CC BY
173. Пузин Ю.И., Галинурова Э.И., Фатыхов А.А., Мона-
ков Ю.К // Высокомолек. соедин. сер.А. 2002. Т. 44. № 10. С. 1752-1761;
Puzin Yu.I., Galinurova E.I., Fatykhov A.A., Monakov Yu.B. // Vysokomol. Soedin. Ser.A. 2002. V. 44. N 10. P. 1752-1761 (in Russian).
4. Ярмухамедова Э.И., Пузин Ю.И., Монаков Ю.Б.
//Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2009. Т. 52. Вып. 9. С. 59-62;
Yarmukhamedova E.I., Puzin Yu.I., Monakov Yu.B. //
Izv.Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim.Tekhnol. 2009. V. 52. N 9. P. 59-62 (in Russian).
5. Торопцева AM., Белгородская K.B., Бондаренко RM. Лабораторный практикум по химии и технологии высокомолекулярных соединений. JL: Химия. 1972. 415 е.; Toropzeva A.M., Belgorodskaya K.V., Bondarenko V.M. Laboratory training on chemistry and technology of
macromolecular compounds. L.: Khimiya. 1972. 415 p. (in Russian).
6. Гладышев Г.П. Полимеризация виниловых мономеров. Алма-Ата: Наука. 1964. 322 е.;
Gladyshev G.P. Polymerization of vinyl monomers. Alma-Ata: Nauka. 1964. 322 p. (in Russian).
7. Бови Ф.А. ЯМР высокого разрешения макромолекул. / Под ред. И.Я.Слонима. М.:Химия. 1977.455 с.;
Bovy F.A. High resolution nuclear magnetic resonance of macromolecules./ Ed. I.Ya. Slonim. M.: Chemistry. 1977. 455 p. (in Russian).
8. Ефремова Е.П., Чихаева И.П., Сгаврова С.Д, Богачев Ю.С., Журавлева II.J1, Праведников А.Н. // Высокомолек. соедин. Сер.А. 1985. Т. 27. №3. С. 532-537; Efremova E.P., Chikhaeva I.P., Stavrova S.D., Bogachev Yu.S., Zhuravleva I.L., Pravednikov A.N. //Vysokomol. Soedin. Ser.A. 1985. V. 27. N 3. P. 532-537 (in Russian).
Кафедра общей и аналитической химии
УДК 547.52/68:577.15 Н.В. Лакина, В.Ю. Долуда, О.В. Матвеева, Э.М. Сульман, В.Г. Матвеева
БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИМЕТИЛГИДРОХИНОНА
(Тверской государственный технический университет) e-mail: sulman@ online .tver.ru
Предложен новый подход к синтезу полупродукта витамина Е - триметилгид-рохинона с использованием иммобилизованной пероксидазы (КФ 1.11.07.) Рассмотрены основные методы получения триметилгидрохинона, представлен обзор новых каталитических способов его получения. Приведены результаты исследований, показывающие высокую эффективность биокаталитического способа синтеза триметилгидрохинона с применением нативного и иммобилизованного фермента.
Ключевые слова: триметилфенол, витамин Е, триметилгидрохинон, окисление, фермент, иммобилизация, пероксидаза хрена, модификация, хитозан, карбодиимид
ВВЕДЕНИЕ
Селективное окисление ароматических соединений открывает доступ к большому количеству ценных соединений. Хиноны с различными функциональными группами являются важными интермедиатами в тонком органическом синтезе, поскольку хиноновые фрагменты часто входят в состав соединений, используемых в производстве витаминов и лекарственных препаратов. Так, 2,3,5-триметилгидрохинон (ТМГХ) является ключевым интермедиатом в синтезе витамина Е [1].
До конца 1980-х годов стехиометрическое окисление 2,3,6-триметилфенола (ТМФ) такими реагентами, как диоксид марганца, перманганат и бихромат калия, азотная кислота было основным способом промышленного получения ТМГХ [2].
Многие ранее разработанные схемы синтеза витамина Е предлагали в качестве исходного соединения ароматические соединения, чаще все-
го с тремя метальными заместителями [3]. Также разработаны схемы получения витамина Е из алифатических соединений. Недостатком этих схем синтеза является многостадийность и, как следствие, — низкий выход целевого продукта (0.5-40%) [4].
Поиску каталитических систем для окисления ТМФ в последние годы уделялось большое внимание. Среди наиболее эффективных систем можно выделить соли Си, комплексы Со с основаниями Шиффа соли Яи фосфорно-молибден-ванадиевые гетерополикислоты [5,6], в настоящее время ведутся исследования по окислению ТМФ пероксидом водорода в присутствии титан-силикатных катализаторов [7-10].
