CC BY
102УДК 542.943-92+542.06
О.В. Матвеева, Н.В. Лакина, В.Ю. Долуда, Э.М. Сульман СОВРЕМЕННЫЕ ТЕНДЕНЦИИ ПРИМЕНЕНИЯ ОКСИДОРЕДУКТАЗ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ
(Тверской государственный технический университет) e-mail: olechkamatveeva@mail.ru
Оксидоредуктазы - класс ферментов, широко используемый в фармацевтической, пищевой, биотехнологической промышленности, медицине и аналитической химии, как эффективные и экологически чистые биокатализаторы для проведения окислительно-восстановительных реакций. В представленном обзоре отражены современные тенденции применения лакказ, пероксидаз и глюкооксидаз.
Ключевые слова: биокатализаторы, оксидоредуктазы, биотехнология, иммобилизация ВВЕДЕНИЕ
К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции с участием двух субстратов и лежащие в основе биологического окисления.
Классические оксидоредуктазы являются гемопротеидами, которые специфичны только в отношении акцептора водорода, т.е. пероксида водорода, а в качестве доноров они могут использовать различные соединения [1].
Для биотехнологов оксидоредуктазы представляют большой интерес, так как такие ферменты высокоселективны и способны катализировать промышленно важные химические процессы. Например: каталазы используются в молочной промышленности для дезинфекции молока с целью исключения стадии пастеризации, дегидрогеназы применяются с целью получения органических кислот. Оксидоредуктазы также используются в медицинской диагностике, в синтезе важных лекарственных препаратов, в биоремедиации окружающей среды, в стереоселективном химическом синтезе [2, 3].
ПЕРСПЕКТИВНЫЕ СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ ОКСИДОРЕДУКТАЗ В ТЕКСТИЛЬНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
В настоящее время особую актуальность приобретает замена химической окраски тканей на биотехнологическое окрашивание с использованием оксидоредуктаз. Это обусловлено прежде всего тем, что процесс окрашивания тканей включает в себя применение токсичных реактивов. Для процесса обработки тканей характерны высокая температура и давление, образование большого количества агрессивных щелочных растворов, загрязняющих окружающую среду. Улучшение технологии окраски тканей возможно путем применения ферментов.
В работе [4] представлено весьма перспективное применение лакказы в процессе:
- окраски кератина (волосы, шерсть) или целлюлозы (хлопок);
- отбеливания текстильными красителями;
- делигнификации целлюлозы;
- удаления фенольных смол или других ксенобиотиков и загрязняющих веществ в процессах очистки сточных вод текстильной промышленности.
Лакказа является медьсодержащим ферментом и катализирует реакцию восстановления молекулярного кислорода различными органическими и неорганическими соединениями. В присутствии редокс-медиаторов лакказа может окислять органические соединения, что способствует закреплению красителя на ткани.
В статье [5] авторами изучена технология окраски текстиля при помощи кубового и сернистого красителей на стадии повторного окисления в присутствии ферментов - лакказы и пероксида-зы. Такая технология включает в себя следующие стадии: 1) восстановление красителя, для его растворения и адсорбции на поверхности тканей; 2) окисление красителя, для закрепления его на поверхности ткани. Установлено, что ферменты ускоряют стадию повторного окисления восстановленных красителей и способствуют улучшению качества прокрашенной ткани. Химизм данного процесса представлен на рис. 1.
Лейкокраситель
Медиатор
е" Си (II)
Лакказа —► —
Н,0
Окислительно- ^J Постановленный
востановительный медиатор
краситель
Рис. 1. Схематическое представление механизма лакказока-тализируемого повторного окисления восстановленного лей-кокрасителя
Fig. 1. Schematic presentation of the mechanism for laccase-catalyzed re-oxidation of reduced (leuco) dye
В отсутствие окислительно-восстановительного медиатора происходит прямой перенос электронов между лейкокрасителем и лакказой. Для окисления в присутствии пероксидазы, часть лакказы-^ (II) заменяется на пероксидазу^ (V) и Fe (IV), часть лакказы-^ (I) - на пероксидазу-Fe (III) и часть O2 - на H2O2. Было исследовано влияние начальной концентрации фермента, температуры, рН реакционной среды на активность лакказы и пероксидазы в процессе повторного окисления красителей (VB43, VO7, SB1) и определены оптимальные условия использования лак-казы и пероксидазы.
СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ГЛЮКООКСИДАЗ В КАЧЕСТВЕ БИОСЕНСОРОВ
Развитие безреагентных методов анализа, основанных на использовании различных биохимических сенсоров является важным направлением развития современной аналитической химии. Биосенсором следует считать устройство, у которого чувствительный слой, содержащий биологический материал (бактерии, ткани, ферменты, дрожжи, антитела / антигены, липосомы, рецепторы, органеллы, ДНК) генерирует сигнал, связанный с концентрацией этого компонента. Принцип работы биосенсора заключается в том, что определяемое вещество проникает через полупроницаемую мембрану в тонкий слой биoкатализатора, в котором проходит ферментативная реакция или активация фермента с последующей регистрацией изменения сигнала.
В настоящее время амперометрический биосенсор на основе иммобилизованной глюкоок-сидазы является самым распространенным и широко применяется для определения сахара в крови в диагностировании диабета [6]. Схема действия биосенсора на глюкозу заключается в следующем: концентрация кислорода прямо пропорциональна току его восстановления на катоде, а при наличии субстрата происходит снижение концентрации кислорода. Таким образом, ток восстановления кислорода снижается пропорционально концентрации субстрата.
Селективность представленного выше биосенсора достаточно высока. Его избирательность определяется высокой специфичностью глюкооксидазы. Однако, системы, имеющие в основе небиологический преобразователь концентрации глюкозы, в отличие от ферментсодержа-щего биосенсора, не являются селективными. Тем не менее, существует большое количество ограничений применения биосенсора, что обусловлено действием кислорода и других посторонних ве-
ществ, способных проходить через мембрану, а поэтому задача усовершенствования биосенсорных конструкций для определения глюкозы является крайне актуальной.
Многообразие применения биосенсоров на основе глюкооксидазы в различном инженерном исполнении может быть представлено следующими примерами:
1. Контроль уровня глюкозы в процессе брожения [7].
2. Контроль концентрации глюкозы в безалкогольных напитках [8].
3. Тест-системы для мониторинга содержания глюкозы в крови и ее сыворотки [9 - 12].
Наиболее распространенными источниками глюкооксидазы являются грибы Aspergillus, Pénicillium, и Saccharomyces. Большинство коммерчески выпускаемых глюкооксидаз выделяются из мицелия Aspergillus niger, выращиваемого в процессе для производства глюконовой кислоты. Соответственно, фермент получают, в основном, как побочный продукт в процессе производства глюконовой кислоты.
ПРИМЕНЕНИЕ ГЛЮКООКСИДАЗЫ ДЛЯ СОЗДАНИЯ БИОТОПЛИВНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ (БТЭ)
Современное состояние топливно-энергетического комплекса и уменьшение запасов традиционных топлив, диктует необходимость перехода на альтернативные источники энергии. Возможным путем решения этой проблемы является разработка биотопливных элементов. Биотопливные элементы состоят из анода, катода, ионного проводника, анодной и катодной камеры. В работе [13] исследуется применение глюкооксидазы для получения биотопливных элементов, которые способны трансформировать биохимическую энергию в электрическую энергию (рис. 2).
