Влияние длительности сокультивирования клеток из пуповинной крови и стромально-васкулярной фракции жировой ткани на амплификацию гемопоэтических предшественников Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОСТИ СОКУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ИЗ ПУПОВИННОЙ КРОВИ И СТРОМАЛЬНО-ВАСКУЛЯРНОЙ ФРАКЦИИ ЖИРОВОЙ ТКАНИ НА АМПЛИФИКАЦИЮ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ

Е.Р. Андреева 1, И.В. Андрианова 12, А.Н. Горностаева 1, П.И. Бобылева 1, Е.Е. Балашова 23, Л.Б. Буравкова 1

1 Институт медико-биологических проблем РАН, Москва, Россия

2Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ РФ, Москва, Россия

3 ООО «КриоЦентр», Москва, Россия

The effects of co-culture duration of cord blood cells with adipose tissue-derived stromal cells on hematopoietic precursors> amplification

E.R. Andreeva 1, I.V. Andrianova 12, A.N. Gornostaeva 1, P.I. Bobyleva 1, E.E. Balashova 23, L.B. Buravkova 1 11nstitute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia

2 Institute of Experimental Cardiology, Cardiology Research Center, Moscow, Russia

3 Cord Blood Bank "CryoCenter," Moscow, Russia

Пуповинная кровь (ПК) представляет собой полноценный источник гемопоэтических стволовых и прогени-торных клеток (ГСПК), количество которых может быть дополнительно увеличено ex vivo . Оптимизация условий экспансии является необходимым этапом исследований in vitro . Ранее мы показали, что за счет прикрепления части ядросодержащих клеток из ПК к мультипотентным мезен-химальным стромальным клеткам (МСК) из жировой ткани и последующей экспансии прикрепившихся малодифферен-цированных клеток можно получить популяцию, обогащенную ГСПК. Цель настоящей работы — оптимизация предложенного протокола . После кратковременного (1—3 ч . ) и длительного (24—72 ч . ) со-культивирования ядросодержащих клеток ПК с МСК из жировой ткани все неприкрепившиеся клетки удаляли, а адгезировавшиеся ГСПК продолжали культивировать в течение 72 ч , что приводило к формированию новой популяции суспензионных клеток Определено количество прикрепившихся ГСПК на разных сроках со-культивирования, а также число ГСПК, КОЕ и доля Сй34+-клеток в популяции суспензионных ГСПК после 72 ч . экспансии адгезирован-ных ГСПК После 72 ч адгезии ядросодержащих клеток ПК число адгезированных Сй34+-клеток было максимальным и составляло более 70% от всех Сй34+-клеток в исходной популяции . По сравнению с исходными мононуклеарами ПК в результате экспансии в нашей модельной системе происходило увеличение количества примитивных CD34+ предшественников среди ГСПК в 4 раза, КОЕ — в 6 раз . Вне зависимости от времени адгезии исходных ядросодержащих клеток ПК, БОЕ-Э составляли 80-90% от всех КОЕ среди ГСПК. Таким образом, со-культивирование ядросодержащих клеток ПК с МСК из жировой ткани в течение 3 сут обеспечивает максимальную адгезию CD34+-клеток, которые при последующей амплификации дают популяцию, существенно обогащенную как недифференцированными, так и коммити-рованными гемопоэтическими предшественниками

Ключевые слова: пуповинная кровь, гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки, ex vivo экспансия, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, со-культура, селекция клеток, обогащение

