CC BY
1510. Мифтахов Т.Т. Исследование взаимодействия в пяти-компонентной системе Na, К, Са // F, Мо04, W04. Авто-реф. дис. ... К.Х.Н. Куйбышев: КПтИ, 1980. 14 с; Miftakhov Т.Т. Study of interaction in five components system Na. K. Ca // F. Mo04. W04 .Extended abstract of candidate dissertation for chemical science. Kuiybyshev: KPtI. 1980. 17 p (in Russian).
11. Хитрова JIM Исследование пятерной взаимной системы из фторидов, хлоридов и молибдатов калия, кальция и бария. Автореф. дис. ... кх.н. Воронеж: ВГМИ 1982. 17 е.; Khitrova L.M. Study of fivefold mutual system of fluorides, chlorides and molybdate potassium, calcium and barium. Extended abstract of candidate dissertation for chemical science. Voronezh: VSMI. 1982. 17 p. (in Russian).
12. Штер Г.Е. Исследование химического взаимодействия в пятикомпонентной взаимной системе из девяти солей Na, К, Ва // F, Мо04, W04 конверсионным методом: Автореф. ... кх.н. Куйбышев: КПтИ. 1976. 192 е.;
Shter G.E. Study of chemical interaction in five components mutual system of nine of salts of Na, K, Ba // F, MoO4, WO4 conversion method: Extended abstract of candidate dissertation for chemical science. Kuiybyshev: KPtI. 1976. 192 p. (in Russian).
13. Вердиев H.H., Дибиров M.A., Трунин А.С., Султанов Ю.И. // Изв. вузов. Цветная металлургия. 1986. № 2. С. 74-77;
Verdiev N.N., Dibirov M.A., Trunin A.S. Sultanov Yu.I.
// Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Tsvetnaya mettalurgiya. 1986. N 2. P. 74 - 77 (in Russian).
14. Посыпайко В.И., Апексеева E.A. Диаграммы плавкости солевых систем. Справочник (многокомпонентные системы). М.: Химия. 1977. 392 е.;
Posypaiyko V.I., Alekseeva E.A. Diagram of salt systems fusibility. Handbook (multicomponent systems). M: Khimiya. 1977. 392 p. (in Russian).
Кафедра общей и неорганической химии
УДК 542.943-92:542.97:542.06 О.В. Матвеева, Н.В. Лакина, В.Ю. Долуда, Э.М. Сульман
ПРЕИМУЩЕСТВА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ ПЕРОКСИДАЗЫ В СИНТЕЗЕ ПОЛУПРОДУКТА ВИТАМИНА Е
(Тверской государственный технический университет) e-mail: olechkamatveeva@mail. ru
Одним из перспективных направлений в изучении процессов тонкого органического синтеза является применение в качестве каталитических систем иммобилизованных ферментов. Работа посвящена синтезу новых биокаталитических систем на основе пе-роксидазы (КФ 1.11.07), иммобилизованной на неорганические носители SiO:, А1203 и магнитные наночастицы y-Fe3Oj. Проведена сравнительная характеристика активностей и стабильности полученных биокаталитических систем в процессе окисления триметилфенола до триметилгидрохинона — полупродукта витамина Е. В работе показано, что наибольшей активностью и стабильностью обладает биокатализатор на основе пероксидазы, иммобилизованной на стабилизированные цитратом натрия магнитные наночастицы y-Fe3Oj.
Ключевые слова: 2,3,6-триметилгидрохинон, магнитные наночастицы, иммобилизация, пероксидаза
ВВЕДЕНИЕ Высокая специфичность ферментов по отношению к различным субстратам обусловливает их широкое использование в тонком органическом синтезе. Однако, их высокая неустойчивость к воздействию повышенных температур и к действию различного рода растворителей, характерных для ведения процесса тонкого органического синтеза, значительно невилирует масштабы возможного применения высокоспецифичных фер-
ментов. Одним из решений этой проблемы является иммобилизация ферментов на различные неорганические и органические носители. В настоящее время достигнуты значительные успехи в технологии иммобилизации ферментов, что позволяет многократное использование дорогостоящих ферментов. Но традиционные методы разделения гетерогенных систем (фильтрование и центрифугирование) способствуют значительной дезактивации иммобилизованного фермента [1].