Рис. 2. Схема биотопливного элемента на основе глюкооксидазы
Fig. 2. The scheme of biofuel element on the base of glucooxidase
Биоэлектрические устройства являются энергозависимыми, требуя небольшое количество энергии для устойчивой работы. Биотопливные элементы состоят из двух электродов, изготовленных из стабилизированного и проводящего материала, модифицированного оксидоредуктазами,
которые специфично осуществляют окислительно-восстановительные процессы. Один из подходов к производству встраиваемой биосовместимой биохимической ячейки с отсутствием мембраны является создание биотопливной ячейки, состоящей из ферментмодифицированного анода, на котором происходит окисление глюкозы при помощи глюкооксидазы либо глюкозодегидрогеназы. Эти ферменты объединены в катодную пару с ферментом, восстанавливающим кислород (используются лакказы, билирубиноксидазы или ци-тохромоксидазы). Перенос электронов от биокатализаторов может осуществляться при помощи полимеров либо специальных переносчиков. Обе топливные молекулы - кислород и глюкоза, легко доступны в биологических жидкостях. Максимальная ЭДС подобных элементов при нормальном физиологическом рН равняется 1В.
ПРИМЕНЕНИЕ ГЛЮКООКСИДАЗЫ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
Основными направлениями модернизации пищевой промышленности является разработка современных биотехнологических способов производства продуктов с целью уменьшения негативного влияния жестких производственных режимов обработки сырья, улучшения качества, интенсификации производства, усиления ароматических, вкусовых и других потребительских свойств продукции [14].
Так, глюкооксидаза успешно применяется для удаления остатков глюкозы и кислорода в продуктах питания и напитках, с целью увеличения срока годности. Глюкооксидаза/каталаза используется для удаления глюкозы в процессе производства яичного порошка, для предотвращения его потемнения [15].
В работе [16] было изучено влияние глю-кооксидазы на реологические свойства теста и качество хлеба. Авторы показали, что качество пшеничного теста хлеба укрепляется и улучшается при добавлении глюкооксидазы. Глюкоокси-дазные/каталазные системы позволяют контролировать неферментативное потемнение при переработке фруктов. Кроме того, глюкооксидаза используется для предотвращения цветовых и ароматических изменений продуктов питания, а также для стабилизации цвета и аромата пива, рыбы, консервов и безалкогольных напитков в результате удаления кислорода из продуктов питания и напитков.
Глюкооксидаза нашла применение и в винодельческой промышленности. Испытания показали, что обработка вина глюкооксидазой может уменьшить потенциальное содержание алкоголя в
вине примерно на 2% преобразованием глюкозы, участвующей в реакции брожения, в 6-глюконо-1,5-лактон. Кроме того, глюкооксидаза способна подавлять порчу вина в результате ее бактерицидного действия на уксусно- и молочнокислые бактерии [17].
ПРИМЕНЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗ
Еще одним широко применяемым в биотехнологии ферментом является пероксидаза. Пе-роксидазы катализируют различные окислительно-восстановительные реакции в присутствии пе-роксида водорода.
Большое количество работ посвящено применению и рациональному использованию специфических окислительно-восстановительных свойств пероксидаз. Систематизируя представленные данные, можно выделить следующие направления применения: 1) использование пероксидаз для детоксикации почв; 2) пероксидаза применяется для биологической очистки сточных вод, загрязненных фенолами, крезолами и хлорированными фенолами; 3) создание биосенсоров на основе пероксидазы для определения пероксида водорода и органических гидроперекисей. В то же время они могут быть использованы для определения глюкозы, спиртов, глутамата и холина.
Так, в работе [18] изучается окислительная полимеризация фенолов и ароматических аминов, которая проводится в присутствии пероксидазы в воде и смешивающихся с водой органических растворителей. Такая полимеризация может привести к новым типам ароматических полимеров.
Иммуноферментные пероксидазосодер-жащие аналитические тесты являются простым и надежным способом обнаружения токсинов, патогенных микроорганизмов, снижают риск развития злокачественных опухолей [19]. Аналитическое применение пероксидазы повсеместно расширяется в связи с ее высокой активностью, простотой определения продуктов реакции, легкой иммобилизацией и стабильностью иммобилизованных препаратов [20, 21].
