CC BY
168
А.И. Уфимцева, Е.В. Канов
ООО «Транс-Технологии», Санкт-Петербург
Characterization and ex vivo expansion umbilical cord bloodhematopoietic stem and progenitor cells
Ufimtceva A.I., KanovE.V. «Trans-Technologies Ltd», Saint-Petersburg
Характеристика и ex vivo экспансия гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток пуповинной крови
Пуповинная кровь, как один из альтернативных источников гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток, в настоящее время активно применяется в клинической практике. В связи с этим необходимо четко охарактеризовать содержащуюся в ней популяцию гемопоэтических предшественников и обнаружить среди них клетки с наибольшей способностью к восстановлению кроветворения. Кроме того, абсолютное количество гемопоэтических стволовых и кроветворных клеток в пуповинной крови невелико, что заставляет искать способы их наращивания ex vivo. В настоящее время разработан ряд методов определения характеристик прогениторных клеток пуповинной крови in vitro и in vivo и их экспансии ex vivo. В данном обзоре рассмотрены эти методы, а также проблемы их адаптации для практики клинической трансплантологии.
Ключевые слова: гемопоэтические стволовые и про-гениторные клетки, пуповинная кровь, методы характери-зации, ex vivo экспансия.
Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) — недифференцированные клетки, которые являются предшественницами всех форменных элементов крови и поддерживают кроветворение в костном мозге (КМ) на протяжении жизни организма. Известна их способность восстанавливать гемопоэз летально облученного реципиента при трансплантации [1, 2]. Однако популяция ГСК неоднородна и содержит разные по степени «зрелости» и биологическим свойствам клетки. Наиболее примитивными из них являются длительно репопулирующие костный мозг ГСК (т.н. long-term repopulating hematopoietic stem cells — LT-HSC). Также к ГСК относят и более «зрелые» клетки — кратковременно репопулирующие костный мозг ГСК (т.н. short-term repopulating hematopoietic stem cells) и мультипотентные прогениторные ГСК (т.н. multipotent progenitor hematopoietic stem cells) [3]. В связи с этим, на наш взгляд, более корректным названием этой неоднородной популяции является термин «гемопоэтические стволовые и прогенитор-ные клетки» (ГСК/ГПК). По мере дифференцировки мультипотентные прогениторные ГСК становятся либо общими лимфоидными предшественниками, из которых образуются Т и В лимфоциты и NK клетки, либо общими миелоидными предшественниками, которые, проходя промежуточные стадии, дают начало эри-троцитарному, гранулоцитарному, моноцитарному и мегакариоцитарному росткам кроветворения [4].
Свойства ГСК/ГПК
Для ГСК/ГПК, как и для всех стволовых клеток, характерна способность к самообновлению, т.е. делению с образованием своих идентичных копий, бла-
e-mail: [email protected]
Umbilical cord blood as an alternative source of hematopoietic stem and progenitor cells is widely used in clinical practice. Thereby it is necessary to characterize hematopoietic progenitors and to define among them the most «primitive» cells with the greatest repopulating potential. In addition absolute number of hematopoietic stem and progenitor cells is limited, so it is important to find ways of increasing their ex vivo. Currently several methods of in vitro and in vivo characterize hematopoietic progenitors and of ex vivo expansion of these cells have been developed. In this review we describe this methods, as well as problems with their translation to the clinical transplantation.
Key words: hematopoietic stem and progenitor cells, umbilical cord blood, methods of characterization, ex vivo expansion.
годаря которому осуществляется поддержание пула ГСК/ГПК во взрослом организме [5]. Способность к самообновлению наиболее выражена у самых примитивных гемопоэтических клеток (LT-HSC) и уменьшается по мере дифференцировки [3].