Umbilical cord blood is considered as a valuable source of hematopoietic stem and progenitor cells (CB-HSPCs) . The number of latter may be significantly enriched with ex vivo expansion . Thus, the optimization of culture conditions is essential for in vitro manipulations . Recently we have demonstrated that CB-HSPCs may be separated from unmanipulated CB nucleated cells through the adhesion to adipose tissue-derived MSCs . Further coculture was resulted in raizing of new polulation of floating CB-HSPCs significantly ehriched in primitive progentors The goal of this study was to optimize above mentioned protocol To determine the optimal conditions for adhesion and multiplication of CB-HSPCs, nucleated CB cells were co-cultured on adipose-tissue MSC layer for short (1-3 hours) and long-term (2472 hours) duration . Unattached cells were removed, adherent CB-HSPCs were further cultured for 72 hours, resulted in formation of floating population of CB-HSPCs . in each time point the number of attached CB-HSPCs, newly formed floating CB-HSPCs, CD34+ cells and CFUs among latter was examined . After 72 hours of nucleated CB cells co-culture, the number of adherent CD34+ cells peaked and was over than 70% of total CD34+ cells among nucleated CB cell samples Proposed experimental design has provided 4-fold enrichment of primitive CD34+ and 6-fold of CFUs number among newly formed HSPCs . BFU-Es comprised 80-90% of total CFUs regardless of time of nucleated CB cells co-culture . Thus, 3 days of nucleated CB cells/adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells co-culture provided peak of CD34+ cells' adhesion, amplification of latter resulted in rising of population maximally enriched both with undifferentiated and committed hematopoietic precursors

Keywords: cord blood, hematopoietic stem and progenitor cells, ex vivo expansion, mesenchymal stromal cells, co-culture, cell selection, enrichment .

Введение

Пуповинная кровь (ПК) в настоящее время рассматривается как полноценный источник гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (ГСПК) .

e-mail: andreeva_er@mail . ru

Важным преимуществом ПК, по сравнению с костным мозгом и мобилизованной периферической кровью, является возможность неинвазивного получения образцов в достаточно большом количестве и

использования клеток с меньшим соответствием по антигенам гистосовместимости с реципиентом (3—4 вместо 6 для костного мозга), что обеспечивает достаточную безопасность для реципиента в связи с более редкими случаями возникновения реакции «трансплантат против хозяина» [1—3]. ГСПК ПК успешно используются в детской онкогематологии и других областях медицины [4, 5]. Однако применение этих клеток для лечения взрослых пациентов ограничено недостаточным количеством ГСПК в одном образце ПК [6]. Решение данной проблемы путем объединения нескольких образцов ПК сопряжено с дополнительными рисками (антигенная несовместимость, контаминация патогенами и др ) Альтернативным вариантом, который привлекает все большее внимание исследователей, является использование ex vivo протоколов для увеличения количества ГСПК [7—9]. В связи с этим, подбор оптимальных условий получения ГСПК из ПК ex vivo является приоритетным направлением в этой области исследований

Судьба ГСПК ПК при культивировании зависит от ряда факторов, модификация которых может обеспечить их эффективную амплификацию . К таким модуляторам относятся «коктейли» экзогенных ге-мопоэтических цитокинов, подслой из стромальных клеток и предварительно выделенные с помощью иммуномагнитной сепарации примитивные CD34+ или CD133+ гемопоэтические предшественники [1, 4, 7, 9]. В настоящее время для ex vivo экспансии ГСПК ПК чаще всего используется обогащенная популяция CD34+-клеток [7, 10, 11], которые далее культивируются в монокультуре или в присутствии подслоя стромальных клеток . Обязательным компонентом среды культивирования являются экзогенные цитокины, индуцирующие гемопоэз [3]. Однако использование для экспансии только CD34+-клеток может искусственно обеднить спектр ГСПК, так как известно, что экспрессия этого антигена транзитор-на [12]. Ранее нами был предложен функциональный подход к обогащению популяции ГСПК ПК за счет их адгезии к мультипотентным мезенхималь-ным стромальным клеткам (МСК) из жировой ткани и последующей экспансии прикрепившихся мало-дифференцированных клеток [13]. Цель настоящей работы — оптимизация предложенного протокола . Для этого была проанализирована динамика адгезии клеток ПК к подслою стромальных клеток, охарактеризован фенотип и функциональная активность полученной после амплификации суспензионной популяции ГСПК ПК .

