CC BY
120
ОБЗОРЫ
УДК 576.5
Экспансия гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток пуповинной крови ex vivo
Е. В. Сотнезова, Е. Р. Андреева, А. И. Григорьев, Л. Б. Буравкова*
Государственный научный центр Российской Федерации Институт медико-биологических
проблем РАН, 123007, Москва, Хорошевское шоссе, 76А
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 10.02.2016
Принята к печати 30.03.2016
РЕФЕРАТ В настоящее время трансплантация клеток пуповинной крови активно применяется в клинической практике, однако существенным ее недостатком является ограниченное количество гемопоэтических стволовых клеток и длительное время восстановления пациентов после трансплантации. Увеличить количество гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток пуповинной крови можно путем экспансии ex vivo с использованием различных комбинаций цитокинов. Кроме этого, существуют методические подходы, обеспечивающие амплификацию клеток пуповинной крови ex vivo при взаимодействии с естественными для гемопоэтических клеток факторами микроокружения, в том числе со стромальным компонентом и тканевым содержанием кислорода. Развитие молекулярно-генетических методов анализа привело к расширению представлений о механизмах, опосредующих функционирование гемопоэтической ниши, что позволило разработать новые технологические приемы амплификации клеток пуповинной крови. С помощью таких подходов улучшен ряд важных клинических показателей восстановления кроветворения. Хорошие результаты получены при повышении эффективности трансплантации пуповинной крови путем создания оптимальных условий для хоминга и приживления клеток в костном мозге реципиента. В настоящем обзоре рассмотрены современные методические подходы, направленные на повышение эффективности применения гемопоэтических клеток пуповинной крови.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА гемопоэтические стволовые клетки, пуповинная кровь, экспансия клеток ex vivo. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ГСПК - гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки; МСК - ме-зенхимальные стромальные клетки; КОЕ - колониеобразующие единицы; ПК - пуповинная кровь; G-CSF - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; IL - интерлейкин; TGF-P - трансформирующий фактор роста; dmPGE2 -16,16-диметилпростагландин Е2; SDF-1 - фактор стромальных клеток 1; CXCR4 - CXC-рецептор хемокинов типа 4; C3a - фрагмент системы комплемента 3а.
ВВЕДЕНИЕ
В конце прошлого века пуповинная кровь (ПК) привлекла большой интерес ученых и врачей-транс-фузиологов в связи с успешным использованием в качестве альтернативы гемопоэтическим клеткам костного мозга. В настоящее время ПК применяется не только для гематологических трансплантаций. Перечень заболеваний и патологий, при которых возможно использование ПК, с каждым годом увеличивается. Следует отметить, что ПК содержит клетки крови различной степени зрелости, включая дифференцированные форменные элементы и гемопоэти-ческие стволовые и прогениторные клетки (ГСПК), а также другие типы клеток, в том числе недифференцированные соматические стволовые клетки [1 —
5], мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) [6-9] и эндотелиальные прогениторные клетки [10].
Если рассматривать пуповинную кровь в качестве трансплантата кроветворной ткани, то бесспорным ее преимуществом является неинвазивный способ получения, доступность, безопасность для донора и меньшая по сравнению с костным мозгом или мобилизованной периферической кровью частота и тяжесть развития реакции «трансплантат против хозяина» [11-13]. Однако из-за небольшого содержания ГСПК ПК имеет и недостатки, связанные с медленным восстановлением кроветворения и иммунитета. ПК существенно отличается от костного мозга или мобилизованной периферической крови количе-
ством, составом и свойствами гемопоэтических клеток. ГСПК пуповинной крови, в отличие от костномозговых, находятся вне клеточного цикла, однако достаточно быстро дают сильный пролиферативный ответ на стимуляцию ростовыми факторами [14-17]. Способность ГСПК ПК к экспансии ex vivo в ответ на стимуляцию легла в основу разработки различных подходов к увеличению содержания кроветворных клеток в трансплантатах ПК.
Существуют две основные стратегии увеличения количества гемопоэтических клеток после выделения мононуклеарной фракции из ПК: одна из них основана на экспансии коммитированных гемопоэти-ческих предшественников, а другая - на увеличении количества клеток с большим пролиферативным потенциалом - ГСПК [18]. В первом случае использование коммитированных клеток позволяет сократить период восстановления кроветворения после трансплантации, а во втором - пропадает необходимость введения дополнительной единицы ПК. Так, если использовать для трансплантации мононуклеарные клетки пуповинной крови после ex vivo наращивания коммитированных предшественников, то для долгосрочного восстановления кроветворения после аплазии костного мозга пациентам необходимо вводить дополнительную единицу ПК, не подвергшуюся каким-либо манипуляциям и содержащую ГСПК. Если в ходе ex vivo экспансии получены клетки, обладающие большим пролиферативным потенциалом и способные длительно поддерживать кроветворение (long-term repopulating cells), то дальнейшие манипуляции позволят получить как малодифференциро-ванные клетки, так и коммитированные, что сможет гарантировать краткосрочное и длительное восстановление кроветворения после трансплантации. Такой подход позволит избежать введения дополнительной единицы ПК. Стоит отметить, что, помимо описанных, существуют другие стратегии повышения эффективности ПК, направленные не на экспансию, а на обеспечение действенного хоминга и приживления трансплантируемых клеток [19-25].
ОСНОВНЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ЭКСПАНСИИ ГСПК ПУПОВИННОЙ КРОВИ ex vivo
При создании эффективных и контролируемых методических подходов, обеспечивающих получение большого количества ГСПК, основное внимание направлено на подбор компонентов ростовых сред и методов выделения малодифференцированных клеток. Между тем в большинстве существующих моделей культивирования ГСПК из ПК недооцененной остается роль локального микроокружения: взаимодействий со стромальными элементами, паракринной регуляции и концентрации кислорода (рис. 1).
Экспансия ex vivo
Сокультура со стромальными клетками
Рис. 1. Методические подходы к экспансии клеток пуповинной крови ex vivo
Использование обогащенной фракции ПК
Выбор между использованием нефракционирован-ного образца кроветворной ткани или проведением селекции - первая задача при подборе подхода к экспансии клеток пуповинной крови. Селекция проводится с помощью моноклональных антител к специфическим маркерам с магнитными или флуоресцентными метками. Возможна положительная селекция, когда из исходно гетерогенного материала выделяют определенные типы клеток, либо отрицательная, при которой происходит удаление нежелательных клеток непосредственно из суспензии. Показано, что с использованием обогащенной гемо-поэтическими клетками фракции удается добиться лучшего результата при экспансии in vitro [26].
Наиболее распространенные маркеры для позитивной селекции гемопоэтических стволовых клеток - CD34 и CD133, однако при их использовании из экспансии исключаются клетки, негативные по данным антигенам, но обладающие свойствами стволовых [27]. Присутствие тех или иных поверхностных маркеров не свидетельствует о физиологических особенностях клетки, будь то способность к самообновлению, пролиферации или дифферен-
цировке. Кроме того, экспрессия фенотипа не всегда может быть устойчивой. Так, Summers и соавт. показано, что популяция CD34-Lm--клеток пуповинной крови генерирует CD34+-TCnK при культивировании с использованием стромальных клеток костного мозга мышей [28]. В данном подходе есть и другие недостатки: требуется большое количество исходных клеток, в процессе выделения часть гемопоэтиче-ских клеток теряется [29]. Отказ от предварительной процедуры иммуносепарации позволяет избежать возможного повреждения клеток при проведении большого количества лабораторных манипуляций (центрифугирование, ресуспендирование и др.), а также изменения функционального состояния клеток, опосредованного связыванием антител с поверхностными молекулами [30].
