — д.б.н., зав. лабораторией генной инженерии, e-mail:beklem@soramn.ru Лавриненко И.А. — к.б.н., ведущ.н.с. лаборатории генной инженерии, e-mail: igor@academ.org Рябченко А.В. — к.б.н., старш.н.с. лаборатории генной инженерии, e-mail: masterbio@soramn.ru Ткаченко В.И. — н.с. лаборатории генной инженерии, e-mail: dikoepole_vt@mail.ru Батырбекова С.Е. — д.х.н., зав. лабораторией экологии Казахского национального университета им. аль-Фараби, Центра физико-химических методов анализа, e-mail: batyrbekova@cfhma.kz Лавриненко В.А. — проф. кафедры физиологии Новосибирского государственного университета, e-mail: igor@academ.org
Бабина А.В. — аспирант кафедры физиологии, e-mail: phisiol@nsu.fen.ru
ного воздействия на клетки биосенсоров 1,1-ДМГ и продуктов его трансформации - 1,1,4,4-тет-раметилтетразена (ТМТ), 1-метил-1,2,3-триазола (МТ), N-нитрозодиметиламина (НДМА), диметил-гидразонацетальдегида, формальдегида и перекиси водорода. В данной работе предполагалось также исследовать токсическое воздействие 1,1-ДМГ, НДМА, ТМТ и МТ на ткани эукариот — периферическую нервную систему лягушки.
Материал и методы
Конструирование биосенсорных штаммов E. coli и определение с их помощью возможного мутагенного и токсического воздействия 1,1-ДМГ и продуктов его трансформации на клетки прокариотов.
При конструировании рекомбинантных штаммов E. coli использовали стандартные генноинженерные методы [7]. Определение возможного мутагенного и токсического действия 1,1-ДМГ и продуктов его трансформации на биосенсорные штаммы E. coli BL-21(DE3), несущие плазмиду pRAC-GFP и pETm-GFP, осуществляли по следующей схеме. Ночные культуры биосенсорных штаммов E. coli пересевали в пробирки со свежей средой Лурия — Бертани и выращивали на шейкере при 37 °С до оптической плотности D600 = 0,4—0,5. Затем в пробирки вносили различные количества 1,1-ДМГ или продуктов его трансформации и продолжали растить культуры 1,5 ч, после чего пробирки, содержащие биосенсорный штамм, несущий плазмиду pRAC-GFP, инкубировали при температуре 4—6 °С в течение 1,5 ч для созревания хромофора GFP. В пробирки с культурой биосен-сорного штамма, несущего плазмиду pETm-GFP, вносили изопропил - бета- D -тиогалактопиранозид (ИПТГ) до концентрации 1 мМ и продолжали растить культуры еще 1 ч, после чего инкубировали при температуре 4—6 °С в течение 1,5 ч для созревания хромофора GFP. На конечной стадии определяли оптическую плотность при 600 нм клеток в каждой из пробирок и измеряли флюоресценцию клеток (длина волны возбуждения 491 нм, длина волны эмиссии 511 нм) на спектрофлюорофото-метре RF-5301PC «Shimadzu» (Япония). На основе полученных данных по оптической плотности и флюоресценции вычисляли фактор индукции (Fi) по формуле: Fi = (E х D t) / (E t х D ) [8],
т г J \ exp cont' ' v cont exp7 L J 5
где Eexp — флюоресценция, измеряемая в опытных пробах; Econt — флюоресценция, измеряемая в контрольных пробах; Dcont — оптическая плотность в контрольных пробах; Dexp — оптическая плотность в опытных пробах.
Определение токсического действия 1,1-ДМГ и продуктов его трансформации на периферическую нервную систему лягушки.