Использование ферментов как катализаторов в органическом синтезе имеет ряд преимуществ: (1) реакция протекает в мягких, в отношении температуры, давления, рН, условиях и не
является энергоемкой; (2) процесс характеризуется высокой энантио-, регио- и хемоселективно-стью [11].
Предлагаемый в настоящей работе способ получения триметилгидрохинона методом ферментативного окисления можно рассматривать как экологически чистую альтернативу существующим способам получения ТМГХ с высоким выходом целевого продукта. На схеме 1 представлена химическая реакция прямого окисления три-метилфенола до триметилгидрохинона.
CH3-
он
2,3,6-триметилфенол 2,3,5-триметилгидрохинон
Схема 1. Химическая реакция прямого окисления триметил-фенола до триметилгидрохинона, где Е/А1203- иммобилизованная пероксидаза хрена на модифицированном оксиде алюминия
Scheme 1. The chemical reaction of direct oxidation of trime-thylphenol to trimethylhydroquinone, where E/A1203 - immobilized horseradish peroxidase on the modified aluminum oxide
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реагенты. В качестве субстрата использовался ТМФ «чда» (Sigma 99.9%), пероксид водорода «чда» - 30%. Для приготовления биокатализатора использовались: у-А120з - 99,9%, полисти-ролсульфокислота, карбодиимид 98% (Sigma), хи-тозан - 98% (Aldrich), очищенная пероксидаза корня хрена 100 ЕД активности, в качестве стандартного вещества для хроматографического анализа использовался триметилгидрохинон «чда» (Sigma 99.9%).
Оборудование и методики. Для приготовления биокатализатора первоначально производили модификацию оксида алюминия. Оксид алюминия суспендировали в 0.1 н растворе щелочи. К суспензии добавляли раствор полистирол-сульфокислоты. В результате был получен поликатион, который промывали дистиллированной водой до рН 7 и высушивали под вакуумом при температуре 60°С. Поликатион суспендировали в 50 мл раствора хитозана в уксусной кислоте, фильтровали, промывали дистиллированной водой и высушивали под вакуумом при температуре 60°С. После этого проводили активацию модифицированного оксида алюминия и нанесение фермента на его поверхность: 1 г носителя суспендировали в 50 мл фосфатно-буферного раствора пе-роксидазы хрена 100 ЕД активности в количестве 0.01 г/л, содержащий активирующий агент — карбодиимид. Выдерживали при медленном перемешивании в течение 60 мин при комнатной темпе-
ратуре, фильтровали и высушивали под вакуумом на лиофильной установке «Иней». В табл. 1 представлены условные обозначения исследуемых образцов катализаторов, отражающие методику их приготовления. Синтез ТМГХ осуществляли в стеклянной ячейке. Методика проведения процесса окисления триметилфенола в присутствии нативной пероксидазы хрена: триметилфенол в количестве 12.5 мл вносился в предварительно термостатированный стеклянный реактор, помещенный на магнитную мешалку и снабженный дозатором перекиси. К раствору триметилфенола добавляли 5 мл раствора нативной пероксидазы хрена с активностью 100 ЕД или расчетное количество катализатора.
Таблица 1 Способ приготовления катализатора Table 1. The method of catalyst preparing
Биокатализатор Модификаторы (М) оксида алюминия Al2O3
Полистирол-сульфо-кислота (PSS), г/л Хитозан, г/л Карбодиимид, г/л
Е - нативная форма фермента - - -
E/M1/Al2O3 0.1 1 1
E/M2MI2O3 0.1 0.5 0.5
E/M3/Al2O3 - 0.5 0.5
E/M,/Al2O3 - 0.5 1.0
В течение всего времени реакции дискретно приливали раствор пероксида водорода, в количестве, эквивалентном содержанию ТМФ (т.е. отношение перекиси водорода к ТМФ составляет 1:1), для предотвращения субстратного ингибиро-вания. В течение процесса отбирались пробы для определения концентрации ТМГХ. Опыт проводили в течение 1 часа.
В ходе анализа была использована хрома-тографическая система «SpectroPhysics, USA», снабженная рефрактометром сравнения, позволяющим проводить измерения во всей области коэффициентов преломления. Аналитическая колонка из нержавеющей стали 250x2. В качестве неподвижной фазы был использован полимерный носитель Reprogel-H, являющийся слабым катио-нообменником. Колонка характеризовалась наличием 82000 теоретических тарелок, а коэффициенты асимметрии пиков не превышали 1.005. В качестве подвижной фазы использовался раствор серной кислоты. Скорость подачи элюента 0.5 мл/мин, давление на входе колонки 24 атм. Хро-матографический анализ проводился при темпера-
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для определения наиболее активного образца была проведена серия экспериментов для сравнительной оценки приготовленных образцов
биокатализаторов с работой нативного фермента пероксидазой хрена. Полученные данные представлены на диаграмме (рисунок), из которой видно, что наиболее эффективной биокаталитической является система, приготовленная с использованием активирующего агента - карбодиимида (0,5 г/л) без обработки оксида алюминия полисти-ролсульфокислотой.