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ В ОРГАНИЧЕСКОМ СИНТЕЗЕ
В настоящее время ферментативно катализируемый органический синтез in vitro вызывает особый интерес. Использование ферментов как катализаторов в органическом синтезе имеет ряд преимуществ: 1) реакция протекает в мягких, в отношении температуры, давления, рН, условиях; 2) процесс имеет высокую селективность; 3) ферменты - природные нетоксичные катализаторы, в связи с чем ферментативный катализ является экологически обоснованным.
В работах [22, 23] изучались способы синтеза биокатализаторов путем иммобилизации пе-роксидазы на неорганические подложки (А1^3 и SiO2). В результате использования разработанного биокатализатора на стадии каталитического окисления 2,3,6-триметилфенола до 2,3,5-триметил-гидрохинона в получении витамина Е, выход конечного продукта реакции составил 98%. В качестве окислителя был использован пероксид водорода.
OH
CH3
OH
kat
CH3^
2,3,6-триметилфенол
Н2О2
CH3
OH
2,3,6-триметилгидрохинон
Рис. 3. Реакция процесса окисления триметилфенола Fig. 3. Trimethylphenol oxidation reaction
Ферментативное окисление 2,3,6-триметилфенола пероксидом водорода в присутствии пероксидазы можно рассматривать как возмож-
1. E-Fe3+ + H2O2
ную альтернативу для химических процессов окисления синтеза витамина Е с высоким выходом целевого продукта. На рис. 3 представлена химическая реакция прямого окисления триме-тилфенола до триметилгидрохинона.
Первой стадией каталитического процесса является образование комплекса между железом, входящим в активный центр фермента и перокси-дом водорода. После активации пероксида водорода пероксидазой на второй стадии процесса окисления образуется ферментсубстратный комплекс, включающий в себя активную гидроксиль-ную группу и резонансная структура триметил-циклогексанона. На заключительной стадии процесса окисления происходит взаимодействие активной формы триметилцеклогексанона и гидро-ксильной группой, входящей в состав активированной формы фермента. Результатом такого процесса является восстановление нативной формы фермента и образование конечного продукта -2,3,5-триметилгидрохинона (рис. 4).
E I-[Fe /O]+ + H2O
O
CH3
OH
триметилциклогексенон-2 2,3,5-триметилгидрохинон
Рис. 4. Механизм реакции окисления ТМФ до ТМГХ пероксидом водорода в присутствии пероксидазы хрена
H
Fig. 4. The mechanism of the trimethylphenol oxidation reaction by hydrogen peroxide in the presence of horseradish peroxidase
В представленной работе было показано, что методы синтеза катализаторов имеют существенное влияние на их активность.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Применение оксидоредуктаз в пищевой, фармацевтической, биотехнологической промышленности в качестве эффективных биокатализаторов для проведения окислительно-восстановительных реакций, является важным направлением научно-технического развития в связи со значительными преимуществами в экономии химических реагентов или энергии и в повышении качества готовой продукции.
Оксидоредуктазы могут быть успешно применены в технологии окраски тканей; в без-
реагентных методах анализа, основанных на использовании различных биохимических сенсоров; для разработки экологически чистых источников электрической энергии - биотопливных элементов (БТЭ) и в тонком органическом синтезе.
Применение биокаталитического окисления с использованием оксидоредуктаз можно рассматривать в качестве эффективной альтернативы химического окисления.
ЛИТЕРАТУРА
1. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир. 1982. Т. 1. 392 с.; Dixon M., Webb E. Enzymes. M.: Mir. 1982. V. 1. 392 p. (in Russian).
2. Безсуднова Е.Ю., Слуцкая Э.С., Стеханова Т.Н., Попов В.О. // Современ. пробл. науки и образов. 2011. № 6. (прил. "Биологические науки"). C. 14;
Bezsudnova E.Yu, Slutskaya E.S, Stekhanova T.N, Popov
V.O // Sovr. Probl. Nauki i Obrazov. 2011. N 6. (pril. "Biological nauki"). P. 14 (in Russian).