Самообновление — один из вариантов судьбы ГСК/ГПК, помимо этого возможна дифференцировка с образованием коммитированных предшественников и, в дальнейшем, зрелых клеток крови, или гибель клетки путем апоптоза [5, 6]. Вероятность выбора каждого из вариантов не строго предопределена, а зависит от влияния множества внутриклеточных и внешних факторов [5]. За последние годы открыта роль ряда транскрипционных факторов во внутренней регуляции «поведения» ГСК/ГПК: например, в эмбриональном периоде это SCL, LMO2, GATA2, AML1, MYB; в гемопоэзе взрослого организма принимают участие HOX (в частности, HOXB4), Bmil, Meisi, TEL, Gfi-1, MOZ и другие [3, 7, 8]. Также показано, что для выбора варианта развития ГСК/ГПК имеют значение эпигенетическая регуляция (например, модификация гистоновых белков с помощью ингибиторов деацетилаз), регуляция клеточного цикла (с помощью ингибиторов циклинзависимых киназ) и посттранскрипционная модификация белков для выбора варианта развития ГСК/ГПК [4]. Кроме того, большое количество экспериментальных данных свидетельствует о том, что в выборе судьбы гемопоэтических предшественников важную роль играет микроокружение [9]. Во взрослом организме ГСК/ГПК находятся в костном мозге, где негемопоэти-ческие клетки и внеклеточный матрикс образуют для них так называемую нишу. Выделяют эндостальную
нишу, образованную остеобластами, и сосудистую нишу, главную роль в которой играет эндотелий си-нусоидных капилляров [10, 11]. Внешняя регуляция дифференцировки и самообновления ГСК/ГПК осуществляется с помощью продуцируемых микроокружением биологически активных веществ [10] и непосредственных межклеточных взаимодействий [11]. Сегодня известно несколько сигнальных путей, задействованных в гемопоэзе, наиболее изученными из них являются пути, связанные с факторами Hedgehog, Wnt, Notch, FGF, BMP и Tie2-Angiopoietin1 [8, 10, 12—15]. В настоящее время тщательно изучаются молекулярные механизмы выбора клеткой одного из путей развития для фармакологического воздействия на них in vitro и in vivo.
Другим присущим ГСК/ГПК свойством является их способность при внутривенном введении перемещаться в костномозговую нишу и восстанавливать кроветворение реципиента, т.е. способность к хомингу. На поверхности гемопоэтических предшественников обнаружен трансмембранный рецептор CXCR4 (C-X-C chemokine receptor type 4, CD184)
[16], в то время как клетки стромы КМ экспресси-руют его специфический лиганд — SDF-1 (stromal cell-derived factor 1, также называемый CXCL12)
[17]. Ось SDF-1/CXCR4 играет ключевую роль в миграции ГСК/ГПК во взрослом организме [16]. Кроме того, в процессе хоминга задействованы интегрины VLA-4, VLA-5, LFA-1 и их лиганды VCAM-1 и ICAM-1
[18], а также рецептор CD44, который связывается с гиалуроновой кислотой [19]. Также гемопоэтиче-ские предшественники экспрессируют фермент ди-пептидил-пептидазу-4 (CD26), который расщепляет молекулу SDF-1, осуществляя негативную регуляцию хоминга [20]. На способности ГСК/ГПК к самообновлению и хомингу основано применение этих клеток в клинической практике.
Характеристика ГСК/ГПК
Важной задачей современных исследований является характеристика гемопоэтических предшественников, которая необходима для понимания состава и биологических свойств ГСК/ГПК, а также для выделения примитивных субпопуляций с наибольшим пролиферативным и дифференцировочным потенциалом. Кроме того, четкая характеристика этих клеток важна при трансплантации для расчета клеточной дозы. На настоящий момент охарактеризовать ГСК/ГПК можно с помощью ряда in vitro и in vivo методов.
