CC BY
94
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 612.119.014.083
ЭКСПАНСИЯ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В СОВМЕСТНОЙ КУЛЬТУРЕ С МЕЗЕНХИМНЫМИ СТРОМАЛЬНЫМИ
КЛЕТКАМИ ЧЕЛОВЕКА
Васина Е.В., Костюнина В.С., Петёвка Н.В.
РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий Минздрава Республики Беларусь, 220053, Минск
Резюме. Описанный в статье метод 6-дневного сокультивирования гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) пуповинной или периферической крови с мезенхимными стромальными клетками костного мозга позволяет увеличить количество целевых Сй34-положительных кроветворных клеток пуповинной крови в 30 ± 11 раз и периферической крови в 9 ± 4 раза без существенного смещения субпопуляционного состава миелоидных предшественников и влияния на жизнеспособность клеток. В разработанном методе не использованы реагенты ксеногенного происхождения и обработка стромаль-ного монослоя антимитогенами, что позволяет использовать для трансплантации как суспензионную, так и ассоциированную с монослоем фракцию ГСК, содержащую около 20% от общего прироста CD34-положительных клеток и колониеобразующих единиц.
Ключевые слова: гемопоэтические стволовые клетки; периферическая кровь; мезенхимные стромальные клетки; экспансия пуповинной крови.
Для цитирования: Гематология и трансфузиология. 2015; 60 (2): 22-26.
EXPANSION OF UMBILICAL AND PERIPHERAL BLOOD HEMOPOIETIC CELLS CO-CULTURED WITH HUMAN
MESENCHYMAL STROMAL CELLS
Vasina E.V., Kostyunina V.S., Petyovka N.V.
Center of Transfusiology and Medical Biotechnologies, 220053, Minsk, the Belarus Republic
Summary. Six-day coculturing of the umbilical or peripheral blood hemopoietic stem cells (HSC) with bone marrow mesenchymal stromal cells leads to expansion of the target CD34+ hemopoietic cells -30±1 times for umbilical blood and 9±4 times for peripheral blood cells without appreciable changes in the subpopulation composition of the myeloid precursors and in the cell viability. No reagents of xenogenic origin and antimitogen treatment of the stromal monolayer are used. This suggests using for transplantation the suspension and monolayer-associated fraction of hSc, containing about 20% of the total increment of CD34+ cells and colony-forming units.
Key words: hemopoietic stem cells; peripheral blood; mesenchymal stromal cells; umbilical blood expansion.
Citation: Gematologiya i transfuziologiya. 2015; 60 (2): 22-26. (in Russ)
Трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) проводят пациентам с онгогематоло-гическими и онкологическими заболеваниями для восстановления кроветворения после высокодозной химиотерапии. Источниками ГСК для трансплантации могут быть костный мозг (КМ), периферическая кровь после мобилизации стволовых клеток, а также пуповинная кровь. Основным ограничителем клинического использования пуповинной, а в ряде случаев и периферической крови является недостаток CD34-положительных (CD34+) клеток в заготовленном трансплантате. Проблему можно преодолеть с помощью размножения (экспансии) ГСК ex vivo. Существуют две основные стратегии экспансии ГСК: в суспензионной культуре и на стромальном подслое [1-4]. Предполагают, что поверхность стромального
Для корреспонденции:
Петёвка Наталья Васильевна, кандидат химических наук, заведующая лабораторией биотехнологии кроветворных клеток РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий Минздрава Республики Беларусь
Адрес: 220053, Минск, Долгиновский тракт, д. 160. Телефон: +8 10 375 017 289-86-20 E-mail: npetyovka@mail.ru
Corresponding author:
Petyovka Natalia, PhD (npetyovka@mail.ru)
монослоя является главным местом пролиферации ГСК in vitro, тогда как компартмент под слоем стро-мальных клеток имитирует нишу для сохранения наименее зрелых неделящихся кроветворных клеток [5]. Ранее в сравнительных экспериментах было показано, что культивирование на подложке мезенхим-ных стромальных клеток КМ (МСК КМ) приводит к сохранению более раннего фенотипа ГСК пуповинной крови и большему увеличению количества оли-гопотентных предшественников миелоидного ряда [4, 6, 7].