В настоящее время опубликованы работы, в которых для экспансии ГСПК используют нефракцио-нированную ПК [31-33]. В то же время разработаны подходы, в которых часть одной единицы пуповинной крови вводят реципиенту без какой-либо обработки, а другую часть используют для экспансии с предварительным обогащением (CD34+ или CD133+ селекция). Таким образом, трансплантат сохраняет свой иммунологический потенциал, что увеличивает его приживление и иммунологическое восстановление [34, 35].
Растворимые компоненты систем культивирования
Традиционным компонентом для культивирования большинства типов клеток человека, включая ГСПК, является фетальная телячья сыворотка (ФТС), содержащая природный коктейль факторов роста, медиаторов адгезии, минеральных веществ, липи-дов и гормонов. Однозначного мнения о возможности клинического применения клеток после их экспансии с использованием ФТС не существует. К недостаткам сыворотки можно отнести трудность стандартизации состава, возможность вирусной контаминации, а также высокий риск иммунизации реципиента чужеродными белками [36, 37]. В этой связи некоторые исследователи отказываются от ФТС в пользу ци-токиновых коктейлей [26, 38]. Тем не менее следует учитывать, что в сыворотке присутствуют минорные компоненты, действие которых до сих пор не идентифицировано и не может быть полностью скомпенсировано бессывороточными средами.
В настоящее время известно большое количество растворимых факторов, влияющих на пролиферацию и дифференцировку ГСПК. Различные их комбинации могут определять сроки и степень экспансии культивируемых клеток. Клетки ПК так же, как клетки периферической крови, синтезируют цитокины. В частности, Т-клетки, ЕК-клетки и ма-
крофаги ПК продуцируют гранулоцитарный коло-ниестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоци-тарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор, интерлейкины 2, 3 и 4 (IL-2, -3, -4), трансформирующий фактор роста (TGF-ß), интерферон-у [39-41]. Однако количество синтезируемого медиатора, его биологическая активность и количество продуцирующих клеток в ПК значительно меньше, чем в периферической крови.
Несмотря на обилие рекомбинантных цитокинов, применяемых для экспансии малодифференциро-ванных гемопоэтических предшественников, оптимальной комбинации, утвержденной для использования в клинической практике, пока не существует. Наиболее часто используются фактор стволовых клеток (SCF), IL-3 и -6, G-CSF, тромбопоэтин (TPO) и лиганд Flt-3 [42, 43].
Следует отметить, что важен не только выбор факторов, но также их концентрация и последовательность применения. Так, использование (в течение первых 3 дней) цитокинов SCF, IL-3, Flt-3, TPO и среды, содержащей 4% фетальной телячьей сыворотки для культивирования ГСПК, с последующим переводом клеток на среду, содержащую 20% фетальной телячьей сыворотки и макрофагальный колониестимулирующий фактор, Flt-3, IL-3, SCF, способствует экспансии CD34+ клеток [43]. Факторы роста SCF, Flt-3, IL-11, IL-3, IL-6, GM-CSF отвечают за пролиферацию клеток, в то время как макрофа-гальный колониестимулирующий фактор, G-CSF, эритропоэтин (EPO) и TPO отвечают за дифференцировку и созревание клеток. Цитокины SCF, IL-3 и IL-6 действуют в фазе G0/G1 клеточного цикла и, работая вместе, индуцируют митоз [44].
Тем не менее для экспансии гемопоэтических клеток применяют и другие комбинации цитокинов. Haylock и соавт. показали, что при использовании сочетания IL-lß, IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF и SCF степень экспансии выше, чем при использовании комбинаций, в которых не хватает какого-либо из этих шести цитокинов [45].
Стоит отметить, что существуют факторы, присутствие которых в среде культивирования уменьшает степень экспансии гемопоэтических клеток. Показано, что IL-8, тромбоцитарный фактор-4, индуцируемый IFN-y белок и моноцитарный хемотак-сический фактор-1 in vitro снижают пролиферацию колониеобразующих единиц гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов и мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ), гранулоцитов и моноцитов (КОЕ-ГМ) и бурстобразу-ющих единиц эритроцитов (БОЕ-Э), стимулированных ростовыми факторами [46, 47], а макрофагальный белок воспаления а подавляет пролиферацию
стволовых клеток мышей, соответствующих КОЕ-С 12 (колониеобразующие единицы селезенки, дающие начало гранулоцитарным, моноцитарным, эритро-идным, мегакариоцитарным и лимфоидным колониям на 12-е сутки после трансплантации облученным животным), и более ранних клеток КОЕ-Бл (клетки, образующие в культуре колонии бластных клеток) у мышей в системе ex vivo [48].
При культивировании с использованием только растворимых факторов гемопоэтические клетки лишаются поддерживающего влияния микроокружения: межклеточных взаимодействий с негемопоэти-ческими клетками, компонентов тканевого матрикса и паракринных медиаторов. С другой стороны, добавление в среду экзогенных цитокинов при использовании фидерных клеток, продуцирующих SCF и IL-6, а также многие другие паракринные факторы, способствует поддержанию гемопоэтических предшественников, но не является строго обязательным.
МОДЕЛИРОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ ДЛЯ ЭКСПАНСИИ ГСПК ПК
ex vivo
Справедливости ради стоит сказать, что первые этапы изучения гемопоэтических стволовых клеток взрослого организма были связаны с созданием естественного микроокружения [49, 50]. Так, начальные попытки культивирования суспензионных гемопо-этических культур показывали быстрое угасание гемопоэза и замещение гемопоэтических клеток макрофагами. Использование системы культивирования, содержащей подложку из клеток костного мозга, позволило получить культуру, содержащую кроветворные предшественники, обладающие свойствами гемопоэтических стволовых клеток интактного костного мозга [49]. Дальнейшие исследования были направлены на создание различных модификаций и усовершенствований данной системы культивирования.
Сокультивирование со стромальными клетками
Сокультивирование со стромальными фидерными клетками представляет собой более физиологичную альтернативу использованию рекомбинантных ци-токинов, которое применялось с самого начала изучения костномозговых гемопоэтических клеток [49]. В настоящее время активно проводится поиск новых линий клеток, поддерживающих экспансию in vitro ГСПК при сокультивировании [51]. Совместное культивирование гемопоэтических предшественников с различными типами клеток, проявляющих фидерные свойства по отношению к ним, не только применимо для экспансии малодифференцирован-ных предшественников в целях их клинического ис-
пользования, но также позволяет исследовать взаимоотношения клеток в пределах кроветворной ниши.
Традиционным и наиболее практичным подходом является использование мезенхимальных стромаль-ных клеток в качестве фидерного подслоя для экспансии ГСПК in vitro [52-59]. Помимо того, что МСК проявляют фидерные свойства по отношению к ге-мопоэтическим клеткам, они обладают высокой про-лиферативной активностью, а также более доступны, чем иные типы фидерных клеток человека (например, дуктальные эпителиоциты или спленоциты) [60]. Показано, что стромальные клетки костного мозга в Dexter-культурах могут поддерживать кроветворение in vitro более 6 месяцев [49]. Некоторые исследователи используют МСК после направленной дифференцировки в остеобласты, создавая таким образом подобие эндостальной ниши [61].
МСК и более дифференцированные стромальные клетки секретируют различные цитокины [62-64]. Практически все данные о продукции цитокинов МСК человека получены на культуре клеток, поэтому о том, как каждый цитокин вовлечен в пара-кринную регуляцию in vivo, с уверенностью сказать нельзя. Тем не менее показано, что МСК продуцируют большое количество цитокинов, поддерживающих ГСПК в состоянии покоя или способствующих их самообновлению, в частности SCF, фактор, ингибирую-щий лейкозные клетки, фактор стромальных клеток 1 (SDF-1), онкостатин М, морфогенетический белок кости-4, лиганд Flt-3, TGF-P, IL-1, -6, -7, -8, -11, -12, -14, -15 [62, 63]. Кроме того, при добавлении в среду культивирования IL-1a МСК могут продуцировать такие факторы роста, как GM-CSF и G-CSF, влияющие на более зрелые гемопоэтические предшественники, что свидетельствует о взаимной регуляции МСК и гемопоэтических клеток [65-67].