Материал и методы

Выделение мононуклеарной фракции ПК

Образцы ПК получали от обследованных здоровых рожениц после подписания добровольного информированного согласия в отделениях Научного центра акушерства, гинекологии и перинатоло-гии им . акад . В . И . Кулакова . После седиментации эритроцитов и удаления избытка плазмы фракцию ядросодержащих клеток ресуспендировали в аутогенной плазме с добавлением 10% диметилсуль-фоксида (Sigma, США) и 1% Декстрана-40 (Sigma, США), расфасовывали в криопробирки и подвергали программному замораживанию (CryoMed 7451, Thermo Fisher Scientific, США) до конечной температуры -90°С в соответствии со Стандартными опе-

рационными процедурами Банка стволовых клеток [14]. В день эксперимента клетки размораживали на водяной бане при +37°С и отмывали от крио-протектора в среде культивирования a-MEM (Gibco, США). После оценки жизнеспособности по окраске трипановым синим, концентрацию клеток доводили до 1,5—2,5х10в кл/мл и использовали в течение 30 мин . Анализ фенотипа размороженных монону-клеарных клеток (МНК) ПК проводили по методике, описанной ниже .

Выделение и культивирование МСК

Образцы жировой ткани после липосакции были получены в рамках Договора о научном сотрудничестве с многопрофильной клиникой «Союз» . Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие перед выполнением процедуры МСК выделяли из стромально-васкулярной фракции жировой ткани по стандартной методике [15] в модификации, описанной нами ранее [16], и культивировали постоянно при 5% О2 в мультигазовом инкубаторе (Sanyo, Япония) в среде a-MEM (Gibco, США) с добавлением 10% инактивированной фе-тальной бычьей сыворотки (Hyclone, США), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина (Панэко, Россия). По достижении 70—80% конфлу-ентности монослоя клетки пересевали. Для экспериментов использовали МСК 2—4 пассажей .

Совместное культивирование МСК

и МНК ПК

Перед началом экспериментов МСК обрабатывали митомицином в течение 24 ч . , затем рассева-ли с плотностью 70—80% монослоя в чашки Петри диаметром 60 мм (Corning, США) и культивировали 24 ч . до начала эксперимента, схема которого представлена на рис 1

Эксперимент состоял из двух этапов . На первом этапе получали и охарактеризовывали популяцию ГСПК, адгезированных из исходной фракции МНК ПК В чашки Петри с МСК, обработанными мито-мицином, добавляли суспензию ядросодержащих клеток ПК (2х106 кл/мл) и помещали в СО2 инкубатор (20% О2). Через определенные интервалы времени (1, 3, 24, 72 ч . ) все неприкрепившиеся клетки удаляли Часть образцов использовали для характеристики прикрепившихся клеток Количество и жизнеспособность адгезированных ГСПК определяли после одновременного окрашивания флуорес-цеин-диацетатом (FDA, Sigma, США) и йодидом про-пидия (Pi, invitrogen, США) в конечной концентрации 0,05 мкг/мл и 300 мкг/мл соответственно . Жизнеспособность клеток анализировали на флуоресцентном микроскопе Nikon Eclipse TiU (Nikon, Япония): живые и мертвые клетки различали по наличию зеленой (FDA, X = 470/515 нм) и красной

возб ./исп . ^

(Pi, Хвозб /исп = 535/590 нм) флуоресценций . В каждой культуре анализировали не менее 5 случайно выбранных полей зрения, площадью 0,14 мм2 каждое Для получения количественных данных по жизнеспособности и числу адгезированных ГСПК дальнейшую обработку изображений выполняли в программе NiS-elements (Nikon, Япония) . Феноти-пирование проводили после трипсинизации (0,05% трипсин-ЭДТА, Gibco, США) адгезированных ГСПК по методике, описанной ниже

Рис. 1. Анализ временной динамики адгезии ядросодержащих клеток ПК и последующей амплификации ГСПК ПК на подслое из МСК жировой ткани

На втором этапе эксперимента оценивали амплификацию и функциональную активность ГСПК. В оставшиеся образцы добавляли свежую среду и продолжали инкубировать в течение 72 ч . , в результате чего над монослоем МСК с прикрепившимися к нему на первом этапе ГСПК появлялись флотирующие клетки . Эта популяция могла формироваться как за счет пролиферации прикрепившихся ГСПК и их последующего открепления, так и за счет открепления исходных ГСПК . В суспензии вновь образовавшихся ГСПК анализировали общее число ГСПК, содержание КОЕ и Сй34+-кпеток .