Большинство известных методов экспансии ГСК с использованием стромальной подложки предполагают длительное культивирование в среде, содержащей ксеногенную телячью эмбриональную сыворотку крови, которая поддерживает жизнеспособность монослоя МСК [3, 4]. Чтобы избежать избыточной пролиферации клеток, подложку облучают или обрабатывает антимитогенами, что приводит к невозможности дальнейшего использования адгезивной фракции наиболее незрелых ГСК трансплантата после экспансии [7]. Цель исследования - разработка метода экспансии CD34+-клеток пуповинной или периферической крови в условиях кратковременного сокультивирования с МСК КМ без использования реагентов ксеногенного происхождения и антимито-генов для перспектив клинического использования
ассоциированной со стромальным монослоем субпопуляции кроветворных клеток.
Материалы и методы
Культуру МСК КМ получали, как описано ранее [8], с использованием среды a-MEM ("Hyclone", США) и 5% сыворотки крови человека группы AB(IV) вместо телячьей эмбриональной сыворотки. Для получения культур МСК были использованы аспираты КМ 2 здоровых доноров КМ (мужчины 30 и 52 лет) и 8 больных (3 больных лимфогранулематозом, 4 - неходжкинской лимфомой, 1 - множественной миеломой). CD34+-клетки получали из лейкоцитарного концентрата периферической крови тех же пациентов (n = 8) или образцов пуповинной крови (n = 8). Образцы КМ и лейкоцитарного концентрата были предоставлены 9-й городской клинической больницей г. Минска, образцы пуповинной крови - Республиканским научно-практическим центром «Мать и дитя» после информированного согласия. Полученные МСК КМ были положительны по кластерам дифференцировки CD90 и CD105 и отрицательны по CD34 и CD45.
Сыворотку крови человека получали из крови здоровых доноров (РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий, Минск). Кровь инкубировали при температуре 37°С в течение 1 ч для коагуляции, после чего сгусток отделяли центрифугированием. Отобранную сыворотку повторно центрифугировали для осаждения примеси форменных элементов крови. Полученную от 6-8 доноров сыворотку крови объединяли, термоинактивиро-вали при температуре 56оС в течение 30 мин и подвергали стерилизующей фильтрации.
Источником CD34+-клеток служили лейкоцитарный концентрат мобилизированных по протоколам G-CSF-VAD, G-CSF-DHAP, G-CSF-dexa-BEAM гемопоэтических клеток периферической крови человека, а также моно-нуклеары пуповинной крови, полученные после разделения цельной пуповинной крови в градиенте плотности фиколл-пак 1,077 (Histopaque, "Sigma", США). Фракцию CD34+-клеток пуповинной и периферической крови получали методом положительной иммуномагнитной сепарации с помощью набора EasySep ("Stem Се11 Technologies", Канада) согласно инструкции производителя. Чистота фракции CD34+-клеток в среднем составляла 73 ± 18% (n = 8) для пуповинной крови и 90 ± 8% (n = 8) для периферической крови.
Для экспансии CD34+-клетки в концентрации 5 х 103/см2 для пуповинной крови и 104/см2 для периферической крови высевали в 6-луночные планшеты с монослоем МСК КМ. Экспансию ГСК пуповинной крови проводили на подслое МСК КМ здоровых доноров (5 образцов с МСК КМ одного донора и 3 образца ГСК - с МСК КМ другого), ГСК периферической крови сокультивировали с аутоло-гичными МСК КМ больных. Клетки культивировали в бессывороточной среде StemSpan ("StemCell", Канада) в течение 6 сут с добавлением цитокинов 100 нг/мл SCF, 100 нг/мл Flt3-ligand и 25 нг/мл TPO («R&D Systems», США) на 1-й и 4-й дни эксперимента. На 4-й день и за 1 день до окончания культивирования добавляли '/2 первоначального объема среды. После экспансии суспензионную фракцию клеток собирали, ассоциированную с МСК КМ фракцию гемопоэтических клеток открепляли с помощью 0,25% раствора трипсин-ЭДТА ("Invitrogen", США).
** С Li*»
* -» * V -« ' 4 'fh ♦ . « #
Рис. 1. Фазовоконтрастная микроскопия 3-дневной совместной культуры гемопоэтических CD34+-клеток периферической крови и мезенхимных стромальных клеток КМ человека.
Иммунофенотип гемопоэтических клеток до и после сокультивирования оценивали методом проточной цито-флюориметрии с использованием моноклональных антител к CD34 и СD45 ("Beckman Coulter", Франция). Учет CD34+-клеток проводили в регионе CD45+-клеток. После сокультивирования суспензионную и адгезивную к МСК фракции ГСК анализировали раздельно.