Исследователи, моделируя in vitro условия костномозговой ниши, используют МСК из различных источников [52, 54, 68]. Наиболее часто используемыми и поэтому хорошо охарактеризованными являются МСК из костного мозга. МСК получены также из стенки сосудов, синовиальной мембраны, плаценты, пуповинной крови, субэндотелиального слоя пупочной вены. Между МСК из различных источников существуют некоторые отличия, касающиеся экспрессии ряда маркеров, способности к пролиферации и дифференцировке, но в целом их характеристики сходны [69-72]. Известно, что МСК из стромально-ва-скулярной фракции жировой ткани человека способны поддерживать гемопоэз in vitro [53, 73]. Поэтому они представляют хорошую альтернативу МСК из костного мозга и легкодоступный источник фидерных клеток для экспансии ГСПК ПК с целью широкомасштабного клинического использования [74].
McNiece и соавт. разработали протокол культивирования ГСПК, согласно которому 14-дневная экспансия клеток ПК обеспечивается совместным их культивированием с МСК из костного мозга в присутствии гемопоэтических цитокинов в течение 7 дней, а также культивированием в течение 7 дней в присутствии только цитокинов [52]. С помощью данной методики удалось существенно сократить время восстановления нейтрофилов и тромбоцитов после трансплантации двух единиц ПК, одна из которых была обогащена ГСПК с использованием описанного протокола. Таким образом, применение фидерных слоев для экспансии ГСПК ПК позволяет ограничить использование экзогенных факторов роста без снижения эффективности амплификации клеток.
Тканевое содержание кислорода
Содержание кислорода - один из основных неклеточных факторов кроветворного микроокружения, участвующих в регуляции развития гемопоэтиче-ских клеток. В костном мозге содержание кислорода варьирует от 1 до 6%, при этом в области гипоксии находятся покоящиеся ГСПК, тогда как в местах с более высоким содержанием кислорода - проли-ферирующие ГСПК [75]. Низкое парциальное давление кислорода играет важную роль в поддержании тех или иных физиологических свойств гемопоэти-ческих клеток, что существенно при изучении взаимодействия гемопоэтических и стромальных клеток in vitro, а также должно обязательно учитываться при разработке протоколов амплификации клеток ПК [76, 77].
Известно, что пониженное содержание кислорода оказывает значительное влияние на гемопоэти-ческие клетки in vitro, их способность к колоние-образованию, устойчивость к облучению и потенциал к восстановлению гемопоэза у летально облученных животных [75, 78]. Кроме того, низкое парциальное давление кислорода способствует преимущественному поддержанию жизнеспособности и пролиферации малодифференцированных гемопоэтических клеток по сравнению с коммитированными предшественниками [78, 79].
Интересно, что варьирование содержания кислорода в сочетании с различными комбинациями цитокинов позволяет амплифицировать клетки ПК с различными свойствами. Так, группой исследователей под руководством Ivanovic было показано, что при 3% кислорода в присутствии SCF, G-CSF, TPO и IL-3 обеспечивается одновременно поддержание примитивных гемопоэтических клеток, способных восстанавливать кроветворение у облученных животных при трансплантации, и экспансию комми-тированных предшественников (КОЕ) [80]. Показано
также, что культивирование обогащенной CD133+ клетками фракции ПК с добавлением рекомбинант-ных цитокинов SCF, Flt-3, TPO, IL-6, IL-3 в присутствии 5% кислорода позволяет увеличить количество CD34+CD38- клеток почти в 27 раз (независимо от присутствия сыворотки в среде), что значительно (P < 0.01) выше, чем при стандартном содержании кислорода [81]. Среди клеток, амплифицирован-ных в условиях пониженного содержания кислорода, было больше КОЕ с миелоидным потенциалом, а также выше способность к восстановлению гемо-поэза при трансплантации облученным животным. Показано, что пониженное содержание кислорода индуцирует в гемопоэтических клетках экспрессию генов HIF-1a, VEGF и ABCG2, а также активирует экспрессию CXC рецептора хемокинов 4 (CXCR4) [82].
В работе Tursky и соавт. культивирование клеток ПК при 10% кислорода с добавлением цитокинов (TPO, SCF, Flt-3 лиганда и IL-6) приводило к большей экспансии ГСПК, чем при использовании наиболее распространенного протокола культивирования клеток ПК (20% кислорода, TPO, SCF и G-CSF) [42].
C зависимостью от содержания кислорода связана одна важная особенность гемопоэтических клеток - занимать определенные «ниши» при совместном культивировании со стромальными клетками. Еще в 1977 году в работах Dexter и соавт. было описано распределение гемопоэтических клеток в таких сокультурах: часть гемопоэтических предшественников находится в суспензии над подслоем, часть ад-гезирует к поверхности подслоя, а некоторые клетки мигрируют в субстромальное пространство (рис. 2А) [49]. При длительном сокультивировании образуются участки активной пролиферации гемопоэтических клеток (так называемых областей «булыжной мостовой»), которые обнаруживаются с помощью фазо-во-контрастной микроскопии и визуально представляют плотные скопления клеток, располагающиеся под слоем МСК (рис. 2Б) [82].
Пространственная организация гемопоэтических клеток в совместной культуре сопоставима с их распределением в костном мозге: клетки в зависимости от состояния покоя/активной пролиферации располагаются в областях с различным содержанием кислорода и доступностью питательных веществ. Так, фракция клеток, адгезирующих на поверхность МСК, содержала наибольшую долю активно пролиферирующих клеток. По сравнению с другими фракциями гемопоэтических предшественников в сокультуре клетки, мигрировавшие под стромаль-ный монослой, делятся редко и сохраняют незрелый фенотип CD34+CD38- [83]. Учитывая особенность ге-мопоэтических клеток занимать определенное по-
А
Суспензионные
- * * *«°' i • ' « 'i. » ■ .M ( ГСПК — — ■
ДГ Адгезированные
ГСПК
: — V ! % t I t *■ ■ Г. MKM - 1 IffXIXXWW
l. ^^ ГСПК под МСК
Рис. 2. Культивирование мононуклеарных клеток пуповинной крови на подслое МСК. А - характерный вид сокультуры и графическое представление распределения в ней ге-мопоэтических клеток. Б - области «булыжной мостовой». Белыми стрелками отмечены ГСПК, адгезированные к поверхности МСК, красными стрелками - ГСПК, лежащие под МСК
Б
\ утт i
ложение в сокультуре в зависимости от пролифера-тивного потенциала, можно фракционировать клетки по их способности к адгезии и выделять популяции клеток с определенными свойствами (рис. 3) [73].
Согласно Jing и соавт., при культивировании в условиях атмосферного содержания кислорода наиболее «гипоксические» гемопоэтические клетки располагались под монослоем стромальных клеток [83]. При пониженном содержании кислорода уменьшалась адгезия гемопоэтических клеток к стромаль-ным клеткам, однако такие условия способствовали миграции клеток под монослой. В условиях гипоксии усиливалась продукция фактора роста эндотелия сосудов А, который, по-видимому, опосредовал увеличение проницаемости монослоя МСК. Стоит отметить, что пониженное содержание кислорода влияет как на гемопоэтические и стромальные клетки, так и на их взаимодействие [83].