Иммунофенотипирование ГСПК

Иммунофенотипирование ГПСК проводили в образцах исходных МНК ПК, ГСПК, адгезирован-ных через 72 ч . на первом этапе эксперимента и в популяции клеток, полученных при дальнейшем культивировании прикрепленных клеток на втором этапе эксперимента, с помощью проточной цитоме-трии (Accuri C6, Becton Dickinson, США) . Наиболее

N No

(О

1П_

< ? I

СО

еЧ

I г

■sf

00 □ „

О «о

Q6-UL 0,6% ■ ■ ч Q6-UR 15,7% ■ , / * Нг:

■ ■ -v .- ■ L Q6-LL 22,9% SEK " ioVr < Щ. ;■■-..■■ Q6-LR 60,7%

широко используемым маркером для недифференцированных гемопоэтических клеток является антиген CD34 [17], кроме того, эти клетки умеренно экспрессируют общий лейкоцитарный маркер CD45 (CD45dim) . На основе этих двух маркеров разработан протокол фенотипирования ГСПК методом проточной цитометрии iSHAGE (international Society of Hematotherapy and Graft Engineering) для оценки количества CD34+-кпеток в клинике [18]. Мы применили этот подход для идентификации ГСПК . В работе использовали меченные флуорохромами антитела к СD45 и СD34 (BD Pharmingen, США) в концентрации, рекомендованной изготовителем На рис. 2 приведена репрезентативная плот-диаграмма распределения клеток, несущих CD45-PerCP/CD34-APC антигены .

Выявление колониеобразующих единиц {КОЕ]

Наличие КОЕ оценивали по способности клеток образовывать колонии в полужидкой среде, содержащей коктейль цитокинов и факторов роста ГСПК (MethoCult H4034, STEMCELL Technologies, Канада) . Суспензию клеток вносили в среду из расчета 50х103 на чашку Петри диаметром 35 мм и культивировали в соответствии с инструкцией производителя. Количество и состав колоний оценивали через 14 сут Общее количество КОЕ определяли по формуле: N^p х общее количество ГСПК/(50х103).

10 10 10 CD45-FL-1-A

„7,2

Рис. 2. Репрезентативная плот-диаграмма распределения клеток, несущих С045-РегСР/Сй34-АРС антигены во вновь образованной суспензионной популяции ГСПК ПК через 72 ч . после удаления не прикрепившихся ядросодержащих клеток ПК из со-культуры с МСК ГСПК, несущие оба антигена, — в верхнем правом квадранте

Статистический анализ

Учитывая непараметрическое распределение количественных признаков, статистический анализ проводили с использованием U-критерия Манна-Уитни в «Microsoft Excel 2000» и «Statistica 7 . 0» . Различия считали статистически значимыми при р<0 . 05 .

Результаты

Фенотип и динамики прикрепления

недифференцированных гемопоэтических

предшественников

Криоконсервированные МНК ПК были разморожены и проанализированы на проточном ци-тофлуориметре для определения доли CD34+-недифференцированных гемопоэтических клеток . Доля клеток, несущих CD34 маркер, составила 1,3±0,4% .

Определение жизнеспособности и подсчет количества живых прикрепившихся клеток ПК проводили на первом этапе эксперимента сразу после удаления суспензии ядросодержащих клеток через 1, 3, 24 и 72 ч . со-культивирования (рис . 3).

Из рис . 3 видно, что основная часть ГСПК уже через 3 ч . прикреплялась к стромальному подслою . Увеличение времени со-культивирования клеток ПК и МСК не приводило к существенному увеличению числа адгезировавшихся клеток . Проведенный нами ранее морфологический анализ [13] показал, что большая часть клеток ПК, прикрепившихся к стро-мальному подслою, представляет собой гемопо-этические предшественники разной степени ком-митированности, т е те клетки, которые принято обозначать как ГСПК.

Через 72 ч . экспозиции был определен фенотип адгезированных ГСПК . Доля CD34+-клеток составила в среднем 63±19%, т . е . примерно 9,4х103 на 106 внесенных МНК ПК . Исходя из того, что исходная доля CD34+-кпеток была 1,3%, т . е . 13х103/10в, эффективность адгезии CD34+ клеток равнялась 72%

Амплификация и функциональная активность ГСПК после разных сроков адгезии (второй этап эксперимента]

После удаления суспензии ядросодержащих клеток ПК через определенные интервалы и со-культивирования оставшихся прикрепленных ГСПК с МСК в течение 72 ч . , над стромальным слоем образовывалась новая суспензия неприкрепленных ГСПК, которые были собраны, подсчитаны, определена их жизнеспособность, проанализирован фенотип и проведен функциональный тест на содержание колониеобразующих единиц (КОЕ). Количество вновь образованных ГСПК и число Сй34+-кпеток среди них линейно возрастало при увеличении времени адгезии (рис . 4А).