Работу по оценке токсического действия 1,1-ДМГ и продуктов его трансформации выполняли на нервно-мышечном препарате лягушки, состоящем из седалищного нерва и икроножной мышцы (n. ischiadicus — m. gastrocnemius). Во всех выпол-
ненных экспериментах руководствовались правилами проведения работ на животных (приложения
1, 2, 3 к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977). Регистрировали составной потенциал действия седалищного нерва с помощью исследовательского комплекса «Biopac System, Inc.» (США). В экспериментах исследовали токсическое влияние 1,1-ДМГ, ТМТ, МТ и НДМА на некоторые электрофизио-логические характеристики составного потенциала действия седалищного нерва лягушки. Во всех экспериментах использовали максимальную силу раздражения, равную 0,5 вольтам. Регистрацию составного потенциала осуществляли в течение 5 минут с момента аппликации препарата, через 30, 60, 120, 180, 300 секунд. Для оценки токсичности использовали величину амплитуды и скорость проведения сигнала возбуждения. Работа выполнена на 20 нервно-мышечных препаратах.
Обработку полученных результатов вели с помощью пакета программ «Biopac BSL Pro». Вычисляли среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего арифметического значения (m) и представляли в виде M ± m.
Результаты и обсуждение
Одной из задач данного исследования была разработка цельноклеточного биосенсора для оценки мутагенного воздействия различных химических соединений на геном. Ранее в нашей лаборатории был разработан вектор pREB-6His, предназначенный для индуцируемой экспрессии клонированных в его составе целевых генов [9], которая осуществлялась под контролем регуляторной области гена recA Proteus mirabilis. Индукцию экспрессии генов проводили с применением налидиксовой кислоты, митомицина С или ультрафиолетового излучения. Это наблюдение натолкнуло нас на мысль о возможности создания на основе клеток E. coli, несущих плазмиду, аналогичную pREB-6His, биосенсора для обнаружения мутагенов химической и физической природы в окружающей среде. На первом этапе работы был сконструирован индикаторный штамм E. coli BL-21(DE3), содержащий плазмиду pREB-GFP (pREB2), в составе которой был клонирован кодирующий район гена зеленого флюоресцирующего белка GFP. Экспрессия гена gfp в индикаторном штамме осуществлялась под контролем регуляторной области гена recA Proteus mirabilis. При воздействии на клетки этого штамма УФ-излучения или химических мутагенов клетки отвечали быстрым возрастанием синтеза GFP, что, по-видимому, было обусловлено включением системы SOS-репарации в ответ на генотоксический эффект. Полученные результаты позволили сделать заключение о возможности использования полученного рекомбинантного штамма E. coli в качестве цельноклеточного биосенсора. Однако полученные конструкции плазмид pREB и pREB2 обладают некоторыми недостатками. В частности, терминатор транскрипции в этих плазмидах рас-
SD Start
(1) -ATCTTTATGCTTCÄCTGCCCAGAGGGAGAATTCATG - pREB2
(2)-*»»*****»***»»*****»»*****»***»**tATG - pREB3
(3 )---ATTAACTTTATACAGGAAACA* * * * * *TATG - pRAC
Enhancer SD Start
Рис. Сравнение нуклеотидных последовательностей в области сайта связывания рибосом исходного и модифицированного регуляторного района гена recA Proteus mirabilis в составе сконструированных векторов экспрессии pREB2 (1), pREB3 (2) и pRAC (3). ENH — энхансер трансляции гена 10 фага Т7,
SD — сайт связывания рибосом, Start — кодон инициации трансляции ATG, * — нуклеотиды, гомологичные представленным в нуклеотидной последовательности вектора pREB2 (1).
положен на 565 пар нуклеотидов правее терминатора трансляции, что приводит к синтезу более длинного транскрипта. Сайт связывания рибосом расположен не на оптимальном расстоянии от инициирующего кодона. В этой связи были сконструированы производные вектора pREB2, которые были лишены вышеперечисленных недостатков. В частности, были проведены следующие модификации при получении конечной конструкции вектора, получившего название pRAC и содержащего клонированный в его составе ген gfp (рис.):
1) выполнена замена района, включающего сайт связывания рибосом и последовательность слева от ATG кодона регуляторной области гена recA P. Mirabilis, на соответствующую область регуляторного района сильного синтетического промотора Ptaq;
2) слева от встроенного сайта связывания рибосом промотора Ptaq был встроен энхансер трансляции гена 10 фага Т7;
3) район плазмиды pREB2, расположенный между терминатором трансляции и терминатором
транскрипции T0, был удален, в результате чего расстояние между обоими терминаторами было значительно сближено. Полученная конструкция рекомбинантной плазмиды (pRAC) обеспечивала 3-кратное по сравнению с плазмидой pREB2 увеличение экспрессии гена gfp в клетках E. coli. Штамм E. coli BL-21(DE3), несущий плазмиду pRAC, был использован в дальнейшей работе в качестве цельноклеточного биосенсора для определения гено-токсичности 1,1-ДМГ и продуктов его трансформации. В серии независимых экспериментов было показано, что клетки этого штамма отвечают на воздействие 1,1-ДМГ (100 мМ) и продуктов его трансформации — диметилгидразонацетальдеги-да (100 мМ), перекиси водорода (200—1300 мкМ) и формальдегида (300—1300 мкМ) — индуцированным синтезом белка GFP, возрастающим по сравнению с контролем в 5, 2, 9 и 2,5 раза соответственно. SOS-ответ клеток биосенсора на перекись водорода и формальдегид носит дозозависимый характер. Такие продукты трансформации
1,1-ДМГ, как МТ, ТМТ и НдМА, не оказывают генотоксического воздействия на клетки.