Воссоздавая микроокружение костного мозга ex vivo, используют кислород, содержание которого соответствует тканевому, а в качестве клеточного компонента микроокружения - различные фидерные слои, в частности МСК [76, 77]. Однако стоит учитывать, что пониженное содержание кислорода в среде культивирования влияет не только на ге-мопоэтические клетки, но и на МСК. Определение дифференцировочного потенциала этих клеток in
vitro в условиях гипоксии выявило снижение осте-огенного и адипогенного потенциала [84, 85]. Кроме того, пониженное содержание кислорода при культивировании усиливает дифференцировку в хон-дрогенном направлении, а также увеличивает пролиферативную активность и число колоние-образующих единиц фибробластов [84, 86, 87]. Эти данные подчеркивают роль кислорода как важного фактора, определяющего судьбу клеток, относящихся к стромальному и гемопоэтическому гисто-генетическому ряду. Используя МСК в качестве фидерного подслоя для культивирования гемопо-этических клеток, важно учитывать влияние содержания кислорода на продукцию биологически активных медиаторов МСК. Установлено, что в присутствии 4-5% кислорода возрастает продукция МСК таких медиаторов, как IL-1 ß, IL-10, фактор роста гепатоцитов, фактор роста эндотелия сосудов, основной фактор роста фибробластов, TGF-ß, GM-CSF, однако снижается образование фактора некроза опухолей а [64, 88].
Koller и соавт. для экспансии гемопоэтических клеток пуповинной крови in vitro использовали методический подход, учитывающий влияние совокупности факторов кроветворного микроокружения [89]. Клетки ПК культивировали с добавлением или отсутствием рекомбинантных цитокинов и подслоя
МНК ПК
Удаление неадгезированных МНК ПК
t«S8
Суспензия ГСПК
М——
0 день 3 день 7 день
* Ш)
€> © щ>т>
Стромальный подслой
Рис. 3. Схема культивирования мононуклеарных клеток пуповинной крови (МНК ПК) на стромальном подслое, в котором адгезирующая к МСК фракция МНК ПК способна генерировать популяцию клеток, обогащенную гемопоэтическими предшественниками [73]
МСК, при 5 или 20% кислорода. Установлено, что использование IL-3/IL-6 обеспечивает более эффективную экспансию гемопоэтических предшественников, поддерживаемую в культуре более 8 недель, чем IL-1/IL-3. Этот эффект усиливался при культивировании в условиях пониженного содержания кислорода. Присутствие слоя облученных стромальных клеток не оказывало значительного эффекта на экспансию гемопоэтических клеток при добавлении ци-токинов, особенно при низком содержании кислорода.
В зависимости от содержания кислорода в среде культивирования эффект, оказываемый на ге-мопоэтические клетки, может быть различным. Совместное культивирование мононуклеаров пупо-винной крови и МСК из костного мозга в условиях 2% O2 способствует значительно более низкой продукции CD34+ клеток (25-кратное увеличение против 60-, 64- и 92-кратного на 10 день при 5, 21, 10% O2 соответственно). Определение динамики роста выявило более высокий пролиферативный статус клеток ПК, культивируемых при 5, 10, 21% кислорода, чем при 2% О2 [90].
Таким образом, для создания эффективных и контролируемых методических подходов, обеспечивающих получение большого количества ге-мопоэтических стволовых и прогениторных клеток для трансплантации, необходимо учитывать особенности микроокружения кроветворной ниши, в том числе содержание кислорода.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ЭКСПАНСИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ И ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ
ex vivo
Наиболее распространенные подходы к экспансии клеток ПК основаны на данных, полученных в ходе
изучения влияния клеточных и неклеточных факторов кроветворного микроокружения на ГСПК, включая тканевое содержание кислорода, взаимодействие со стромальными клетками и паракринные медиаторы. Однако, благодаря развитию молекулярно-генети-ческих методов, представления о механизмах, опосредующих работу гемопоэтической ниши, значительно расширились, что позволило создать новые технологические подходы к амплификации ГСПК ПК.
Экспансия, опосредованная Notch
Известно, что семейство рецепторов и лигандов Notch участвует в многочисленных процессах [91 — 93]. Рецептор Notch 1 обнаружен на CD34+ гемопоэ-тических предшественниках [94]. Кроме того, активация сигнализации Notch способствует сохранению фенотипа самых примитивных гемопоэтических стволовых клеток in vitro. Это привело к созданию бессывороточной системы культивирования CD34+ гемопоэтических клеток, состоящей из иммобилизованного Deltal Notch-лиганда и ранних цитокинов гемопоэтических стволовых клеток (SCF, TPO, Flt-3 лиганд, IL-3 и IL-6) [95]. Неоднозначные результаты получены при трансплантации двух единиц ПК, одна из которых была обогащена ГСПК с применением Notch-системы, проведенной в ходе клинических испытаний. Использование Notch-трансплантата позволяло сократить время восстановления нейтрофи-лов, однако по истечении 3 месяцев кроветворение у реципиентов обеспечивалось другим трансплантатом ПК. Наблюдаемый эффект можно объяснить двумя обстоятельствами: потерей за время культивирования клеток, обеспечивающих долгосрочное восстановление гемопоэза (long-term repopulating cells); иммунным ответом Т-клеток неманипулиро-ванного трансплантата ПК [34, 35].
Экспансия в присутствии StemEx (хелатора меди)
У пациентов с дефицитом меди значительно снижен гранулоцитопоэз и эритропоэз, при этом в биопта-тах костного мозга у них выявлено снижение числа зрелых гранулоцитов и увеличение числа промиело-цитов и миелоцитов по сравнению с людьми без этого дефицита [96, 97]. Данное наблюдение позволило предположить, что дефицит меди влияет на диффе-ренцировку миелоидных предшественников. Позднее был разработан компонент культуральной системы StemEx, действие которого основано на влиянии низких концентраций меди на дифференцировку ге-мопоэтических стволовых клеток в системе in vitro. В StemEx медный хелатор тетраэтиленпентамин сочетается с ранними и поздними гемопоэтическими цитокинами [98, 99]. Применение технологии StemEx предполагает проведение экспансии в присутствии StemEx части клеток из одной единицы ПК в течение 21 дня. Другую часть ПК вводят в исходном виде совместно с клетками, амплифицированными в присутствии StemEx [100]. Использование такого подхода приводит к улучшению ряда важных клинических показателей по сравнению с применением ПК в исходном виде, что свидетельствует об эффективности данной системы культивирования для амплификации ГСПК ПК ex vivo [101].
Экспансия NiCord
Технология NiCord основана на действии эпигенетического фактора - никотинамида, который позволяет замедлить дифференцировку и увеличить функциональность гемопоэтических стволовых и прогени-торных клеток, полученных в ходе ex vivo экспансии. Добавление никотинамида вместе с гемопоэтически-ми цитокинами в культуру способствует увеличению доли CD34+CD38- примитивных клеток и усиливает миграцию в направлении к SDF-1 in vitro. Кроме того, показана высокая эффективность приживления амплифицированных клеток в моделях in vivo [102]. NiCord не только позволяет увеличить количество ГСПК в сравнении с представленными выше технологиями, но и обеспечивает эффективное приживление клеток. Уникальной особенностью NiCord-трансплантата является то, что вместе с фракцией ГСПК, полученной после 21-дневной экспансии, он содержит фракцию некультивированных Т-клеток, которую собирают и повторно замораживают после разморозки. Таким образом, NiCord-трансплантат сохраняет иммунологический потенциал, что улучшает приживление трансплантата и иммунологическое восстановление. Результаты клинического применения ГСПК, амплифицированных в соответствии с протоколом NiCord и трансплантированных вместе с дополнительной единицей ПК, свидетельствуют
о более раннем восстановлении нейтрофилов (медиана 11 дней против 25 дней, Р = 0.001) и тромбоцитов (30 дней против 41, Р = 0.012) по сравнению с контролем [103]. Это исследование подтверждает присутствие долгосрочных (long-term repopulating cells) и краткосрочных репопулирующих клеток в трансплантате пуповинной крови после NiCord-экспансии.