Одним из самых распространенных методов является фенотипирование гемопоэтических предшественников по поверхностным маркерам. Традиционно маркером человеческих ГСК/ГПК считается CD34 [21], также эти клетки «слабо» экспрессируют общий лейкоцитарный маркер CD45 (CD45dim). На основе использования этих двух маркеров разработан протокол фенотипирования ГСК с помощью проточной цитометрии ISHAGE (International Society of Hematotherapy and Graft Engineering) для оценки количества CD34+ клеток [22]. Гемопоэтические предшественники также экспрессируют CD90 (Thy1) [23] и CD133 [24] и являются негативными по CD38 [25] и ряду маркеров, характерных для зрелых клеток крови — линейных маркеров (Lin-). Особого внимания заслуживают ГСК/ГПК, не несущие CD34, но обладающие свойством гемопоэтических
предшественников восстанавливать кроветворение [26, 27]. Сравнение CD34+ и CD34- клеток показало, что последние намного менее клоногенны in vitro [28], и, кроме того, при внутривенной трансплантации CD34-/Lin- клетки практически не приводят к репопуляции КМ реципиента [29], что связано с низким уровнем экспрессии CXCR4 и ограниченной способностью к хомингу [30]. Однако данные клетки способны обеспечивать длительное восстановление всех ростков гемопоэза при внутрикостном введении [29, 31], а также давать начало CD34+ клеткам in vitro и in vivo [32]. Таким образом, считается, что CD34-/Lin- ГСК/ГПК являются примитивными гемо-поэтическими предшественниками с высоким про-лиферативным потенциалом. В последнее время ведется активный поиск новых позитивных маркеров ГСК/ГПК. В экспериментах на примитивных гемо-поэтических предшественниках, полученных из КМ мышей, выявлены такие поверхностные молекулы, как CD105 (эндоглин) [33], CD201 (рецептор эндо-телиального протеина С) [34] и CD150 (рецептор SLAM семейства) [35]. Однако для обнаружения аналогичных маркеров на человеческих ГСК/ГПК и определения их функций требуются дальнейшие исследования.
Помимо фенотипирования ГСК/ГПК путем определения на них поверхностных молекул, для характеристики этих клеток некоторые исследователи применяют так называемые функциональные тесты. Одним из таких тестов является определение способности клеток активно «выкачивать» из своей внутренней среды флюоресцентные красители, такие как Hoechst-33342 и Rhodamine-123, с помощью мембранных транспортеров семейства ABCG2 [36]. Клетки, способные к выраженному выведению красителя, и, как следствие, демонстрирующие низкую интенсивность флюоресценции при исследовании методом проточной цитометрии (Holow, Rholow), называют SP-клетками (от англ. «side-population») [36, 37]. Важно, что эта популяция содержит значительное количество LT-HSC, которые обладают высоким пролиферативным потенциалом in vitro и in vivo [38, 39] и находятся в G0 фазе клеточного цикла [40, 41]. Ещё одним функциональным тестом является определение активности внутриклеточной альдегид-дегидрогеназы (ALDH) с использованием синтетического субстрата BODIPY®-аминоацетальдегида, способного к флюоресценции после взаимодействия с этим ферментом. Клетки с высокой активностью ALDH обладают свойствами ранних гемопоэтических предшественников [42, 43]. Кроме того, активность этого фермента коррелирует с колониеобразующей активностью in vitro и с приживлением при клинической трансплантации в большей степени, чем экспрессия CD34 [44, 45]. Таким образом, оценка способности клетки к «выкачиванию» флюоресцентных красителей и определение активности альдегидде-гидрогеназы позволяют охарактеризовать наиболее примитивную субпопуляцию ГСК/ГПК, обогащенную LT-HSC.
Кроме определения поверхностных маркеров и постановки функциональных тестов для характеристики ГСК/ГПК существует также ряд культуральных методов. Критериями оценки гемопоэтических предшественников являются их способность к пролиферации и дифференцировке. Наиболее широко применяется методика с использованием полутвердых
сред на основе метилцеллюлозы — исследование ко-лониеобразования (colony-forming cells assay) [46]. Оценка осуществляется путем идентификации и подсчёта колоний с учетом их морфологии и времени появления. Этот метод характеристики ГСК/ГПК является обязательным для банков пуповинной крови [47]. Однако культуральные методы не позволяют судить о способности ГСК/ГПК к репопуляции КМ [15].