Второй вариант цельноклеточного биосенсора предполагалось создать на основе штамма E. coli BL-21(DE3), несущего плазмиду, обеспечивающую индуцируемую ИПТГ экспрессию входящего в ее состав гена gfp. Ожидалось, что токсическое воздействие каких-либо исследуемых веществ на клетки биосенсора должно сопровождаться подавлением макромолекулярных синтезов, в т. ч. синтеза белка и, в частности, индуцируемого ИПТГ синтеза GFP. В целях получения этого варианта биосенсора на основе исходного вектора pET-36b(+), содержащего сильный промотор фага Т7, была получена рекомбинантная плазмида pETm-GFP, содержащая полилинкер для клонирования целевых генов и встроенную по сайту XhoI кодирующую область гена gfp, находящуюся в рамке трансляции с по-
Таблица 1
Влияние 1,1-ДМГ на индуцированный ИПТГ (2 mM) синтез GFP штаммом E. coli BL-21(DE3), несущим плазмиду pETm-GFP
Концентрация 1,1-ДМГ, mM Флуоресценция (F), у.е. Оптическая плотность ф600нм), о.е. Подавление синтеза белка GFP (%)
100 152 ± 27 0,26 ± 0,03 95
50 335 ± 31 0,3 ± 0,03 90
25 155 ± 4 0,5 ± 0,03 83
12 99 ± 2 1,3 ± 0,08 70
6 2000 1,8 ± 0,14 30
3 2500 1,9 ± 0,05 20
Контроль (—): без внесения 1015 ± 46 1,7 ± 0,1
1РТО и 1,1-ДМГ
Контроль (+): без внесения 1,1-ДМГ с индукцией 1РТв 3045 1,6 ± 0,1
Таблица 2
Характеристики составного потенциала действия седалищного нерва лягушки при аппликации исследуемых препаратов
Препарат Концентрация, % Амплитуда, вольт Скорость проведения (м/с)
Контроль Время действия (с) Контроль Время действия (с)
30 60 120 180 300 30 60 120 180 300
НДМА 0,001 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 45 37,5 37,5 36 42 42
0,1 0,018 0,018 0,017 0,018 0,02 0,02 51 38 36 39 39 41
ТМТ 0,001 0,02 0,018 0,02 0,02 0,02 0,02 50 31 29 32 27 27
0,1 0,02 0.02 0,016 0,014 0,007 0,006 47 31 29 32 27 27
МТ 0,001 0,02 0,02 0.018 0,015 0,008 0,006 56 46 44 46 44 45
0,1 0,02 0.015 0,006 Препарат погиб 46 33 22 Препарат погиб
1,1-ДМГ 0,001 0,02 0,02 0,02 0,019 0,02 0,02 51 34 36 31 33 25
0,1 0,02 0,013 0,006 Препарат погиб 50 35,7 32,6 Препарат погиб
следовательностью полилинкера. Экспрессия гена индуцировалась ИПТГ и по подавлению синтеза ОБР под воздействием экотоксикантов можно было судить об общетоксическом влиянии на клетку исследуемых соединений.