Экспансия в присутствии Stem-Regenin 1
Stem-Regenin 1 - пуриновое производное, способствующее экспансии ex vivo ГСПК [104]. В технологии Stem-Regenin 1 для инициирования клеточной культуры используется фракционированная популяция CD34+ клеток ПК. Показано, что во время 3-не-дельного культивирования в среде без сыворотки, содержащей Stem-Regenin 1 и дополнительно TPO, SCF, лиганд Flt-3 и IL-6, происходит 1118-кратная экспансия CD34+ клеток относительно исходной популяции. Удаление из системы культивирования Stem-Regenin 1 приводит к быстрой дифференци-ровке, что указывает на важную роль этого компонента в поддержании малодифференцированного состояния гемопоэтических предшественников ПК. Клетки, полученные с применением Stem-Regenin 1, способны к высокоэффективному приживлению после трансплантации мышам с иммунодефицитом, что свидетельствует о присутствии среди них гемо-поэтических предшественников, обеспечивающих раннее и устойчивое восстановление гемопоэза. Эта технология хорошо проявила себя в клинических испытаниях и в настоящее время продолжает активно изучаться [105].
СТРАТЕГИИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА ПОВЫШЕНИЕ ХОМИНГА ГСПК
Разработаны также методические подходы, направленные на увеличение хоминга и приживление потенциальных стволовых клеток ПК без экспансии. Они представляют недорогую и безопасную альтернативу экспансии ГСПК ex vivo.
Сокультивирование с простагландином Е2
Изучение гемопоэза рыб Danio rerio выявило участие dmPGE2 (16,16-диметилпростагландин Е2) в гоме-остазе гемопоэтических стволовых клеток [22]. Это позволило предположить, что короткая экспозиция ex vivo клеток ПК с dmPGE2 позволит увеличить «эффективную дозу» гемопоэтических стволовых клеток без значительной токсичности для пациента. Показано, что краткосрочная инкубация ГСПК с dmPGE2 способствует увеличению их количества после трансплантации и обеспечивает преимущество этих клеток при серийной трансплантации с полным мультилинейным восстановлением костного мозга
у мышей [106]. Обнадеживающие результаты получены при клиническом использовании dmPGE2, и методика применения dmPGE2 в настоящий момент продолжает активно разрабатываться [24].
Фукозилирование
Данный подход направлен на увеличение хоминга стволовых клеток ПК к строме костного мозга. Методика основана на том, что гемопоэтические стволовые клетки ПК не мигрируют в костный мозг столь же активно, как клетки взрослого костного мозга или мобилизованные клетки периферической крови. Снижение эффективности хоминга в костном мозге может частично возникать из-за отсутствия связи с молекулами адгезии (Р- и Е-селектинами), которые экспрессируются на эндотелиальных клетках в сосудах костного мозга [19]. Фукозилирование лигандов селектина, экспрессирующихся на стволовых клетках ПК, увеличивает сродство к Р- и Е-селектинам гемопоэтического микроциркуляторного русла и критично для обеспечения «роллинга» ГСПК [107]. Достаточно простая процедура фукозилирования представляет собой инкубацию клеток ПК с фуко-зилтрансферазой IV и ее субстратом GDP-фукозой в течение 30 мин при комнатной температуре. На моделях in vivo показано повышение эффективности приживления стволовых клеток ПК с использованием предтрансплантационного ex vivo фукозилирова-ния у мышей с иммунодефицитом [25, 108].
Взаимодействие CXCR4-SDF-1
SDF-1 и его рецептор CXCR4 также обеспечивают хоминг ГСПК и удерживание их в костном мозге. CXCR4 экспрессируется на ряде клеток, включая МСК, эндотелиальные клетки и различные субпопуляции гемопоэтических клеток, в том числе ГСПК. SDF-1 является мощным хемоаттрактан-том для CD34+ ГСПК, которые после трансплантации мигрируют в костный мозг по градиенту SDF-1 [109-113]. Оптимальная экспрессия CXCR4 в ГСПК и эффективный уровень SDF-1 в костном мозге реципиента обеспечивают приживление трансплантата. Негативным регулятором данного взаимодействия является дипептидилпептидаза-4 (DPP4), способная удалить N-концевой дипептид из SDF-1, снижая, тем самым, его активность и способность к взаимодействию с рецептором. Ингибирование этого фермента привело к 2-3-кратному увеличению хоминга CD34+ и Li^-клеток человека при трансплантации мышам NOD/SCro/B2mnu11 [114]. Кроме того, известно, что дипептидилпептидаза-4 регулирует работу гемопоэтических факторов роста. Таким образом, ингибирование этого фермента благоприятно сказывается не только на хоминге, но и на росте клеток,
опосредованном действием ростовых факторов [115]. Использование препаратов, ингибирующих дипеп-тидилпептидазу-4, дало обнадеживающие результаты по приживлению ПК трансплантатов [116]. Дальнейшие исследования направлены на определение оптимальной дозировки и сроков использования этих препаратов.
Компонент С3а-комплемента
Компонент системы комплемента 3а (C3a) - продукт протеолитического расщепления белка комплемента С3. Наряду с многочисленными иммунорегулятор-ными свойствами, C3a сенсибилизирует гемопоэти-ческие стволовые и прогениторные клетки человека к хомингу в направлении к SDF-1 через связывание C3a с рецептором CXCR4. C3a наряду с DPP4, а также c гиалуроновой кислотой, фибронектином и фибриногеном регулирует экспрессию SDF-1 на ГСПК [117, 118]. Доклинические исследования показали, что инкубация гемопоэтических стволовых клеток с C3a до трансплантации летально облученным мышам ускоряет динамику приживления [20, 21]. Однако результаты клинического применения были не такими успешными, так как C3a не давал преимущества в приживлении трансплантата [23].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Несмотря на многочисленные исследования, направленные на оптимизацию методических подходов к обогащению стволовыми клетками кроветворных трансплантатов, единой оптимальной технологии получения амплифицированных стволовых клеток до сих пор не существует. Основные задачи, стоящие перед исследователями на сегодняшний день, - сформировать представление о составе и биологических свойствах гемопоэтических клеток кроветворного трансплантата, обеспечивающих восстановление гемопоэза реципиента, и разработать методические подходы, обеспечивающие амплификацию этих клеток.
Сравнительный анализ материалов, накопленных в этой области, обнаруживает две тенденции: использование в системах для амплификации клеток пупо-винной крови стромальных фидерных слоев или применение различных комбинаций гемопоэтических цитокинов. Между тем, в суспензионных культурах, в которых поддержание гемопоэтических предшественников происходит только за счет гемопоэтинов, не учитывается роль локального микроокружения (взаимодействие с клетками стромы и регуляция кислородом), тогда как показано, что эти факторы могут играть ключевую роль в развитии клеток крови. Экспансия ГСПК ПК более эффективна в со-культуре, чем в суспензионной культуре. Кроме
Модификация ГСПК пуповинной крови ex vivo
Дополнительные факторы
Гемопоэтические цитокины, IL-3, IL-6, SCF, TPO, Flt-3 и др.
Delta1 Notch-лиганд StemEx NiCord
Stem-Regenin 1
Улучшение хоминга ГСПК
dmPGE2, фукозилирование, SDF-1—CXCR4-взаимодeйствиe, СЗа-комплемент
Рис. 4. Современные технологические подходы к модификации гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток пуповинной крови ex vivo
того, сокультивирование улучшает приживление амплифицированных клеток после трансплантации. Добавление к системе сокультивирования экзогенных цитокинов дополнительно поддерживает экспансию ГСПК. Таким образом, представляется целесообразным использовать для амплификации системы ex vivo, включающие как стромальный подслой и физиологический уровень кислорода, так и необходимый коктейль из цитокинов и факторов роста.