Дифференцировочный потенциал предшественников миелопоэза исследовали методом колониеобразую-щего теста в полужидкой среде MethoCult Classic H4434 ("StemCell", Канада).
Жизнеспособность гемопоэтических клеток и МСК КМ до и после сокультивирования in vitro определяли с помощью окрашивания аннексином V (Ann-5) и 7-аминоактиномицином D (7AAD) согласно инструкции производителя ("Beckman Coulter", США). Клетки, находящиеся на ранней стадии апоптоза, учитывали как Ann-5+7AAD-,анаходящиесявпозднейстадииапоптоза-как Ann-5+ 7AAD+.
Для сравнения полученных данных использовали t-тест, парный t-тест; различия считали статистически значимыми при значении р < 0,05. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Для статистической обработки данных использовали программу GraphPad Prism 5.
Результаты и обсуждение
Для формирования стромального монослоя использовали МСК КМ 1-3 пассажей, предварительно культивированные в присутствии АВ-сыворотки крови человека. Сокультивирование с CD34+ кроветворными клетками в бессывороточной среде в течение 1 нед не приводило к откреплению стромального монослоя. Часть кроветворных клеток прикреплялась к монослою МСК КМ. При фазовоконтрастной микроскопии (рис. 1) наблюдали темные веретено-видные мезенхимные клетки, локализованные под ними темные круглые гемопоэтические клетки и яркие гемопоэтические клетки на поверхности монослоя и в суспензии.
После 6-дневного сокультивирования в присутствии ростовых факторов 23 ± 7% клеток пуповинной (n = 4) и 37 ± 8% периферической (n = 3) крови оставались ассоциированными с МСК КМ. Отно-
Рис. 2. Двумерный дот-блот распределения CD34-сокультивирования с МСК КМ.
сительное содержание СВ34+-клеток пуповинной и периферической крови уменьшилось до 45 ± 12% (n = 8) и 51 ± 12% (n = 6) соответственно (рис. 2).
Так как общее количество ядросодержащих клеток (ЯСК) увеличивалось, это приводило к увеличению числа клеток, несущих кластер дифференци-ровки CD34, в 30 ± 11 и 9 ± 4 раза для пуповинной (n = 6) и периферической (n = 6) крови соответственно (рис. 3). Популяция CD34+-клеток распределялась достаточно равномерно между суспензионной и адгезионной фракциями, при этом в суспензионной фракции пуповинной крови наблюдалось небольшое преобладание данных клеток (в 1,3 ± 0,2 раза; p = 0,008; n = 5). При экспансии периферической крови наблюдали статистически незначимое преобладание CD34+-клеток в адгезионной фракции (в 1,2 ± 0,1 раза;p > 0,05; n = 3).
Функциональный колониеобразующий тест выявил субпопуляции уни- и олигопотентных предшественников эритроидного, моноцитарного и гра-нулоцитарного ростков кроветворения как до, так и после сокультивирования ГСК и МСК КМ. Увеличение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) было соизмеримым с увеличением ЯСК и СD34+-клеток (см. рис. 3). Известно, что содержание в трансплантате КОЕ лучше коррелирует с приживлением нейтрофильного и тромбоцитарного ростков кроветворения, а также с общей посттрансплантационной выживаемостью больных, чем содержание
80 -,
60 -
и CD45-маркеров на клетках пуповинной и периферической крови до и после
л
S
о
X
s
а
40 -
20 -
т
ЯСК
I Пуповиннаякровь
CD34*
КОЕ
Периферическая кровь
Рис. 3. Кратность увеличения ядросодержащих клеток, CD34+-клеток и КОЕ при экспансии CD34+-клеток пуповинной (n = 6) и периферической (n = 8) крови. ЯСК - ядросодержащие клетки.
CD34+-клеток [9]. В наших исследованиях наибольшая часть КОЕ была выявлена в суспензионной фракции как в случае экспансии клеток пуповинной (в 1,4 ± 0,3 раза; p = 0,04; n = 5), так и периферической крови (в 2,2 ± 1,5 раза; р = 0,01; n = 5).