Данные, полученные при изучении влияния
1,1-ДМГ на клетки биосенсорного штамма Е. соїі БЬ-21(БЕ3), содержащие плазмиду рЕТт-ОБР, представлены в табл. 1. Из этих данных очевидно, что при воздействии на клетки, содержащие рекомбинантную плазмиду рЕТт-ОБР, возрастающих концентраций 1,1-ДМГ наблюдается значительное снижение индуцируемого ИПТГ синтеза ОБР. Снижался и неиндуцированный синтез белка ОБР. Как отмечалось выше, МТ, ТМТ и НДМА не обладали генотоксическим эффектом. Однако в присутствии окислителей (2 мМ феррицианида калия или 100 мкМ перекиси водорода) МТ и ТМТ, но не НДМА, оказывали существенное цитотоксическое воздействие на клетки цельноклеточного биосенсора, несущие плазмиду рЕТт-ОБР, регистрируемое по подавлению синтеза белка ОБР. Полученные результаты свидетельствуют о высокой токсичности 1,1-ДМГ и продуктов окисления МТ и ТМТ по крайней мере для клеток прокариот.
Из табл. 2, в которой представлены данные о токсичности 1,1-ДМГ и продуктов его трансформации (МТ, ТМТ и НДМА) для клеток эукариот, видно, что электрофизиологические показатели составного потенциала действия седалищного нерва лягушки лежат в пределах, характерных для данно-
го вида животных. Аппликация 1,1-ДМГ в концентрации 0,001 % не приводила к изменению амплитуды потенциала действия, и лишь МТ вызывал ее понижение. При этом уменьшалась скорость проведения сигнала возбуждения, что свидетельствует о токсическом действии препаратов. Наиболее заметной токсичностью обладали 1,1-ДМГ и ТМТ. При использовании 0,1 % концентрации исследуемых соединений их токсическое действие стало более выражено. Так, ТМТ, МТ и 1,1-ДМГ вызывали падение амплитуды и снижение скорости проведения сигнала возбуждения примерно в два раза (табл. 1). Аппликация МТ и 1,1-ДМГ приводила к гибели препарата на второй минуте эксперимента. На основании проведенных экспериментов можно сделать вывод о токсическом действии 1,1-ДМГ и некоторых продуктов его трансформации (ТМТ, МТ) на нервную систему эукариот.
Заключение
1. Рекомбинантный штамм Е. еоН, несущий плазмиду рЯЛС-ОГР, может служить в качестве цельноклеточного биосенсора для определения генотоксикантов в окружающей среде и изучения мутагенных свойств создаваемых новых лекарственных средств, биологически активных препаратов и антибиотиков.
2. 1,1-диметилгидразин и некоторые продукты его трансформации (диметилгидразон ацетальде-гида, перекись водорода, формальдегид) оказывают генотоксическое действие на клетки биосен-сорного штамма.
3. 1,1-диметилгидразин, 1-метил-1,2,4-триазол, 1, 1,4,4-тетраметил-2-тетразен высокотоксичны
как для прокариот, так и для эукариот.
Данная работа была поддержана грантом МНТЦ № К-1482.
Список литературы
1. Delft J.-H., Steenwinkel M.-J., Groote J.-L. Determination of 7N-6O-methylguanine in rat liver DNA after oral exposure to hydrazine by use of immunochemical and electrochemical detection methods // Fundam. Appl. Toxicol. 1997. 35. 131— 137.
2. Gamberini M., Cidade M.R., Valotta L.A. et al. Contribution of hydrazine—derived alkyl radicals to cytotoxicity and trasformation induced in normal c-myc-over expression mouse fibroblasts // Carcinogenesis. 1998. 19. 147—155.
3. Sinha B.H. Enzyme activation of hydrazine derivatives // J. Biol. chem. 1983. 258.7 96—801.
4. Malca-Mor L. Mutagenecity and toxicity of carcinogenic and other hydrazine derivatives // Appl. Environ. Microbiol. 1982. 44. 801—805.
5. Parody S., DeFlora S., Cavanno M. et al. DNA-damaging activity in vivo and bacterial mutagenecity of sixteen hydrazine derivatives as related quantitatively
to their carcinogenicity // Cancer Res. 1981. 41. 1469-1481.