3. Сидоров А.И., Ожимкова Е.В., Тихонов Б.Б. Ферменты: свойства, иммобилизация, применение. Тверь: ТГТУ. 2010. 139 с.;
Sidorov A.I., Ozhimkova E.V., Tikhonov B.B. Ferments: properties, immobilization, application. Tver': TGTU. 2010. 139 р. (in Russian).
4. Kunamneni A., Plou F.J, Ballesteros A., Alcalde M.Recent // PatBiotechnol. 2008. V. 2. N 1. Р. 10-24.
5. Xu F., Salmon S. // Eng. Life Sci. 2008. N 3. P. 331-337.
6. Joseph Wang // Chem. Rev. 2008. N 108. Р. 814 - 825.
7. Vodopivec M., Berovic M., Jancar J., HRPgornik A., Strancar A. // Anal Chim Acta. 2000. N 407. P. 105-10.
8. Kergaravata S.V., Pividori M.I., Hernandez S.R. // Talan-ta. 2012. N 88. P. 468 - 476.
9. Cui G, Yoo J.H., Woo B.W., Kim S.S., Cha G.S., Nam H. // Talanta. 2001. N 54. P. 1105-11.
10. Kim S.H., Lee S.M., Kim D.U., Cui J.Z., Kang S.W. // Dyes Pigm. 2001. N 49. P. 103-8
11. Santoni T., Santianni D., Manzoni A., Zanardi S., Masci-ni M // Talanta. 1997. N 44. P. 1573-80.
12. Zhu J., Zhu Z., Lai Z., Wang R., Guo X., Wu X. // Sensors. 2002. N 2. P. 127-36.
13. Sandip B. Bankar, Mahesh V. Bule, Rekha S. Singhal, Laxmi Ananthanarayan // Biotechnology Advances. 2009. No 27. Р. 489-501.
14. Zhang C., Kim S. // Advances in Food and Nutrition Research. 2012. V. 65. P. 423 - 435.
15. Rasiah I.A., Sutton K.H., Low F.L., Lin H.M., Gerrard J.A. // Food Chem 2005. N 89. P. 325-328.
16. Bonet A., Rosell C.M, Caballero P.A, Gomez M., Perez-Munuera I., Lluch MA // Food Chem. 2006. N 99. P. 408-415.
17. Malherbe D.F., du Toit M., Cordero R.R., van Rensburg P., Pretorius I.S. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. N 5-6. P. 502-511.
18. Oguchi T., Tawaki S., Uyama H., Kobayashi S. // Macro-molecular Rapid Communication. 2012. N 20. P. 401 - 405.
19. Mohsina Hamid, Khalil-ur-Rehman // Food Chemistry. 2009. V. 115. N 4. 15. P. 1177-1186
20. Monier M., Ayad D.M., Wei Y., Sarhan A.A. // International Journal of Biological Macromolecules. 2010. N 46. P. 324-330.
21. Carlos Regalado, Blanca E. García-Almendárez, Miguel A. Duarte-Vázquez // The Phytochemical Society of Europe. 2004. V. 3. N 1-2. P. 243-256.
22. Matveeva O., Lakina N., Matveeva V., Sulman M., Sul-man E., Valetsky P., Doluda V. // Top Catal. 2011. N 54. Р. 1309-1317.
23. Лакина Н.В., Долуда В.Ю., Матвеева О.В., Сульман Э.М., Матвеева В.Г.// Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2011. Т. 54. Вып. 3. С. 78-81;
Lakina N.V., Doluda V.Yu., Matveeva O.V., Sulman E.M., Matveeva V.G. // Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim. Tekhnol 2011. V. 54. N 3. P. 78-81 (in Russia).