В настоящий момент достаточно успешно показали себя молекулярно-генетические подходы, направленные как на амплификацию гемопоэтических клеток, так и на улучшение хоминга транспланти-
руемых клеток в костном мозге реципиента (рис. 4). Таким образом, системы ex vivo для амплификации ГСПК уже разработаны и успешно применяются, однако продолжается поиск новых эффективных методических подходов к экспансии клеток ПК с привлечением современных клеточных и молеку-лярно-биологических технологий. •
Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Президиума РАН «Фундаментальные исследования для разработки биомедицинских технологий».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kögler G., Radke T.F., Lefort A., Sensken S., Fischer J., Sorg R.V., Wernet P. // Exp. Hematol. 2005. V. 33. № 5. P. 573-583.
2. Kögler G., Sensken S., Airey J.A., Trapp T., Müschen M., Feldhahn N., Liedtke S., Sorg R.V., Fischer J., Rosenbaum C., et al. // J. Exp. Med. 2004. V. 200. № 2. P. 123-135.
3. Kögler G., Sensken S., Wernet P. // Exp. Hematol. 2006. V. 34. № 11. P. 1589-1595.
4. Sensken S., Waclawczyk S., Knaupp A.S., Trapp T., Enczmann J., Wernet P., Kogler G. // Cytotherapy. 2007. V. 9. № 4. P. 362-378.
5. Greschat S., Schira J., Küry P., Rosenbaum C., de Souza Silva M.A., Kögler G., Wernet P., Müller H.W. // Stem Cells Dev. 2008. V. 17. № 2. P. 221-232.
6. Мусина Р.А., Бекчанова Е.С., Белявский А.В., Гриненко Т.С., Сухих Г.Т. // Клет. технологии в биологии и медицине. 2007. № 1. С. 16-20.
7. Erices A., Conget P., Minguell J.J. // Br. J. Haematol. 2000. V. 109. № 1. P. 235-242.
8. Bieback K., Kern S., Klüter H., Eichler H. // Stem Cells. 2004. V. 22. № 4. P. 625-634.
9. Yang S.E., Ha C.W., Jung M., Jin H.J., Lee M., Song H., Choi S., Oh W., Yang Y.S. // Cytotherapy. 2004. V. 6. № 5. P. 476-486.
10. Yoder M.C., Mead L.E., Prater D., Krier T.R., Mroueh K.N., Li F., Krasich R., Temm C.J., Prchal J.T., Ingram D.A. // Blood. 2007. V. 109. № 5. P. 1801-1809.
11. Cutler C., Antin J.H. // Stem Cells. 2001. V. 19. № 2. P. 108-117.
12. Gluckman E., Rocha V. // Haematologica. 2009. V. 94. № 4. P. 451-454.
13. Семенова Ж.Б., Сушкевич Г.Н., Карасева О.В., Ахадов Т.А., Семенова Н.А., Семенова Н.Ю., Сорокина Е.Г., Фуфаева Е.В., Романов Ю.А., Рошаль Л.М. и др. // Нейрохирургия и неврология детского возраста. 2011. № 1. С. 70-82.
14. Broxmeyer H.E., Hangoc G., Cooper S., Ribeiro R.C., Graves V., Yoder M., Wagner J., Vadhan-Raj S., Benninger L., Rubinstein P., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. № 9.
P. 4109-4113.
15. Lu L., Xiao M. Shen R.N., Grigsby S., Broxmeyer H.E. // Blood. 1993. V. 81. № 1. P. 41-48.
16. Moore M.A., Hoskins I. // Blood Cells. 1994. V. 20. № 2-3. P. 468-479; discussion P. 479-481.
17. Movassagh M., Caillot L., Baillou C., Guigon M., Lemoine F.M. // Stem Cells. 1997. V. 15. № 3. P. 214-222.
18. Horwitz M.E., Frassoni F. // Cytotherapy. 2015. V. 17. № 6. P. 730-738.
19. Hidalgo A., Weiss L.A., Frenette P.S. // J. Clin. Invest. 2002. V. 110. № 4. P. 559-569.
20. Reca R., Mastellos D., Majka M., Marquez L., Ratajczak J., Franchini S., Glodek A., Honczarenko M., Spruce L.A., Janowska-Wieczorek A., et al. // Blood. 2003. V. 101. № 10. P. 3784-3793.
21. Ratajczak J., Reca R., Kucia M., Majka M., Allendorf D.J., Baran J.T., Janowska-Wieczorek A., Wetsel R.A., Ross G.D, Ratajczak M.Z. // Blood. 2004. V. 103. № 6. P. 2071-2078.
22. North T.E., Goessling W., Walkley C.R., Lengerke C., Kopani K.R., Lord A.M., Weber G.J., Bowman T.V., Jang I.H., Grosser T., et al. // Nature. 2007. V. 447. № 7147. P. 1007-1011.
23. Brunstein C.G., McKenna D.H., DeFor T.E., Sumstad D., Paul P., Weisdorf D.J., Ratajczak M., Laughlin M.J., Wagner J.E. // Biol. Blood Marrow Transplant. 2013. V. 19. № 10. P. 1474-1479.
24. Cutler C., Multani P., Robbins D., Kim H.T., Le T., Hoggatt J., Pelus L.M., Desponts C., Chen Y.B., Rezner B., et al. // Blood. 2013. V 122. № 17. P. 3074-3081.
25. Robinson S.N., Thomas M.W., Simmons P. J., Lu J., Yang H., Parmar S., Liu X., Shah N., Martin-Antonio B., Bollard C., Dotti G., et al. // Cytotherapy. 2014. V. 16. № 1. P. 84-89.
26. Briddell R.A., Kern B.P., Zilm K.L., Stoney G.B., McNiece I.K. // J. Hematother. 1997. V. 6. № 2. P. 145-150.
27. Уфимцева А.И., Канов Е.В. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2012. Т. 6. № 4. С. 21-27.
28. Summers Y.J., Heyworth C.M., de Wynter E.A., Chang J., Testa N.G. // Stem Cells. 2001. V. 19. № 6. P. 505-513.
29. Koller M.R., Manchel I., Newsom B.S., Palsson M.A., Palsson B.O. // J. Hematother. 1995. V. 4. № 3. P. 159-169.
30. Gilner J.B., Walton W.G., Gush K., Kirby S.L. // Stem Cells. 2007. V. 25. № 2. P. 279-288.
31. de Lima M., McNiece I., Robinson S.N., Munsell M., Eapen M., Horowitz M., Alousi A., Saliba R., McMannis J.D., Kaur I., et al. // N. Engl. J. Med. 2012. V. 367. № 24. P. 2305-2315.
32. Mantel C.R., O'Leary H.A., Chitteti B.R., Huang X., Cooper S., Hangoc G., Brustovetsky N., Srour E.F., Lee M.R., MessinaGraham S., et al. // Cell. 2015. V. 161. № 7. P. 1553-1565.
33. Aliyari Z., Khaziri N., Brazvan B., Saayah Melli M., Tayefi Nasrabadi H., Akbarzadeh A., Nozad Charoudeh H. // Artif. Cells Nanomed. Biotechnol. 2015. Jun 4. P. 1-8.
34. Gutman J.A., Turtle C.J., Manley T.J., Heimfeld S., Bernstein I.D., Riddell S.R., Delaney C. // Blood. 2010. V. 115. № 4. P. 757-765.
35. Moretta A., Andriolo G., Lisini D., Martinetti M., Pasi A., Rebulla P., Soligo D., Giordano R., Lazzari L., Maccario R. // Biol. Blood Marrow Transplant. 2012. V. 18. № 7. P. 1108-1118.
36. Spees J.L., Gregory C.A., Singh H., Tucker H.A., Peister A., Lynch P. J., Hsu S.C., Smith J., Prockop D.J. // Mol. Ther. 2004. V. 9. № 5. P. 747-756.
37. Sundin M., Ringden O., Sundberg B., Nava S., Götherström C., Le Blanc K. // Haematologica. 2007. V. 92. № 9. P. 1208-1215.
38. Петёвка Н.В., Гончарова Н.В., Северин И.Н., Космачева С.М., Потапнёв М.П. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2012. Т. 7. № 1. С. 40-48.