Более полную информацию о субпопуляциях ГСК/ ГПК дают результаты исследований in vivo, при которых оценивается способность гемопоэтических предшественников заселять КМ облученного организма (marrow repopulating ability, MRA). Критериями оценки ГСК/ГПК являются длительность восстановления гемопоэза и его мультилинейность. Наиболее распространенная на настоящий момент методика — определение концентрации человеческих клеток, способных к заселению КМ NOD/SCID мышей (SCID-repopulating cells, SRC), методом предельных разведений [48—50]. Для этого кратные количества ГСК/ГПК вводят летально облученным животным и через 5—8 нед. после трансплантации определяют процент человеческих CD45 + клеток или специфической ДНК в КМ реципиента. Но и по результатам этих исследований на лабораторных животных можно лишь косвенно судить о процессах восстановления гемопоэза у человека при трансплантации ГСК/ГПК.
Таким образом, характеристика гемопоэтических предшественников с помощью in vitro и in vivo методов чрезвычайно важна для изучения и применения этих клеток. Однако полную и достоверную информацию о поведении ГСК/ГПК в организме человека дают только результаты клинических исследований.
Использование ГСК/ГПК в клинике
Благодаря открытию способности ГСК/ГПК восстанавливать кроветворение летально облученного реципиента при трансплантации стало возможным лечение состояний, связанных с подавлением собственного гемопоэза. Традиционным источником ГСК/ГПК является костный мозг, также гемопоэти-ческие предшественники можно получить из пупо-винной крови (ПК) и из крови взрослого человека после мобилизации. Однако ПК как источник ГСК/ ГПК имеет ряд преимуществ: 1) ГСК/ГПК из ПК обладают большим пролиферативным потенциалом по сравнению с ГСК/ГПК из КМ [14, 51], что, вероятно, связано с большей длиной теломер [52]; 2) Т лимфоциты ПК функционально незрелые, что снижает вероятность и тяжесть реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) [53]; 3) подбор и получение необходимого для трансплантации образца происходит гораздо быстрее, чем подбор донора КМ; 4) при неродственной трансплантации менее строгие требования к совместимости по HLA; 5) процедура сбора ПК безболезненна и безопасна для донора; 6) низкая вероятность контаминации латентными вирусами, такими как цитомегаловирус и вирус Эпштейна — Барр [54—56].
Наиболее активно ПК используется в качестве альтернативного источника ГСК/ГПК при отсутствии донора КМ, совместимого по HLA. Было проведено сравнение исходов трансплантации несовместимых по 1—2 аллелям HLA образцов ПК (n = 150) и КМ (n = 83) взрослым пациентам [57]. Количе-
ство введенных ядросодержащих клеток составляло 0,22х108/кг для ПК и 2,2х108/кг для КМ. Восстановление количества нейтрофилов после трансплантации ГСК/ГПК ПК в среднем наблюдалось к 27 дню, восстановление тромбоцитопоэза — к 60 дню; у пациентов после трансплантации КМ — к 20 и 29 дню соответственно. Была отмечена схожая трехлетняя выживаемость в обеих группах (26% для ПК и 20% для КМ), однако частота острой РТПХ II-IV степени в первой группе была достоверно ниже (40% для ПК и 58% для КМ). Похожие результаты представлены и другими исследователями [51, 54, 56]. Таким образом, трансплантация ПК может заменить трансплантацию КМ при отсутствии совместимого донора.
Критически значимыми для клинического использования параметрами образца ПК являются количество ядросодержащих клеток (не менее 2,5х107/кг веса реципиента), количество CD34+ клеток (не менее 2х105/кг) и число несоответствий HLA между донором и реципиентом (не более чем по 2 аллелям) [56]. Основным недостатком ПК является ограниченный объем получаемых образцов и небольшое абсолютное количество ГСК/ГПК [14, 15, 54]. С этим связаны более медленное по сравнению с трансплантацией КМ восстановление гемопоэза у реципиента и, как следствие, риск развития инфекционных и геморрагических осложнений [54, 57]. Для решения этой проблемы применяют одновременную трансплантацию двух образцов ПК; внутрикостное введение трансплантата; совместное введение ГСК/ ГПК с мультипотентными мезенхимными стромаль-ными клетками (ММСК), способствующими их хомингу; однако радикальным подходом является ex vivo экспансия гемопоэтических предшественников, то есть увеличение количества этих клеток в культуре с сохранением их исходных свойств [14, 56].