1. E-Fe3+ + H2O2 -► E I-[Fe4+/O]+ + H2O
2 3 4
Номер образца катализатора Рис. Зависимость активности иммобилизованной пероксида-
зы от способа приготовления катализатора: 1-Е, 2 - E/Mj/АШз. 3 - Е/М2/А1203 4 - Е/М3/А1203. 5 - Е/М,/А1203 Fig. Dependence of activity of immobilized peroxidase on the method of the catalyst preparation: 1 — E, 2 - E/Mi/A1203.
3 - E/M2/A1203.4 - E/M3/A1203. 5 - E/M4/A1203
Так как ферментативная реакция характеризуется высокой специфичностью по целевому продукту, скорость накопления продукта окисления ТМГХ можно принять равной скорости расходования ТМФ. Для описания кинетики реакции используют одноэлектронный механизм окисления субстратов (схема 2) [12].
Первой стадией каталитического процесса является образование комплекса между ферментом и пероксидом водорода. После активации пе-роксида водорода пероксидазой хрена на второй стадии процесса окисления образуется фермен-тсубстратный комплекс, включающий активную гидроксильную группу и резонансная структура триметилциклогексанона. На заключительной стадии процесса окисления происходит взаимодействие активной формы триметилциклогексанона и гидроксильной группы, входящей в состав активированной формы фермента. Результатом такого процесса является восстановление натив-ной формы фермента и образование конечного продукта - 2,3,5 триметилгидрохинона.
Для всех образцов катализаторов также были рассчитаны кинетические параметры фер-менткатализируемых реакций Wmax и Кт, представленные в табл. 2.
Данные табл. 2 показывают, что наиболее активно работает биокатализатор E/M3/Al2O3, приготовленный с использованием активирующего
OH
CH
2. E I-[Fe4+/O]+ +
CH
-3
CH3- " 2,3,6-триметилфено л
O
CH3.
E II- pe4+(OH)] + CH
фиме идиюю1'ексенон-2
E II- |Fe4+(OH)] +
H
CH
1римегилдикло1,ексенон-2
H
CH3
— E-Fe3+ +
CH3
OH
2 Д 5-тр1шешлшдрсщшон
Схема 2. Механизм реакции окисления ТМФ до ТМГХ пероксидом водорода в присутствии пероксидазы хрена Scheme 2. Mechanism of trimethylphenole oxidation reaction to trimethylhydroquinone by hydrogen peroxide in the presence of horseradish peroxidase
Таблица 2
Зависимость эффективности процесса окисления триметилфенола до триметилгидрохинона от способа иммобилизации пероксидазы хрена Table 2. The dependence of trimethylphenol oxidation process efficiency to trimethylhydroquinone on the method of the enzyme immobilization
№ Образец Wmax-10-3 моль/л-с Km, ммоль/л Кол-во активного фермента, 0 о
1 Е - нативная форма фермента 2.1 18 100
2 E/M1/Al2O3 2.0 9.6 46
3 E/M2/Al2O3 0.9 5.6 26
4 E/M3/AI2O3 2.4 14 85
5 E/M,/Al2O3 1.7 11.4 78
агента — карбодиимида в количестве 0.5 г/л, тогда как использование карбодиимида в большем количестве - 1 г/л не приводит к существенному увеличению выхода продукта окисления. Снижение активности биокатализатора, приготовленного с использованием карбодиимида в количестве 1 г/л наблюдается вследствие возможной перекрестной сшивки между карбоксильными и аминогруппами активных центров фермента.
3
Также была изучена зависимость стабильности иммобилизованной пероксидазы в процессе окисления триметилфенола от количества активирующего агента - карбодиимида в процессе кова-лентной сшивки между хитозаном и ферментом, представленная в таблице 3.
Таблица 3
Характеристика стабильности эффективно работающих каталитических систем Table 3. Stability characteristic of efficiently operating catalytic systems
Значения величин кинетических параметров и количество рабочих циклов процесса окисления, представленные в табл. 2, показывают, что наиболее активная форма биокатализатора Е/М3/А120з, эффективно работает в течение двенадцати циклов процесса окисления триметилфенола до триметилгидрохинона, тогда как применение нативной пероксидазы ограничено одним циклом окисления ТМФ. Иммобилизованная пероксидаза проявляет более высокую стабильность по отношению к ее нативной форме вследствие стабилизации активных центров в результате взаимодействия с полианионной подложкой, образованной в результате обработки оксида алюминия хитозаном и активации ее карбоксильных групп корбодиимидом.