39. Sano-Martins I.S., Dabrowski Z., Tabarowski Z., Witkowska-Pelc E., Spadacci Morena D.D., Spodaryk K. // Cell Tissue Res. 2002. V. 310. № 1. P. 67-75.
40. Gao L., Chen X., Zhang X., Liu Y., Kong P., Peng X., Liu L., Liu H., Zeng D. // Blood Cells Mol. Dis. 2006. V. 36. № 2. P. 322-328.
41. Lawicki S., Mroczko B., Szmitkowski M. // Postepy Hig. Med. Dosw. 2001. V. 55. № 3. P. 449-465.
42. Tursky M.L., Collier F.M., Ward A.C., Kirkland M.A. // Cytotherapy. 2012. V. 14. № 6. P. 679-685.
43. Hordyjewska A., PopioLLek LL., Horecka A. // Cytotechnology. 2015. V. 67. № 3. P. 387-396.
44. Grskovic B., Ruzicka K., Karimi A., Qujeq D., Müller M.M. // Clin. Chim. Acta. 2004. V. 343. № 1-2. P. 173-178.
45. Haylock D.N., To L.B., Dowse T.L., Juttner C.A., Simmons P.J. // Blood. 1992. V. 80. № 6. P. 1405-1412.
46. Broxmeyer H.E., Sherry B., Lu L., Cooper S., Oh K.O., Tekamp-Olson P., Kwon B.S., Cerami A. // Blood. 1990. V. 76. № 6. P. 1110-1116.
47. Broxmeyer H.E., Cooper S., Cacalano G., Hague N.L., Bailish E., Moore M.W. // J. Exp. Med. 1996. V. 184. № 5. P. 1825-1832.
48. Graham G.J., Wright E.G., Hewick R., Wolpe S.D., Wilkie N.M., Donaldson D., Lorimore S., Pragnell I.B. // Nature. 1990. V. 344. № 6265. P. 442-444.
49. Dexter T.M., Allen T.D., Lajtha L.G. // J. Cell Physiol. 1977. V. 91. № 3. P. 335-344.
50. Friedenstein A.J., Chailakhyan R.K., Latsinik N.V., Pan-asyuk A.F., Keiliss-Borok I.V. // Transplantation. 1974. V. 17. № 4. P. 331-340.
51. De Angeli S., Di Liddo R., Buoro S., Toniolo L., Conconi M.T., Belloni A.S., Parnigotto P.P., Nussdorfer G.G. // Int. J. Mol. Med. 2004. V. 13. № 3. P. 363-371.
52. McNiece I., Harrington J., Turney J., Kellner J., Shpall E.J. // Cytotherapy. 2004. V. 6. № 4. P. 311-317.
53. Corre J., Barreau C., Cousin B., Chavoin J.P., Caton D., Fournial G., Penicaud L., Casteilla L., Laharrague P. // J. Cell Physiol. 2006. V. 208. № 2. P. 282-288.
54. Jang Y.K., Jung D.H., Jung M.H, Kim D.H., Yoo K.H., Sung K.W., Koo H.H., Oh W., Yang Y.S., Yang S.E. // Ann. Hematol. 2006. V. 85. № 4. P. 212-225.
55. Kilroy G.E., Foster S.J., Wu X., Ruiz J., Sherwood S., Heifetz A., Ludlow J.W., Stricker D.M., Potiny S., Green P., et al. // J. Cell. Physiol. 2007. V. 212. № 3. P. 702-709.
56. Nakao N., Nakayama T., Yahata T., Muguruma Y., Saito S., Miyata Y., Yamamoto K., Naoe T. // Am. J. Pathol. 2010. V. 177. № 2. P. 547-554.
57. De Toni F., Poglio S., Youcef A.B., Cousin B., Pflumio F., Bou-rin P., Casteilla L., Laharrague P. // Stem Cells Dev. 2011. V. 20. № 12. P. 2127-2138.
58. Жамбалова А.П., Даревская А.Н., Кабаева Н.В., Романов Ю.А., Буравкова Л.Б. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2009. № 2. С. 89-95.
59. Петрова Т.В., Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н., Момотюк К.С., Савченко В.Г., Дризе Н.И. // Клеточные технологии
в биологии и медицине. 2006. № 4. С. 218-222.
60. Анисимов С.В. // Цитология. 2012. Т. 54. № 4. С. 289-297.
61. Mishima S., Nagai A., Abdullah S., Matsuda C., Taketani T., Kumakura S., Shibata H., Ishikura H., Kim S.U., Masuda J. // Eur. J. Haematol. 2010. V. 84. № 6. P. 538-546.
62. Haynesworth S.E., Baber M.A., Caplan A.I. // J. Cell. Physiol. 1996. V. 166. № 3. P. 585-592.
63. Majumdar M.K., Thiede M.A., Mosca J.D., Moorman M., Ger-son S.L. // J. Cell. Physiol. 1998. V. 176. № 1. P. 57-66.
64. Буравкова Л.Б., Жамбалова А.П., Кабаева Н.В., Романов Ю.А. Стволовые клетки и регенеративная медицина. М.: Макс Пресс, 2011. С. 145-161.
65. Taichman R.S., Reilly M.J., Verma R.S., Emerson S.G. // Blood. 1997. V. 89. № 4. P. 1165-1172.
66. Ahmed N., Sammons J., Carson R.J., Khokher M.A., Hassan H.T. // Cell. Biol. Int. 2001. V. 25. № 5. P. 429-435.
67. Petit I., Szyper-Kravitz M., Nagler A., Lahav M., Peled A., Habler L., Ponomaryov T., Taichman R.S., Arenzana-Seisdedos F., Fujii N., et al. // Nat. Immunol. 2002. V. 3. № 7. P. 687-694.
68. Kim J.W., Kim S.Y., Park S.Y., Kim Y.M., Kim J.M., Lee M.H., Ryu H.M. // Ann. Hematol. 2004. V. 83. № 12. P. 733-738.
69. Тепляшин А.С., Коржикова С.В., Шарифуллина С.3., Чу-пикова Н.И., Ростовская М.С., Савченкова И.П. // Цитология. 2005. Т. 47. № 2. С. 130-135.
70. Паюшина О.В., Домарацкая Е.И., Старостин В.И. // Изв. АН. Серия биологическая. 2006. № 1. С. 6-25.
71. Романов Ю.А., Даревская А.Н., Кабаева Н.В., Антонова О.А // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2006. № 4. С. 206-211.
72. Шахпазян Н.К., Астрелина Т.А., Яковлева М.В. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2012. Т. 7. № 1. C. 23-33.
73. Маслова Е.В., Андреева Е.Р., Андрианова И.В., Бобылева П.И., Романов Ю.А., Кабаева Н.В., Балашова Е.Е., Ряскина С.С., Дугина Т.Н., Буравкова Л.Б. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2013. № 4. С. 238-243.
74. Gimble J.M., Katz A.J., Bunnell B.A. // Circ. Res. 2007. V. 100. № 9. P. 1249-1260.
75. Parmar K., Mauch P., Vergilio J.A., Sackstein R., Down J.D // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. № 13. P. 5431-5436.
76. Сотнезова (Маслова) Е.В., Горностаева А.Н., Андреева Е.Р., Романов Ю.А., Балашова Е.В., Буравкова Л.Б. // Цитология. 2015. Т. 57. № 6. С. 428-435.
77. Andreeva E.R., Andrianova I.V., Sotnezova E.V., Buravkov S.V., Bobyleva P.I., Romanov Y.A., Buravkova L.B. // PLoS One. 2015. V. 10. № 4. P. e0124939.
78. Cipolleschi M.G., Dello Sbarba P., Olivotto M. // Blood. 1993. V. 82. P. 7. P. 2031-2037.
79. Shima H., Takubo K., Iwasaki H., Yoshihara H., Gomei Y., Hosokawa K., Arai F., Takahashi T., Suda T. // Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 2009. V. 378. № 3. P. 467-472.