Ex vivo экспансия ГСК/ГПК ПК:
существующие подходы
Необходимый этап всех методов экспансии — выделение популяции ГСК/ГПК. Для этого большинство исследователей применяют позитивную или негативную сортировку клеток с помощью моноклональных антител к специфическим маркерам с магнитными или флюоресцентными метками. В большинстве работ осуществляется позитивная сортировка CD34+ и(или) CD133+ клеток [55], однако при таком подходе из экспансии исключается популяция клеток, негативных по этим маркерам, но обладающих способностью к самообновлению и дифференцировке. Кроме того, есть данные, что связывание антител с поверхностными молекулами при позитивной сортировке может изменить функциональное состояние клетки [58], поэтому предпочтительной является негативная сортировка.
Для экспансии ГСК/ГПК необходимо создать условия для реализации их способности к самообновлению. Наиболее изученный подход — применение жидких бессывороточных сред с добавлением ре-комбинантных человеческих цитокинов. Минимально необходимый набор цитокинов включает в себя фактор стволовых клеток, тромбопоэтин и лиганд Fms-подобной тирозинкиназы 3 (Fms-related tyrosine kinase 3 ligand, Flt3L) [15, 59, 60]. Кроме того, показано значение интерлейкинов 3 и 6 (IL3, IL6) для ex vivo экспансии ГСК/ГПК [25, 61]. Однако разные исследователи используют разные комбинации
этих цитокинов, дополнительно добавляя в культуру гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колоние-стиму-лирующий фактор, фактор роста и развития мега-кариоцитов, эритропоэтин в различных сочетаниях [62—67]. Но для всех методик с использованием только цитокинов характерно лишь незначительное увеличение количества CD34+ клеток, в основном за счет более зрелых гемопоэтических предшественников. С этим связано более быстрое, но менее длительное восстановление гемопоэза при трансплантации ГСК/ГПК, полученных с помощью этих методик [15]. Кроме того, культивирование с цитокинами приводит к индукции апоптоза и снижению способности к хомингу [15].
На основании данных о роли негемопоэтиче-ских клеток КМ в самообновлении ГСК/ГПК in vivo многие авторы считают необходимым для их экспансии наличие фидерного слоя, состоящего из культуры стромальных клеток. С этой целью применяются клеточные линии, полученные из взрослых и эмбриональных кроветворных органов, таких как аорта-гонадо-мезонефрос, желточный мешок, фе-тальная печень и КМ [10]. Также ряд исследователей использует в качестве фидерного слоя ММСК [68-70] или полученные из них путем направленной дифференцировки остеобласты [71], создавая таким образом подобие эндостальной ниши in vitro. В настоящее время ведутся работы с целью выделения ММСК из ПК и использования их для экспансии гемопоэтических предшественниц [72]. Для моделирования сосудистой ниши ГСК/ГПК возможно использование культуры эндотелиальных клеток пупочной вены (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) [73]. Одним из перспективных направлений ex vivo экспансии гемопоэтических предшественников является использование трехмерных матриц (например, из покрытого танталом пористого биоматериала Cytomatrix® [74] или полиэтилентере-фталата с иммобилизованным фибронектином [75]). Некоторые исследователи комбинируют применение трехмерных структур, состоящих из нетканого пористого носителя и фидерного слоя клеток для более точного моделирования костномозговой ниши ГСК/ГПК [76, 77]. Однако использование фидерного слоя является дорогостоящим и трудоемким; кроме того, применение ксеногенных клеток нежелательно при экспансии гемопоэтических предшественников для последующего клинического применения.