Анализ соотношения КОЕ эритроцитов, гра-нулоцитов и макрофагов пуповинной крови не выявил статистически значимого смещения суб-популяционного состава эритроидного и суммарного гранулоцитарно-моноцитарного ростков кроветворения после экспансии. Однако наблюдалось более чем двукратное увеличение доли унипотент-ных макрофагальных колоний (n = 8; p = 0,005; рис. 4). Также после экспансии ГСК пуповинной крови происходило незначительное, но статистически значимое уменьшение доли олигопотентных предшественников гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов и мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ) с 23 ± 14 до 18 ± 10 (n = 8; p = 0,02). Олигопотентные неком-митированные предшественники миелоидного ряда являются популяцией клеток, наиболее близкой к ре-популирующим КМ ГСК. Высокое исходное содержание колониеобразующих единиц гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов и мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ) является одним из факторов успешного восстановления кроветворения после высокодозной
КОЕ пуповинной крови
До экспансии
После экспансии
КОЕ-Э
КОЕ-Г 28±7
Рис. 4. Субпопуляционный состав гемопоэтических предшественников пуповинной крови до и после экспансии с МСК КМ (n = 8).
Представлено процентное содержание колониеобразующих и бурст-образующих единиц эритроцитов (КОЕ-Э, БОЕ-Э), гранулоцитов (КОЕ-Г), макрофагов (КОЕ-М), бипотентных единиц гранулоцитов-макрофагов (КОЕ-ГМ) и олигопотентных предшественников гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов и мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ).
КОЕ периферической крови
До экспансии
КОЕ-ГЭММ 8±5
После экспансии
КОЕ-ГЭММ 8±5
КОЕ-ГМ 8±5
КОЕ-М 10±7
КОЕ костного мозга
КОЕ-ГЭММ 8±4
КОЕ-ГМ 9±6
КОЕ-М 9±4
КОЕ-Г
49±13 _
КОЕ-Г КОЕ-Г
42±12 38±11
Рис. 5. Субпопуляционный состав гемопоэтических предшественников периферической крови и КМ до и после экспансии с МСК КМ (п = 8).
химиотерапии [10]. После экспансии их количество увеличивалось в 28 ± 13 раз для клеток пуповинной (п = 8) и в 4,8 ± 0,4 раза для периферической (п = 8) крови.
При исследовании с помощью КОЕ-теста субпо-пуляционного состава миелоидных предшественников периферической крови выявилось его отличие от соответствующего распределения в обогащенной CD34+-клетками популяции КМ (рис. 5) за счет уменьшения доли коммитированных предшественников макрофагов и бипотентных предшественников гранулоцитарно-моноцитарного ряда. После сокуль-тивирования с МСК КМ соотношение субпопуляций КОЕ приближалось к исходному костно-мозговому распределению.
В целом на 6-й день экспансии около 24 ± 20% CD34+-клеток пуповинной (п = 5) и 27 ± 23% периферической (п = 4) крови и около 16 ± 5% (п = 5) и 23 ± 11% (п = 4) соответствующих КОЕ оставались ассоциированными с клетками МСК КМ. Полученные данные свидетельствуют о сохранении экспрессии молекул адгезии значительной частью ге-мопоэтических предшественников как пуповинной, так и периферической крови в культуре. Молекулы адгезии играют важную роль при хоуминге ГСК после трансплантации [11], и есть основание полагать, что ассоциированная с МСК КМ фракция гемопоэ-тических клеток может иметь важное значение для успешного приживления трансплантата. Соотношение субпопуляций гемопоэтических предшественников, ассоциированных с МСК КМ на момент завершения экспансии, не имело статистически значимых различий с аналогичным распределением в суспензионной фракции клеток (данные не представлены).
Немаловажным аспектом в ходе определения оптимальных условий сокультивирования является
оценка апоптотических процессов в клетках на момент их подготовки к трансплантации [12]. После сокультивирования содержание клеток как в раннем (Апп-5+ 7AAD-), так и в позднем (Апп-5+ 7AAD+) апоптозе увеличивалось незначительно и в среднем не превышало 2% независимо от источника гемопоэтических клеток (см. таблицу). Доля апоптотиче-ских МСК КМ после сокультивирования в среднем была выше, однако такое увеличение не является критичным и открывает возможность использования адгезивной популяции ГСК совместно с открепленными МСК КМ больного для трансплантации. Более высокий процент апоптотических МСК КМ после экспансии обусловлен использованием специализированной для культивирования гемопоэтиче-ских клеток бессывороточной среды, тогда как МСК требуют использования сред с низким содержанием глюкозы и добавлением факторов сыворотки крови.