Перспективной альтернативой традиционным носителям для иммобилизации ферментов является применение магнитных наночастиц. Магнитное отделение иммобилизованных ферментов позволит не только увеличить устойчивость ферментов, но также сократить ряд химико-технологических стадий процессов отделения (фильтрование или центрифугирование) [2].
Предлагаемый в настоящей работе способ окисления 2,3,6-триметилфенола (ТМФ) до 2,3,6-триметилгидрохинона (ТМГХ) в присутствии биокатализатора на основе пероксидазы - КФ 1.11.07 (HRP) иммобилизованной на неорганический носитель можно рассматривать как экологически чистую альтернативу существующим способам получения ТМГХ с высоким выходом целевого продукта [3].
Схема синтеза полупропродукта витамина Е - ТМГХ представлена на рис. 1.
ch
ch3
н2о2
ch3'
2,3,6 -тримети лфенол
2,3,6 -тримети лгидрохинон Рис. 1. Химическая реакция прямого окисления ТМФ до ТМГХ
Fig. 1. 2,3,-trimethylphenol direct oxidation reaction to 2,3,6-trimethylhydroquinone
Исследовано влияние pH, температуры на скорость реакции окисления ТМФ до ТМГХ, а также изучена стабильность полученных биокатализаторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ РАБОТЫ Материалы
В качестве субстрата использовался ТМФ, «ч.д.а.» (Sigma 99.9%), пероксид водорода «ч.д.а.» -30%. Для приготовления биокатализаторов использовались: А120з, Si02, хитозан, уксусная кислота, глутаровый диальдегид, FeCl3-6H20, FeS04-7H20, NaOH, очищенная пероксидаза (КФ 1.11.07) с активностью 150 ед/мг (Великобритания), для стабилизации магнитных частиц применяли цитрат натрия, в качестве стандартного вещества для хроматографического анализа использовался триметилгидрохинон, чда (Sigma 99.9%). Синтез биокатализаторов Методика проведения иммобилизации пероксидазы (КФ 1.11.07) наА1203 uSi02
AI2O3 и Si02 использовались в качестве традиционных неорганических носителей: образцы массой 1 г были прокалены при 300 °С в течение 3 ч, затем проводили модификацию их по-
верхности. Для этого к 10 мл полистиролсульфо-кислоты (Р88) (0.5, 0.25 г/л) добавляли 1 г Al2O3 или 510: соответственно, перемешивали в течение 60 минут, затем навеску носителя промывали дистиллированной водой до рН 7 и высушивали в вакууме при 60 °С в течение 24 ч. Следующий этап модификации - обработка образцов раствором хи-тозана (0.2, 0.15 г/л соответственно для А1203, 8Ю2) в 0.01 М уксусной кислоте, с помощью перемешивания в течение 60 мин с последующим фильтрованием, отмывкой дистиллированной водой и высушиванием в вакууме при 60 °С [4-5]. Затем полученные образцы массой 1 г перемешивали с раствором глутарового диальдегида (50 мл) в течение 60 мин с концентрациями (0.3 и 0.2 г/л, соответственно, для А1203, 8Ю2). После чего, подготовленный таким образом носитель перемешивался в течение 60 мин с 10 мл НЯР (0.15 г/л), полученный образец биокатализатора фильтровали, промывали и высушивали при 25 °С под вакуумом.
Таким образом, были синтезированы следующие образцы биокатализаторов: 8Ю2/Р88/хи-тозан/глутаровый диальдегид/НЛР и А1203/Р88/хи-тозан/глутаровый диальдегид/НЯР.
Методика проведения иммобилизации пероксидазы (КФ 1.11.07) на магнитные наночастицы Наночастицы магнетита были синтезированы путем осаждения Ге2 + и Ге3 + в щелочных условиях в атмосфере азота при 25 °С. Кислый раствор (25 мл) соли железа (2.8 г Ге804-7Н20 и 5.2 г ГеС13-6Н20) добавляют по каплям к ЫаОН (250 мл, 1.5 М) при постоянном перемешивании. Черный осадок Ре301 улавливали неодимовым магнитом, промывали, нейтрализовали и хранили в дистиллированной воде для дальнейшего использования [6].