Во всех временных точках жизнеспособность ГСПК была высокой (>95%) . Число КОЕ также изменялось прямо пропорционально времени адгезии (рис . 4б), при этом соотношение разных типов гемопоэтических колоний оставалось неизменным с существенным преобладанием БОЕ-Э .

Таким образом, после кратковременного (1—3 ч . ) и длительного (24—72 ч . ) со-культивирования ядросодержащих клеток ПК с МСК из жировой ткани можно получить фракцию адгезированных ГСПК, которая при последующей экспансии в течение дополнительных 72 ч . образует адгезированную и суспензионную популяцию гемопоэтических предшественников . Количество ГСПК, доля среди них Сй34+-клеток и количество КОЕ во вновь образованной популяции ГСПК достигали максимальных значений после предварительной адгезии МНК ПК к МСК в течение 72 ч

Опираясь на полученные результаты, было рассчитано примерное количество примитивных и ком-митированных предшественников в одной дозе ПК, составляющей около 100 млн клеток . Сравнительные данные по числу различных предшественников в исходной популяции МНК ПК и амплифицирован-ных ГСПК приведены в таблице . По сравнению с исходными МНК ПК в результате экспансии в нашей модельной системе происходило увеличение количества примитивных Сй34+-предшественников среди ГСПК в среднем в 4 раза, а количество КОЕ — примерно в 6 раз, что свидетельствует об эффективности предложенной схемы амплификации ГСПК ПК с использованием стромального подслоя из МСК жировой ткани

Таблица. Сравнительная характеристика пкМНК и ГСПК

Рис 3. Динамика прикрепления и жизнеспособность ГСПК ПК в различных временных точках эксперимента . Данные представлены как среднее ± ошибка среднего . * — различия статистически значимы при сравнении со значением в точке 1 ч .

Параметр CD34+ КОЕ/103

Исходные МНК ПК 0,13х108 140 (108 клеток)

ГСПК из 108 МНК ПК 0,48х108 826

Кратность увеличения 3,7 7

Рис. 4. Амплификация ГСПК в со-культуре с МСК:

А — общее количество ГСПК ПК (кружки) и число Сй34 + -клеток (треугольники) во вновь образованной суспензии; Б — характеристика КОЕ среди вновь образованной популяции ГСПК; БОЕ-Э — эритроидные, КОЕ-ГМ — гранулоцитарно-моноцитарные; КОЕ-Г — гранулоцитарные, КОЕ-М — моноцитарные; * — различия статистически значимы при сравнении со значениями в точках 1—24 ч .

Обсуждение

Ex vivo экспансия ГСПК для обеспечения необходимого количества прогениторных клеток позволяет скомпенсировать их недостаток в исходных образцах ПК . Успех амплификации ГСПК ПК может зависеть от ряда параметров: предварительной селекции, экзогенных цитокинов, источника стро-мального подслоя, времени совместной экспозиции гемопоэтических клеток с клетками стромы и др В настоящей работе был использован предложенный нами ранее метод со-культивирования ГСПК ПК на подслое из МСК жировой ткани человека без добавления экзогенных цитокинов [12]. Оказалось, что при со-культивировании МНК ПК с МСК происходит быстрое прикрепление основной части способных к адгезии клеток-предшественниц, число которых при дальнейшем культивировании изменяется незначительно . Определение времени экспозиции суспензии исходных популяций (костный мозг, ПК, иммобилизованная периферическая кровь), содержащих незначительное количество гемопоэтических предшественников, со стромальным подслоем является важной составляющей процедуры амплификации . Уменьшение времени экспансии может быть важно с точки зрения клинической практики, но при этом необходимо получить максимально функциональную клеточную популяцию . Ранее в экспериментах с выделенными Сй34+-популяциями W. Wagner с соавт . (2007) обнаружили, что уже через 1 ч . к МСК из костного мозга и жировой ткани прикреплялось около 80% Сй34+-кпеток ПК и далее в течение 15 ч . большая часть этих клеток оставалась прикреп-