80. Ivanovic Z., Hermitte F., Brunet de la Grange P., Dazey B., Belloc F., Lacombe F., Vezon G., Praloran V. // Stem Cells. 2004. V. 22. № 5. P. 716-724.
81. Roy S., Tripathy M., Mathur N., Jain A., Mukhopadhyay A. // Eur. J. Haematol. 2012. V. 88. № 5. P. 396-405.
82. Ploemacher R.E., van der Sluijs J.P., Voerman J.S., Brons N.H. // Blood. 1989. V. 74. № 8. P. 2755-2763.
83. Jing D., Wobus M., Poitz D.M., Bornhäuser M., Ehninger G., Ordemann R. // Haematologica. 2012. V. 97. № 3. P. 331-339.
84. Буравкова Л.Б., Гринаковская О.С., Андреева Е.Р., Жамбалова А.П., Козионова М.П. // Цитология. 2009. Т. 51. № 1.
С. 5-12.
85. Malladi P., Xu Y., Chiou M., Giaccia A.J., Longaker M.T. // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2006. V. 290. № 4. P. 1139-1146.
86. Wang D.W., Fermor B., Gimble J.M., Awad H.A., Guilak F. // J. Cell. Physiol. 2005. V. 204. № 1. P. 184-191.
87. Xu Y., Malladi P., Chiou M., Bekerman E., Giaccia A.J., Longaker M.T. // Tissue Eng. 2007. V. 13. № 12. P. 2981-2993.
88. Li Z., Wei H., Deng L., Cong X., Chen X. // FEBS J. 2010. V. 277. № 18. P. 3688-3698.
89. Koller M.R., Bender J.G., Papoutsakis E.T., Miller W.M. // Blood. 1992. V. 80. № 2. P. 403-411.
90. Andrade P.Z., de Soure A.M., Dos Santos F., Paiva A., Cabral J.M., da Silva C.L. // J. Tissue Eng. Regen. Med. 2015. V. 9.
№ 10. P. 1172-1181.
91. Andersson E.R., Sandberg R., Lendahl U. // Development. 2011. V. 138. № 17. P. 3593-3612.
92. Sethi N., Kang Y. // Br. J. Cancer. 2011. V. 105. № 12. P. 1805-1810.
93. Румянцев С.А., Осипова Е.Ю., Ипатов С.Е., Шаманская Т.В., Майорова О.А., Румянцев А.Г. // Онкогематология. 2011. Т. 6. № 1. С. 64-75.
94. Milner L.A., Kopan R., Martin D.I., Bernstein I.D. // Blood. 1994. V. 83. № 8. P. 2057-2062.
95. Delaney C., Varnum-Finney B., Aoyama K., Brashem-Stein C., Bernstein I.D. // Blood. 2005. V. 106. № 8. P. 2693-2699.
96. Zidar B.L., Shadduck R.K., Zeigler Z., Winkelstein A. // Am. J. Hematol. 1977. V. 3. P. 177-185.
97. Percival S.S. // Nutr. Rev. 1995. V. 53. № 3. P. 59-66.
98. Peled T., Landau E., Mandel J., Glukhman E., Goudsmid N.R., Nagler A., Fibach E. // Exp. Hematol. 2004. V. 32. № 6. P. 547-555.
99. Peled T., Mandel J., Goudsmid R.N., Landor C., Hasson N., Harati D., Austin M., Hasson A., Fibach E., Shpall E.J., Nagler A. // Cytotherapy. 2004. V. 6. № 4. P. 344-355.
100. de Lima M., McMannis J., Gee A., Komanduri K., Couriel D., Andersson B.S., Hosing C., Khouri I., Jones R., Champlin R., et al. // Bone Marrow Transplant. 2008. V. 41. № 9. P. 771-778.
101. Montesinos P., Peled T., Landau E., Rosenheimer N., Mandel J., Hasson N., Olesinski E., Glukhman E., Snyder D.A., Cohen E.G., et al. // Blood. 2013. V. 122. № 21. P. 295.
102. Peled T., Shoham H., Aschengrau D., Yackoubov D., Frei G., Rosenheimer G.N., Lerrer B., Cohen H.Y., Nagler A., Fibach E., et al. // Exp. Hematol. 2012. V. 40. № 4. P. 342-355.
103. Horwitz M.E., Chao N.J., Rizzieri D.A., Long G.D., Sullivan K.M., Gasparetto C., Chute J.P., Morris A., McDonald C., Waters-Pick B., et al. // J. Clin. Invest. 2014. V. 124. № 7. P. 3121-3128.
104. Boitano A.E., Wang J., Romeo R., Bouchez L.C., Parker A.E., Sutton S.E., Walker J.R., Flaveny C.A., Perdew G.H., Denison M.S., Schultz P.G., Cooke M.P. // Science. 2010. V. 329. № 5997. P. 1345-1348.
105. Wagner W., Wein F., Roderburg C., Saffrich R., Faber A., Krause U., Schubert M., Benes V., Eckstein V., Maul H., et al. // Exp. Hematol. 2007. V. 35. № 2. P. 314-325.
106. Hoggatt J., Singh P., Sampath J., Pelus L.M. // Blood. 2009. V. 113. № 22. P. 5444-5455.
107. Robinson S.N., Simmons P.J., Thomas M.W., Brouard N., Ja-vni J.A., Trilok S., Shim J.S., Yang H., Steiner D., Decker W.K., et al. // Exp. Hematol. 2012. V. 40. № 6. P. 445-456.
108. Xia L., McDaniel J.M., Yago T., Doeden A., McEver R.P. // Blood. 2004. V. 104. № 10. P. 3091-3096.
109. Tashiro K., Tada H., Heilker R., Shirozu M., Nakano T., Honjo T. // Science. 1993. V. 261. № 5121. P. 600-603.
110. Kim C.H., Broxmeyer H.E. // Blood. 1998. V. 91. № 1. P. 100-110.
111. Aiuti A., Webb I.J., Bleul C., Springer T., Gutierrez-Ramos J.C. // J. Exp. Med. 1997. V. 185. № 1. P. 111-120.
112. Bleul C.C., Fuhlbrigge R.C., Casasnovas J.M., Aiuti A., Springer T.A. // J. Exp. Med. 1996. V. 184. № 3. P. 101-109.
113. Peled A., Petit I., Kollet O., Magid M., Ponomaryov T., Byk T., Nagler A., Ben-Hur H., Many A., Shultz L., et al. // Science. 1999. V. 283. № 5403. P. 845-848.
114. Christopherson K.W. 2nd, Paganessi L.A., Napier S., Pore-cha N.K. // Stem Cells Dev. 2007. V. 16. № 3. P. 355-360.
115. Broxmeyer H.E., Hoggatt J., O'Leary H.A., Mantel C., Chitteti B.R., Cooper S., Messina-Graham S., Hangoc G.,
Farag S., Rohrabaugh S.L., et al. // Nat. Med. 2012. V. 18. № 12. P. 1786-1796.
116. Farag S.S., Srivastava S., Messina-Graham S., Schwartz J., Robertson M.J., Abonour R., Cornetta K., Wood L., Secrest A., Strother R.M., et al. // Stem Cells Dev. 2013. V. 22. № 7.
P. 1007-1015.
117. Avigdor A., Goichberg P., Shivtiel S., Dar A., Peled A., Samira S., Kollet O., Hershkoviz R., Alon R., Hardan I., et al. // Blood. 2004. V. 103. № 8. P. 2981-2989.
118. Wysoczynski M., Reca R., Ratajczak J., Kucia M., Shirvai-kar N., Honczarenko M., Mills M., Wanzeck J., Janowska-Wiec-zorek A., Ratajczak M.Z. // Blood. 2005. V. 105. № 1. P. 40-48.