Исходя из накопленных данных о внутренней и внешней регуляции функций ГСК/ГПК in vivo, были разработаны новые подходы к наращиванию этих клеток в культуре. Такими подходами являются экспансия ГСК/ГПК с использованием ретиноевой кислоты [78], тетраэтиленпентамина — хелатора внутриклеточной меди [79], StemRegenin 1 — антагониста рецептора ароматических углеводородов [80], активация сигнального пути Notch с помощью лиганда Delta1 [81], применение рекомбинантных ангиопоэтин-подобных белков (в частности, Angptl5) [82]. Кроме того, к самообновлению и увеличению количества ГСК/ГПК приводит модификация гисто-новых белков, которая достигается добавлением в культуру клеток ингибитора гистондеацетилаз нико-тинамида [83], вальпроевой кислоты — ингибитора GSK3P (гликоген синтазы киназы 3р) [84] или комбинации 5'аза-2'дезоксицитидина и трихостатина А
[85]. Также для наращивания популяции гемопоэти-ческих предшественников описано использование серотонина [86], плейотрофина [87] и паратирео-идного гормона [88]. Необходимо отметить, что все эти методики требуют, тем не менее, добавления цитокинов в питательную среду.
По сравнению с использованием только цито-кинов, все вышеперечисленные методики приводят к более выраженной экспансии ГСК/ГПК. Так, например, добавление в культуру Angptl5 позволяет увеличить количество CD34+ клеток в 22 раза за 10 дней [82], использование иммобилизованного лиганда Delta1 — в среднем в 163 раза за 17—21 день [81], а применение StemRegenin1 — практически в 17000 раз за 35 дней [80]. Трансплантация полученных клеток NOD/SCID мышам также показывает увеличение количества SRC, но не столь значительное (в 20 раз при использовании Angptl5 [82], в 6,2 раз при применении Delta1 [81] и в 17,6 раз при экспансии со StemRegenin1 [80]). Однако сравнение этих результатов между собой затруднено из-за различий в постановке экспериментов и в методах оценки. Кроме того, разница между количеством CD34+ клеток и SRC указывает на необходимость использования дополнительных методов для характеристики ГСК/ГПС.
Ex vivo экспансия ГСК/ГПК ПК
для клинического использования
При выборе методики экспансии ГСК/ГПК с целью последующей клинической трансплантации необходимо учитывать не только кратность увеличения числа гемопоэтических предшественников в эксперименте in vitro и их способность восстанавливать костномозговое кроветворение в эксперименте in vivo. Также требуется адаптировать протоколы экспансии для клинических масштабов и определить их безопасность для реципиента.
Для экспансии ГСК/ГПК в условиях эксперимента используют культуральные планшеты, флаконы или чашки Петри. Однако при культивировании больших объемов клеточной суспензии в статичных условиях встает проблема доставки питательных веществ и кислорода ко всем клеткам в культуре. Кроме того, необходим постоянный контроль концентрации кислорода и pH среды, так как эти показатели влияют на пролиферацию и дифференцировку ГСК/ГПК [89]. В связи с этим, для экспансии гемопоэтических предшественников с целью клинической трансплантации предложено применение биореакторов [89, 90]. В этих устройствах обеспечены постоянное перемешивание и оксигенирование питательной среды, а также возможен контроль ее pH и содержания кислорода. Помимо этого, использование биореакторов избавляет от необходимости манипуляций с многочисленными культуральными сосудами, что снижает риск контаминации культуры. Однако применение таких систем является очень дорогостоящим, требует больших объемов сред, высокой квалификации персонала и очень точного подбора условий культивирования. Поэтому более простой и распространенный метод экспансии ГСК/ГПК в клинических масштабах — использование газопроницаемых культуральных мешков [55, 66, 81, 91]. Такие мешки обеспечивают постоянный газообмен по всей поверхности и являются закрытой системой.
При экспансии ГСК/ГПК для клинического использования желательно избегать использования ксено-генных клеток и реагентов животного происхождения (в первую очередь, сывороток), так как это может привести к иммунному ответу со стороны реципиента. В связи с этим применяют бессывороточные питательные среды или среды на основе сыворотки крови человека, а также отказываются от фидерного слоя из ксеногенных клеточных линий или используют аутогенные клетки.