6. Fitzgerald B.E., Shank R.C. Methylation status of DNA cytosine during the course of induction of liver cancer in hamster by hydrazine sulfate // Carcinogenesis. 1996. 17. 2703-2709.
7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., 1984. 480 с.
Maniatis T., Fritsch E.E., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual. M., 1984. 480 p.
8. Kostrzynska M., Leung K.T., Lee H., Trevors J.T. Green fluorescent protein-based biosensor for detecting SOS-inducing activity of genotoxic compounds // J. Microbiol. Methods. 2002. 48. 43-51.
9. Иванов И.Д., Беклемишев А.Б. Клонирование и анализ экспрессии фрагмента гена fla b новосибирского изолята Borrelia garinii NT29 в клетках E. coli и исследование антигенных свойств рекомбинантного белка // Бюл. СО РАМН. 2002. (1). 97-102.
Ivanov I.D., Beklemishev A.B. Cloning and analysis of expression of fla b gene’s fragment from Novosibirsk isolate of Borrelia garinii NT29 in E. coli C600, and study of antigenic characteristics of the recombinant protein // Bul. SO RAMN. 2002. (1). 97-102.
STUDY THE MUTAGENIC AND GENERALLY TOXIC INFLUENCE OF 1,1-DIMETHYLHYDRAZINE AND PRODUCTS OF ITS TRANSFORMATION ON E.COLI BIOSENSOR CELLS AND EUKARYOTIC CELLS
Anatoliy Borisovich BEKLEMISHEV1, Igor’ Alekseevich LAVRINENKO1,
Aleksandr Vladimirovich RYABCHENKO1, Viktor Ivanovich TKACHENKO1,
Svetlana Esimbekovna BATYRBEKOVA2, Valentina Aleksandrovna LAVRInEnKO3,
Alina Vital’evna BABINA3
1Scientific Research Institute of Biochemistry of SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov st., 2
2Kazakh National University named after al-Faraby, Center of physical and chemical methods of analysis 050012, Almaty, Karasai batyr st., 95
3Novosibirsk State University 630090, Novosibirsk, Pirogov st., 2
Whole-cellular biosensor — strain of E. coli BL-21 (DE3), which contains the pRAC-GFP recombinant plasmid, responds to the effects of 1,1-dimethylhydrazine (1,1-DMH) and products of its transformation (dimethylhydrazone acetaldehyde (DMHAA), hydrogen peroxide and formaldehyde) by induced synthesis of the GFP. Induction is due to the initiation of SOS-repair system through the activation of recA promoter, that regulates expression of gfp gene in composed of pRAC-GFP plasmid. SOS-responses of biosensor cells for hydrogen peroxide and formaldehyde were dose dependent. 1-methyl-1H-1 ,2,4-triazol, 1,1,4,4-tetramethyl-2-tetrazen and N-nitrosodimethylamine have no genotoxic effects on cells. However, in the presence of oxidants these compounds exert significant cytotoxic influence on the biosensor cells which contain the pETm-GFP plasmid. Cytotoxic influence of these compounds was recorded by determination of the suppression of the GFP synthesis.
Key words: whole-cellular biosensor, E. coli BL-21 (DE3), pRAC-GFP plasmid, pETm-GFP plasmid, genotoxicants, ecotoxicants, SOS-repair, recA promoter, 1,1-dimethylhydrazine.
Beklemishev A.B. — doctor of biological sciences, head of laboratory of gene engineering, e-mail: beklem@soramn.ru
Lavrinenko I.A. — candidate of biological sciences, leading research scientist of laboratory of gene engineering, e-mail: igor@academ.org
Ryabchenko A.V. — candidate of biological sciences, scientific researcher of laboratory of gene engineering, e-mail: masterbio@soramn.ru
Tkachenko V.I. — scientific researcher of laboratory of gene engineering, e-mail: dikoepole_vt@mail.ru Batyrbekova S.E. — doctor of chemistry sciences, head of laboratory of ecology, Kazakh National University named after al-Farabi, Center of physical and chemical methods of analysis, e-mail: batyrbekova@cfhma.kz Lavrinenko V.A. — professor of chair of physiology of Novosibirsk State University, e-mail: igor@academ.org Babina A.V. — post-graduate student of chair of physiology, e-mail: phisiol@nsu.fen.ru