Для стабилизации магнитных наночастиц использовался 0.1 М раствор цитрата натрия.
Затем магнитные суспензии обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин и смешивали с раствором НЯР 0,15 г/л. Смесь перемешивали при температуре 4 °С в течение 6 часов [2]. Стабилизирующее действие цитрата натрия можно объяснить формированием магнитных наночастиц с наименьшим диаметром и с наибольшей площадью поверхности, что, в свою очередь, способствует лучшей адсорбции фермента и повышению его активности [7].
Размер полученных магнитных частиц определялся методом динамического лазерного светорассеяния.
Методика проведения процесса окисления триметилфенола
Лабораторная установка приведена на
рис. 2.
oh
oh
ch
ch
Образцы реакционной смеси периодически извлекались для анализа, который проводился методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на установке Ultimate 3000 (Dionex). В конце каждого эксперимента катализатор был отделен фильтрацией.
оввяи 8
_____|о®| =
тализаторами на основе Si02 и АЬО,. Это может быть объяснено тем, что фермент, иммобилизованный на магнитные наночастицы, лучше стаби-лизизирован за счет образования устойчивых железных комплексов [6].
Таблица
Влияние температуры на скорость окисления три-
метилфенола при 20% его конверсии Table. Temperature influence on the 1. 2,3,-trimethyl-phenol oxidation rate at 20% of its conversion
Температура, °С ' W 20 % г (2,3,6-тр им етил фенол )/(г( кат. )-с)
HRP/SiO2 HRPMI2O3 HRP/MNPs
20 0,58 1,1 1,24
25 1,4 1,4 1,62
30 2,1 1,5 1,64
35 2,5 1,7 2
40 2,55 1,9 2,5
45 2,3 1,1 2,7
50 0,3 0,4 3,1
55 0,29 0,3 2,7
Рис. 2. Схема установки для проведения процесса окисления триметилфенола: 1 - магнитное перемешивающее устройство; 2- стеклянный реактор (ячейка); 3 - термостат; 4 -емкость с перекисью водорода; 5 - HPLC-насос; 6 - холодильник; 7 - рН-метр; 8 - сборник для конденсата Fig. 2. Set up scheme for trimethylphenol oxidation: 1 - magnetic stirrer; 2 - glass reactor; 3 - thermostat; 4 - flask with hydrogen peroxide; 5 -HPLC-pump; 6 - fridge; 7 - pH-meter; 8 - condenser
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Определение влияния температуры, рН и стабильности на скорость окисления субстрата в зависимости от вида применяемого биокатализатора
Как известно [8], температура реакционной среды оказывает существенное влияние на активность работы фермента. Поэтому в данной работе исследовалось влияние температуры на скорость накопления ТМГХ в каталитическом окисления триметилфенола. Эксперименты проводились в интервале температур 20 - 55 °С, Стмф = 0.1 моль/л, Сн2о2 = 0.2 моль/л, рН 7.2 (таблица).
Данные таблицы показывают, что оптимальный диапазон температуры в реакции окисления с участием биокатализаторов на основе пе-роксидазы, нанесенной на неорганические носители Si02 и А1203 является 35 — 40 °С, при проведении реакции ниже этой температуры скорость накопления ТМГХ сильно уменьшается. А для биокатализатора на основе пероксидазы, нанесенной на магнитные наночастицы оптимальной температурой является 50 °С и такой биокатализатор является более активным по сравнению с биока-
Для определения влияния рН на скорость накопления ТМГХ эксперименты проводились в интервале рН от 4.1 до 9.1 (рис. 3).
Рис. 3. Влияние рН на окисление субстрата при 20° о конверсии (Стиф = 0.1 моль/л, СНо0о =0.2 моль/л, t = 35 °С для биокатализаторов на основе Si02 и А1203 и t = 50 °С для y-Fe304): 1 - пероксидаза на Si02, 2 - пероксидаза на А1203, 3 - перокси-
даза на магнитных наночастицах Fig. 3. Influence of pH on substrate oxidation under 20% trime-thylphenol conversion. (Ctmf = 0.1 mol/1, CH2o2 = =0-2 mol/1, t =
35 °C for Si02. A1203 and t = 50 °C for y-Fe304): 1 - peroxidase on Si02, 2 -peroxidase on A1203, 3 - peroxidase on magnetic nano-particles
Из рис. 3 видно, что наиболее высокую активность биокатализатора обеспечивает рН 7.2, такая рН используется и в дальнейших исследованиях.