ВЫВОДЫ
В результате использования разработанного биокатализатора на стадии каталитического окисления 2,3,6-триметилфенола до 2,3,5-триме-тилгидрохинона в получении витамина Е, выход конечного продукта реакции составил 98%. В качестве окислителя был использован экологически чистый, недорогой окислитель — пероксид водорода. Установлен механизм окисления ТМФ, состоящий из следующих стадий: активация перок-сида водорода нативной формой фермента перок-сидазой хрена, образование ферментсубстратного комплекса "фермент-пероксид водорода" и резо-нансноустойчивой формы триметилциклогексе-нона, взаимодействие триметициклогексенона и активной гидроксильной группы, входящей в состав ферментсубстратного комплекса с образованием конечного продукта реакции — триметилгидрохинона и регенерация нативной формы фермента.
Кафедра биотехнологии и химии
Установлено также, что иммобилизация пероксидазы хрена на оксиде алюминия, модифицированного хитозаном обеспечивает стабильную и эффективную работу фермента, а также его устойчивость к воздействию условий проведения процесса окисления. Устойчивость образованного комплекса фермент-полианионная подложка обусловлена образованием прочных ковалентных связей между хитозаном и ферментом под действием активатора карбодиимида.
Благодарим за финансовую поддержку Федеральное агентство по образованию РФ (проект П 1000).
ЛИТЕРАТУРА
1. Бакибаев А.А., Короткова Е.И., Липских О.И. // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2008. Т. 51. Вып. 5. С.48;
Bakibaev A.A., Korotkova E.I., Lipskikh O.I. // Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim.Tekhnol. 2008. V.51. N 5. P. 48 (in Russian).
2. Заломаева O.R, Иванчикова И.Д, Холдеева O.A., Сорокин А.К // Рос. Хим. Ж. 2008. № 1. С. 57; Zalomaeva O.V, Ivanchikova I.D., Holdeeva O.A, Sorokin А.Б. // Ross. Khim. Zhurn. 2008. N 1. P. 57 (in Russian).
3. Шнайдман JI.О. Производство витаминов. М.: Пищевая промышленность. 1973. 442 е.;
Snaiydman L.O. Manufacture of vitamins. M: Pishchevaya Promysh. 1973. 442 p. (in Russian).
4. Березовский B.M. Химия витаминов. M.: Пищевая промышленность. 1973. 634 е.;
Berezovskiy V.M. Chemistry of vitamins. M: Pishchevaya Pormysh.. 1973. 634 p. (in Russian).
5. Ito S., Aihara K., Matsumoto M. // Tetrahedron Lett. 1983. V. 24. P. 5249.
6. Shimizu M., Orita H., Hayakawa T., Takehira K. // Tetrahedron Lett. 1989. V.30. P. 471.
7. Корейский В.И., Скобелева В.Д, Харчук В.Г., Колен-ко И.П., Волков В.Л, Захарова Г. С., Виноградова В.Н. //Журн. общ. хим. 1985. В.55. С. 1969; Korenskiy V.I., Skobeleva V.D, Kharchuk V.G, Kolenko I.P., Volkov V.L., Zakharova G.S, Vinogradova V.N. // Zhurn. Obsh. Khimii. 1985. Issue 55. P. 1969 (in Russian).
8. Холдеева O.B., Кожевников И.В. А. С. СССР N 1719392. 1990;
Holdeeva O.V, Kozhevnikov I.V. AS. USSR N 1719392. 1990 (in Russian).
9. Матвеев К.И., Жижина Е.Г., Одяков В.Ф. Патент РФ №2165406.2001;
Matveev K.I., Zhizhina E.G., Odyakov V.F. Patent of the RF№ 2165406. 2001.
10. Chou B., Tsai C.-L., Cheng S. // Micropor. Mesopor. Mater. 2001. V.48. P. 309.
11. Бушмелев В.А, Кондратьева Т.А., Липкин М.Л., Кондратьев А. В.// Хим.-фарм. журн. 1991. В.5. С. 65; Bushmelev V.A., Kondratieva T.A., Lipkin M.A., Kondratiev А.В.// Khim.-Farm. Zhurn. 1991. Issue. 5. P. 65 (in Russian).
12. Газарян И.Г., Хушиульян Д.М., Тишков В.И.// Успехи биологической химии. 2006. Т.46. С. 303; Gazaryan I.G., Khushpuliyan D.M., Tishkov V.I. // Uspe-khi Biol. Khimii. 2006. T.46. P. 303. (in Russian).
№ п/п Вид биокатализатора Количество рабочих циклов биокатализатора Выход триметилгидрохинона, %
1 Е 1 98
2 E/M1/Al2O3 10 60
3 E/M2/Al2O3 10 40
4 E/M3/Al2O3 12 93
5 E/MVAlA, 10 68