ленной [19]. Максимум адгезии через 2 ч . взаимодействия был выявлен при со-культивировании нефракционированных гемопоэтических клеток со стромой из костного мозга, после чего число ГСПК даже несколько снижалось [20]. Наши результаты показывают, что селекция ГСПК из исходной популяции МНК ПК за счет адгезии к стромальным клеткам происходит по такому же сценарию: ГСПК быстро прикрепляются в течение 3 ч . и далее их число практически не меняется . Таким образом, динамика адгезии малодифференцированных предшественников не зависит от того, была ли проведена их предварительная селекция .

Вопрос: что эффективнее использовать для экспансии, нефракционированную ПК или популяцию Сй34+-кпеток? — пока не решен окончательно [9] тем не менее, уже убедительно показано, что при внесении на стромальный подслой как нефрак-ционированной суспензии клеток костного мозга и (или) ПК, так и Сй34+-субпопуляции, прикрепляющаяся фракция гемопоэтических клеток обогащена недифференцированными предшественниками так, А . Е . ГптЬепдеп с соавт . (2001) сравнили эффективность приживления исходных ГСПК костного мозга мышей и ГСПК из суспензии костномозговых клеток, адгезировавшихся к Декстеровскому подслою . Оказалось, что прикрепленные ГСПК эффективнее обеспечивали поддержание кроветворения у летально облученных мышей (70% случаев) по сравнению с исходными клетками костного мозга . По мнению авторов, полученные данные указывают на то, что во фракции адгезированных ГСПК находятся две из

трех клеток, способных к приживлению [21]. В дальнейшем, в экспериментах с выделенными СР34+-клетками из костного мозга, ПК и периферической крови было продемонстрировано, что к стромально-му подслою из костномозговых МСК адгезируют преимущественно недифференцированные клетки с фенотипом Сй34+/Сй38- [18, 22, 23]. Пролиферация этих прикрепленных ГСПК обеспечивала появление новой суспензионной культуры, обогащенной гемо-поэтическими предшественниками разной степени коммитированности . Анализ фенотипа адгезирован-ных ГСПК после 72 ч . со-культивирования с МСК, выполненный в настоящей работе, показал, что более 60% этих клеток были СР34+ . Кроме того, после всех временных интервалов со-культивирования (1—72 ч . ) прикрепленные клетки продуцировали суспензионную популяцию, упомянутую выше При этом число ГСПК, вновь образуемых прикрепивши-

мися клетками, а также количество Сй34+-клеток и КОЕ в этой суспензии наиболее значимо увеличивалось после 72 ч . предварительной адгезии .

Таким образом, анализ динамики прикрепления малодифференцированных гемопоэтических предшественников к стромальному подслою и их последующей амплификации показал, что, несмотря на быстрое прикрепление, оптимальное время адгезии ГСПК из популяции ядросодержащих клеток ПК для последующей успешной амплификации должно составлять не менее 72 ч

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Президиума РАН «Фундаментальные исследования для разработки биомедицинских технологий».

ЛИТЕРАТУРА:

I. Broxmeyer H . Е . , Srour Е . F . , Hangoc G . et al . High-efficiency recovery of functional hematopoietic progenitor and stem cells from human cord blood cryopreserved for 15 years . PNAS USA 2003; 100(2): 645-50 .

2 . Gluckman Е . , Ruggeri A ., Rocha V . et al . Family-directed umbilical cord blood banking . Haematologica 2011; 96(11); 1700-7 .

3 . Andrade P .Z ., Santos F. D ., Cabral J . M . et al . Stem cell bioengineering strategies to widen the therapeutic applications of haematopoietic stem/progenitor cells from umbilical cord blood . J . Tissue Eng . Regen . Med . 2015; 9(9): 988-1003 .

4 . Дмитриева Р . И ., Анисимов С . В . Возможности экспансии гемопоэтических стволовых клеток in vitro . Цитология 2013; 55(1): 11-5 .