Стабильность биокатализаторов была изучена при 10 последовательных экспериментах каталитического окисления триметилфенола (рис. 4).
4 5 6 Цикл
Рис. 4. Определение стабильности активности биокатализаторов (Стмф = 0.1 моль/л, СНоо = 0.2 моль/л, рН 7.2, t = 35 °С для биокатализаторов на основе Si02 и АЬОз и t = 50 °С для биокатализаторов на основе y-Fe304) Fig. 4. Biocatalysts stability determination (С^ф = 0.1 mold, CHo0o = 0.2 mold, pH 7.2, t = 35 °C for biocatalysts on the base of SiOo and AloO, and t = 50 °C for biocatalysts on the base of y-Fe304)
Полученные данные на рис. 4 указывают на то, что наиболее стабильным биокатализатором является пероксидаза, иммобилизованная на магнитные наночастицы y-Fe3O4.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В работе представлено исследование биокаталитического процесса окисления триметил-фенола с использованием синтезированных систем на основе пероксидазы иммобилизованной на неорганические носители SiCK А120з и магнитные наночастицы y-Fo,0|.
В работе изучено влияние рН и температуры на скорость окисления триметилфенола, при этом наибольшая активность синтезированных биокатализаторов наблюдалась при рН 7.2. Оптимальная температура для биокатализаторов, полученных иммобилизацией пероксидазы на SiO; и АЬОз, составила 40 °С, в то время как для биока-
тализатора, полученного иммобилизацией пероксидазы на магнитные наночастицы у-БезО^ 50 °С.
При проведении процесса окисления триметилфенола в условиях, обеспечивающих максимальный выход целевого продукта с использованием синтезированных биокатализаторов получены следующие максимальные скорости окисления триметилфенола: 2.55 г(хмф/г(ках ,-с для катализатора HRP/SiO:: 1.9 г(тмф/г(кат ,-с для катализатора HRP/АЬОз; 3.1 г(хмф,/г(ках ,-с для катализатора HRP/MNPs. Биокатализатор, синтезированный с использованием магнитных наночастиц, показал высокую стабильность при повторном использовании.
ЛИТЕРАТУРА
1. Schmidt T.F., Caseli L., David S. dos Santos Jr., Osvaldo N. Olivera Jr. // Materials Scince and Engineering C. 2009. P. 1889-1892.
2. Corgie S.C. , Kahawong P., Duan X., Bowser D., Edward J.B., Walker L.P., Emmanuel P. // Adv. Funct. Mater. 2012.
22. P. 1940-1951.
3. Долуда В.Ю., Лакина H.R, Матвеева RI'., Матвеева O.B., Сульман Э.М. // Изв. вузов: Химия и хим. технология. 2011. Т. 54. Вып. 3. С. 78-81;
Doluda V.Yu., Lakina N.V., Matveeva V.G., Matveeva
O.V., Sul'man Je.M. // Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim. Tekhnol. 2011. T. 54. V. 3. P. 78-81 (in Russian).
4. Ma M // Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 2003. V. 212. P. 219-226.
5. Веселова II.А., Кирейко A.B., Шеховцова Т.Н. // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. № 2. Т. 45. С. 143-148;
Veselova I.A., Kireiyko A.V., Shekhovtsova T.N. //
Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya. 2009. N 2. V. 45. P. 143-148 (in Russian)'
6. L.Caseli L. // Materials Scince and Engineering. 2004. V. 371-380.
7. Faquan Yu., Huang Y., Cole A.J., Yang V.C. // Biomaterials. 2009. V. 30. P. 4716 - 4722.
8. Диксон M, Уэбб Э. Ферменты. M. Мир, 1982. Т. 1. 392 е.; Dikson М., Webb Е. Enzymes. М.: Mir. 1982. Т. 1. 392 р.
(in Russian).
Кафедра биотехнологии и химии