Таким образом, метод 6-дневной экспансии ГСК в условиях совместной культуры с МСК КМ в отсутствии телячьей эмбриональной сыворотки позволяет достичь значительного прироста CD34+ кроветворных клеток и колониеобразующих предшественников как пуповинной, так и периферической крови. Аналогичные приросты за столь короткий период времени в присутствии сыворотки ксеноген-ного происхождения обычно не достигаются [3, 4]. Кроме того, за этот период времени не происходит существенного смещения субпопуляционного состава гемопоэтических предшественников, несмотря на значительные различия в приросте клеточной массы пуповинной и периферической крови. Доля би- или олигопотентных предшественников миело-идного ряда если и уменьшается, то незначительно. Сходство исследованных характеристик гемопоэти-ческих клеток пуповинной и периферической крови
Показатели раннего (Лпп-5+ 7ЛЛЭ-) и позднего (Лпп-5+ 7ЛЛЭ+) апоптоза в популяциях гемопоэтических и мезенхимных клеток
до и после экспансии
Анализируемые клетки Пуповинная кровь (п = 3) Периферическая кровь (п = 3)
Апп-5+ 7ЛЛБ-, % Апп-5+ 7ААБ+, % Апп-5+ 7ААБ", % Апп-5+ 7ААБ+, %
Сепарированные гемопоэтические клетки до экспансии 0,6 ± 0,2 0,9 ± 1,1 1,76 ± 0,01 0,08 ± 0,05
Гемопоэтические клетки после экспансии 1,8 ± 0,8 0,5 ± 0,4 1,3 ± 0,3 0,7 ± 0,1
МСК КМ после совместной культуры 4,1 ± 3,4 4,0 ± 2,8 1,8 ± 0,9 3,0 ± 0,1
после экспансии указывает на определяющее влияние условий культивирования, тогда как их проли-феративный потенциал зависит от источника клеток. Сохранение высокого удельного содержания ассоциированных со стромальным подслоем СD34+ и колониеобразующих гемопоэтических клеток при высоком их общем приросте отличает данный метод экспансии от аналогов, описанных ранее [3, 4, 7]. Высокая жизнеспособность культур как гемопоэти-ческой, так и стромальной составляющей позволяет рекомендовать использовать для трансплантации не только суспензионную, но и ассоциированную со стромой фракцию гемопоэтических клеток после экспансии ex vivo. Для трансляции метода в клиническую практику необходимы дальнейшие исследования по репопуляции КМ полученной композицией клеток на модели иммунодефицитных мышей.
Коллектив авторов выражает благодарность за предоставленные для исследований образцы КМ, лейкоцитарного концентрата и пуповинной крови заведующему отделением анестезиологии и реанимации №3 УЗ 9-я городская клиническая больница г. Минска Александру Евгеньевичу Оводку и заведующему родильным отделением ГУ РНПЦ «Мать и дитя» Наталье Георгиевне Литвинович.
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]
1. Aljitawi O.S. Ex vivo expansion of umbilical cord blood: where are we? Int. J. Hematol. 2012; 95(4): 371-9. doi: 10.1007/ s12185-012-1053-6.
2. Delaney C., Heimfeld S., Brashem-Stein C., Voorhies H., Manger R.L., Bernstein I.D. Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution. Nat. Med. 2010; 16(2): 232-6. doi: 10.1038/nm.2080.
3. de Lima M., McNiece I., Robinson S.N., Munsell M., Eapen M., Horowitz M., et al. Cord-blood engraftment with ex vivo mesen-chymal-cell coculture. N. Engl. J. Med. 2012; 367(24): 2305-15. doi: 10.1056/NEJMoa1207285.
4. Robinson S.N., Ng J., Niu T., Yang H., McMannis J.D.,
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 616-006.441.04-06:616.419]-07
Karandish S., et al. Superior ex vivo cord blood expansion following co-culture with bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Bone Marrow Transplant. 2006; 37(4): 359-66.
5. Jing D., Fonseca A.V., Alakel N., Fierro F.A., Muller K., Born-hauser M., et al. Hematopoietic stem cells in co-culture with mesenchymal stromal cells - modeling the niche compartments in vitro. Haematologica. 2010; 95(4): 542-50. doi: 10.3324/hae-matol.2009.010736.
