CC BY
72
лечения - 97-75 баллов (хороший уровень). Установлена положительная динамика показателей периферической крови. После проведения пятикратного курса химиотерапии и трансплантаций СК пуповинной крови пациентам с колоректальным раком содержание эритроцитов увеличивалось в среднем с 3,33 х
12 12 9
10 /л до 4,2 х 10 /л, гемоглобина с 81 г/л до 110 г/л, лейкоцитов с 2,24 х 10 /л до 5,1 х 109/л. При проведении комбинированной терапии пациенту с мелкоклеточной карциномой печени наблюдалось также значительное снижение содержания в крови АЛТ с 106 Ед/л до 27 Ед/л, АСТ с 179,0 Ед/л до 16 Ед/л, щелочной фосфатазы с 152,0 Ед/л до 66 Ед/л, альфафетопротеина с 45-68 МЕ/мл до 3,17-9 МЕ/мл.
Таким образом, результаты применения мононуклеарной фракции аллогенной пуповинной крови свидетельствуют о целесообразности проведения данного вида клеточной терапии для активации восстановительных процессов в органах и тканях онкологических больных, получающих цитостатическое противоопухолевое лечение. Есть все снования полагать, трансплантация СК пуповинной крови может позволить увеличить химиотерапевтическую дозу противоопухолевых препаратов без развития выраженных побочных цитостатических эффектов.
А. С. Айзенштадт, В.В. Багаева, Н.А. Иванова, Е.Ю. Кананыхина, Д.А. Иволгин, А.Б. Смолянинов
СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К КУЛЬТИВИРОВАНИЮ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова; ООО «Покровский банк стволовых клеток» Санкт-Петербург, aizendt@gmail.com
На сегодняшний день наиболее распространенный способ лечения онкологических заболеваний крови - трансплантация гемопоэтических стволовых клеток костного мозга (ГСК КМ). Однако, зачастую, последствиями такой формы трансплантации является реакция «трансплантат против хозяина». Успехи в области клеточных технологий, создание и развитие общественных регистров стволовых клеток пуповинной крови с полным молекулярно-генетическим HLA-типированием способствовали активному развитию трансплантации ГСК пуповинной крови (ГСК ПК). По сравнению с другими источниками ПК обладает рядом преимуществ: атравматичность получения материала, высокая
репопулирующая способность клеток, а также менее строгие требования к
совместимости по системе HLA-трансплантата и реципиента. С другой стороны, применение ПК для лечения взрослых пациентов до сих пор остается ограниченным. Одна из главных причин - малый объем образца ПК по сравнению с объемом КМ и, как результат, меньшая доза ГСК. В связи с чем, разработка метода культивирования CD34+ ГСК in vitro является актуальным направлением исследований. Несмотря на ряд успехов в этой области, на данный момент отсутствует общепринятый стандартизированный протокол экспансии ГСК in vitro с оптимальными комбинациями и концентрациями цитокинов.
Целью работы являлся подбор условий выделения чистой фракции CD34+-клеток из ПК и культивирования популяции CD34+-клеток при сохранении их пролиферативной активности и уменьшении степени дифференцировки.
Материалы и методы. В работе были использованы образцы ПК, полученные методом сбора из пупочной вены при неосложненных родах у пациентов родильных отделений стационаров г. Санкт-Петербурга. Для выделения чистой лейкоцитарной фракции из образца ПК использовали последовательно метод двойного центрифугирования с 6% раствором гидроксиэтилкрахмала (ГЭК) «Стабизол» и метод выделения на градиенте фикола. Чистую фракцию CD34+-клеток из полученного лейкоконцентрата ПК получали при помощи метода иммуномагнитной сепарации с использованием магнита MidiMACS Separator, колонок LS и антител к CD34+-клеткам (Miltenyi Biotec, Германия). Для культивирования ГСК использовали МСК КМ в качестве фидерных клеток, среду IMDM, заменитель сыворотки BIT 9500 (StemCellTechnologies, США) и цитокины: thrombopoietin (TPO), FMS-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt-3L), фактор стволовых клеток (SCF), IL3, IL6 (Miltenyi Biotec, Германия). Культивирование проводили в течение 7-10 суток.
Результаты. Выделение ГСК с помощью иммунномагнитной сепарации позволило получить чистую популяцию ГСК для последующего культивирования. Чистота выделения составила 90±3,2%. Объединение двух различных подходов к культивированию позволило улучшить результаты и снизить финансовые затраты. Для этого в качестве фидерного слоя для ГСК с целью снижения степени дифференцировки CD34+- клеток были использованы, полученные в нашей лаборатории, культуры МСК КМ. Также для улучшения пролиферативной активности клеток в состав ростовой среды добавляли цитокины (SCF, TPO, Flt3, IL3, IL6). Благодаря методике сокультивирования, удалось значительно уменьшить рабочую концентрацию каждого из цитокинов по сравнению с литературными данными.
Методом проточной цитофлуорометрии установлено, что более 50% клеток после культивирования экспрессируют поверхностный маркер ГСК CD34+ в отличие от маркеров CD3, CD4, CD19, CD8, CD16, CD56, т.е. являются
822
недифференцированными. Однако 11±3% клеток в полученных популяциях были положительны по НЬЛ-БЯ. Причем при культивировании без МСК положительными по НЬЛ-БЯ было 31,8±4% популяции. Благодаря проведению повторного этапа иммунномагнитной сепарации, после культивирования чистота СВ34+-клеток увеличивалась до 80-90% и на полученных клетках отсутствовал НЬЛ-БЯ маркер. При подобранных условиях культивирования количество ГСК ПК возросло в 100-200 раз. Учитывая общее количество ядросодержащих клеток (в пределах 1000х106) и среднее содержание CD34+ клеток в образце ПК, в результате применения метода культивирования из 1 образца ПК можно получить около 10-30х106 CD34+-клеток.
Таким образом, в результате работы удалось получить чистую популяцию недифференцированных CD34+ ГСК в достаточном количестве для терапевтического применения у взрослых пациентов.
М.А. Булатникова, М.А.Глебова, В.И. Ларионова, А.Б. Смолянинов
СИНДРОМЫ ХРОМОСОМНЫХ МИКРОДЕЛЕЦИЙ И МИКРОДУПЛИКАЦИЙ
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова; ООО «Покровский банк стволовых клеток» Санкт-Петербург, stemcellbank@inbox.ru
Синдромы хромосомных микроделеций и микродупликаций -многочисленная, клинически гетерогенная группа заболеваний, обусловленныых делециями или дупликациями участков хромосом протяженностью до 1-5 Мв, то есть делеций и дупликаций не выявляемых при стандартном исследовании кариотипа. Как правило это участки, захватывающие от нескольких генов до нескольких десятков генов.
На настоящий момент микроделеции и микродупликации рассматриваются как наиболее частая причина умственной отсталости у девочек, субтеломерные делеции по оценкам различных авторов обуславливают от 5 до 7% умственной отсталости у лиц обоих полов. Наиболее распространенная субтеломерная микроделеция 1р36 обуславливает до 1% случаев умственной отсталости и ее частота оценивается от 1 на 7000 живых новорожденных до 1 на 5000 живых нооворожденных, что превышает порог указанный в определении редких (орфанных) заболеваний принятый на территории РФ. Наиболее изученные микроделеции - синдромы Ангельмана и Прадера-Вилли, синдром Вильямса