5 . Романов Ю .А ., Балашова Е . Е ., Быстрых О .А . и др . Пуповинная кровь для аутологичной трансфузии в раннем постнатальном периоде: анализ клеточного состава и жизнеспособности клеток при длительном хранении . Клеточные технологии в биологии и медицине 2014; 4: 207-11.

6 . Brunstein C . G ., Wagner J . E . Cord blood transplantation for adults . Vox Sanguinis 2006; 91: 195-205

7 . Hofmeister C . C . , Zhang J . , Knight K . L . et al . Ex vivo expansion of umbilical cord blood stem cells for transplantation: growing knowledge from the hematopoietic niche Bone Marrow Transplant 2007; 39(1): 11-23 .

8 . Уфимцева А. И ., Канов Е . В . Характеристика и ex vivo экспансия гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток пупо-винной крови Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012; 7(4): 21-7 .

9 . Шаманская Т. В . , Осипова Е . Ю . , Румянцев С .А. Ex vivo экспансия гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови Онко-гематология 2012; 7(1): 35-44 .

10 . Robinson S ., Niu T ., de Lima M . et al . Ex vivo expansion of umbilical cord blood Cytotherapy 2005; 7(3): 243-50

II. Петёвка Н . В ., Гончарова Н . В ., Северин И . Н . и др . Пролиферация и дифференцировка предшественников миелоидного ростка кроветворения пуповинной крови человека при экспансии in vitro . Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012; 7(1): 40-8 .

12 . Zanjani E . D ., Almeida-Porada G ., Livingston A. G . et al . Reversible expression of CD34 by adult human bone marrow long-term engrafting hematopoietic stem cells . Exp . Hematol . 2003; 31(5): 406-12 .

13 . Маслова Е . В ., Андреева Е . Р ., Андрианова И . В . и др . Обогащение мононуклеаров пуповинной крови гемопоэтическими клетками-предшественниками в совместной культуре с мезенхимальными стромальными клетками жировой ткани человека . Клеточные технологии в биологии и медицине 2013; 4: 238-43 .

14 . Romanov Y .A ., Tarakanov O . P ., Radaev S . M . et al . Human allogeneic AB0/Rh-identical umbilical cord blood cells in the treatment of juvenile patients with cerebral palsy . Cytotherapy 2015; 17(7): 969-78 .

15 . Zuk P .A., Zhu M ., Mizuno H . et al . Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies Tissue Eng . 2001; 7(2): 211-28 .

16 . Буравкова Л . Б ., Гринаковская О . С ., Андреева Е . Р . и др . Характеристика мезенхимных стромальных клеток из липоаспирата человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода Цитология 2009; 51(1): 5-11.

17 . Krause D . S ., Fackler M . J . , Civin C . I . et al . CD34: structure, biology, and clinical utility . Blood . 1996; 87(1): 1-13 .

18 . Sutherland D . R . , Anderson L ., Keeney M . et al . The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering J Hematother . 1996; 5(3): 213-26 .

19 . Wagner W., Wein F., Roderburg C . et al . Adhesion of hematopoietic progenitor cells to human mesenchymal stem cells as a model for cell-cell interaction . Exp . Hematol . 2007; 35(2): 314-25 .

20 Madhusudhan T , Richhariya A , Majumdar S S et al An in vitro model for grafting of hematopoietic stem cells predicts bone marrow reconstitution of myeloablative mice J Hematother Stem Cell Res . 2003; 12(2): 243-52 .

21. Frimberger A. E . , Stering A . I ., Quesenberry P . J . An in vitro model of hematopoietic stem cell homing demonstrates rapid homing and maintenance of engraftable stem cells . Blood 2001; 98(4): 1012-8 .

22 . Jing D ., Fonseca A .V ., Alakel N . et al . Hematopoietic stem cells in co-culture with mesenchymal stromal cells--modeling the niche compartments in vitro . Haematologica 2010; 95(6): 542-50 .

23 . da Silva C . L ., Gongalves R ., dos Santos F. et al . Dynamic cell-cell interactions between cord blood haematopoietic progenitors and the cellular niche are essential for the expansion of CD34+, CD34+CD38- and early lymphoid CD7+ cells . J . Tissue Eng . Regen . Med . 2010; 4(2): 149-58 .

Поступила: 26.10.2015