6. Петёвка Н.В., Гончарова Н.В., Северин И.Н., Космачева С.М., Потапнев М.П. Пролиферация и дифференцировка предшественников миелоидного ростка кроветворения пуповинной крови человека при экспансии in vitro. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2012; 1: 40-8.
[Petyovka N.V., Goncharova N.V., Severin I.N., Kosmacheva S.M., Potapnev M.P. In vitro expansion and lineage commitment of the human umbilical cord blood myeloid progenitors. Kletochnaya transplantologiya i tkanevaya inzheneriya. 2012; 1: 40-8]. (in Russian)
7. Yamaguchi M., Hirayama F., Kanai M., Sato N., Fukazawa K., Yamashita K., et al. Serum-free coculture system for ex vivo expansion of human cord blood primitive progenitors and SCID mouse-reconstituting cells using human bone marrow primary stromal cells. Exp. Hematol. 2001; 29(2): 174-82.
8. Kosmacheva S.M., Seviaryn I.N., Goncharova N.V., Petyovka N.V., Potapnev M.P. Hepatogenic potential of human bone marrow and umbilical cord blood mesenchymal stem cells. Bull. Exp. Biol. Med. 2011; 151(1): 142-9.
9. Page K.M., Zhang L., Mendizabal A., Wease S., Carter S., Gentry T., et al. Total colony-forming units are a strong, independent predictor of neutrophil and platelet engraftment after unrelated umbilical cord blood transplantation: a single-center analysis of 435 cord blood transplants. Biol. Blood Marrow Transplant. 2011; 17(9): 1362-74. doi: 10.1016/j.bbmt.2011.01.011.
10. Arber C., Halter J., Stern M., Rovo A., Gratwohl A., Tichelli A. Graft source determines human hematopoietic progenitor distribution pattern within the CD34(+) compartment. Bone Marrow Transplant. 2010; 46(5): 650-8. doi: 10.1038/bmt.2010.193.
11. Wilson A., Trumpp A. Bone-marrow haematopoietic-stem-cell niches. Nat. Rev. Immunol. 2006; 6(2): 93-106.
12. Duggleby R.C., Querol S., Davy R.C., Fry L.J., Gibson D.A., Horton R.B., et al. Flow cytometry assessment of apoptotic CD34+ cells by annexin V labeling may improve prediction of cord blood potency for engraftment. Transfusion. 2012; 52(3): 549-59. doi: 10.1111/j.1537-2995.2011.03305x.
Поступила 20.10.14 Received 20.10.14
ДЕТЕКЦИЯ В-КЛЕТОЧНОЙ КЛОНАЛЬНОСТИ В КОСТНОМ МОЗГЕ ПРИ ДИФФУЗНОЙ В-КРУПНОКЛЕТОЧНОЙ ЛИМФОМЕ
Гаврилина О.А., Звонков Е.Е., Судариков А.Б., Никулина Е.Е., Сидорова Ю.В., Бидерман Б.В., Ковригина А.М., Троицкая В.В., Кравченко С.К., Габеева Н.Г., Куликов С.М., Паровичникова Е.Н.,
Савченко В.Г.
ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, 125167, Москва, Россия
Резюме. Поражение костного мозга при диффузной В-крупноклеточной лимфоме (В-ККЛ) является одним из факторов, определяющих неблагоприятный прогноз при применении как стандартной, так и различных режимов интенсифицированной терапии. Вовлечение костного мозга устанавливается при гистологическом исследовании трепанобиоптата. Имеются данные, что молекулярное исследование костного мозга при верификации диагноза позволяет выявить до 25% дополнительных случаев вовлечения костного мозга при диффузной В-ККЛ. Представлены результаты исследования В-клеточной клональности в костном мозге у 103 больных диффузной В-ККЛ, пролеченных по различным интенсифицированным программам. У 26 (25%) больных выявлена В-клеточная клональность в костном мозге. Гистологическое исследование трепанобиоптата подтвердило поражение костного мозга лимфомой только у 14 (54%) из 26 больных. При дополнительном иммуногистохимическом исследовании (окраска на CD20) подтверждено еще 6 случаев поражения костного мозга у пациентов, у которых была получена В-клеточная клональность. При выполнении многофакторного анализа только В-клеточная клональность в костном мозге являлась независимым предиктором плохого ответа в исследованной когорте пациентов. При медиане наблюдения 22 мес общая и безрецидивная выживаемость больных в груп-