На настоящий момент проходят клинические испытания препаратов ГСК/ГПК ПК, полученных при экспансии с помощью некоторых из методик, перечисленных в разделе «Ex vivo экспансия ГСК/ГПК пу-повинной крови: существующие подходы» [81, 91]. Так, например, компания Gamida Cell опубликовала результаты I/II фазы клинических исследований препарата StemEx®, представляющего собой продукт экспансии ГСК/ГПК пуповинной крови с добавлением TEPA [91]. Образец ПК был разделен на две фракции, при этом из меньшей выделили CD133+ клетки с помощью магнитного сортера. Гемопоэтические предшественники культивировали в питательной среде aMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, цитокинов TPO, IL-6, Flt3L и SCF и TEPA. Экспансия проводилась в тефлоновых культуральных мешках в течение 21 сут. Полученные при экспансии клетки вводили через 24 ч после трансплантации большей некультивированной фракции того же образца. Количество ядросодержащих клеток в большинстве образцов составляло менее 2х107/кг. В исследовании участвовало 10 пациентов с онко-гематологическими заболеваниями, донорские образцы ПК имели несоответствия с реципиентами по 1—2 аллелям HLA. Среднее время восстановления количества нейтрофилов и тромбоцитов составило 30 и 48 дней соответственно, РТПХ III-IV степени выявлено не было, общая выживаемость на 100 день составила 90%. Все пациенты перенесли трансплантацию без осложнений.
Таким образом, экспансия ГСК/ГПК ПК может быть использована для увеличения количества ге-мопоэтических предшественников с целью клиниче-
ЛИТЕРАТУРА:
1. Thomas E.D., Lochte H.L., Lu W.C. et al. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N. Engl. J. Med. 1957; 257(11): 491-6.
2. Till J.E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat. Res. 1961; 14: 213-22.
3. Forsberg E.C., Prohaska S.S., Katzman S. et al. Differential expression of novel potential regulators in hematopoietic stem cells. PLoS Genet. 2005; 1(3): e28.
4. Schoemans H., Verfaillie C. Cellular biology of hematopoiesis. In: Hoffman R., Benz E.J., Shattil S.J. et al., editors. Hematology: Basic Principles and Practice. 5th edn. Part III. Philadelphia: Elsevier Churchill Livingston; 2008: 358-71.
5. Alenzi F.Q., Alenazi B.Q., Ahmad S.Y. et al. The haemopoietic stem cell: between apoptosis and self renewal. Yale J. Biol. Med. 2009; 82(1): 7-18.
6. Zhu J., Emerson S.G. Hematopoietic cytokines, transcription factors and lineage commitment. Oncogene 2002; 21(21): 3295-313.
7. Dahl R., Hromas R. Transcription factors in normal and malignant hematopoiesis. In: Hoffman R., Benz E.J. Jr., Shattil S.J. et al., editors. Hematology: Basic Principles and Practice. 5th edn. Part III. Philadelphia: Elsevier Churchill Livingston; 2008: 372-95.
8. Lessard J., Faubert A., Sauvageau G. Genetic programs regulating HSC specification, maintenance and expansion. Oncogene 2004; 23(43): 7199-209.
9. Haylock D.N., Nilsson S.K. Stem cell regulation by the hematopoietic stem cell niche. Cell Cycle 2005; 4: 1353-5.
ского применения. Однако необходимо решить целый ряд технических задач для культивирования клеток в объемах, которые требуются для трансплантации. Кроме того, важен строгий контроль применяемых методик для обеспечения безопасности пациентов.
Заключение
Изучение свойств гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток, а также возможностей их использования в клинике в настоящее время является актуальной и перспективной научной задачей. В качестве источника ГСК/ГПК на данный момент активно применяется пуповинная кровь. Она имеет ряд преимуществ перед другими источниками при наличии в образце необходимого количества гемо-поэтических предшественников, способных к хомингу и заселению КМ. Для определения количества и свойств этих клеток существует ряд in vitro и in vivo методов, позволяющих охарактеризовать ГСК/ ГПК и выделить среди этой неоднородной популяции клетки с наибольшим пролиферативным потенциалом, способностью мигрировать в КМ и длительно восстанавливать кроветворение реципиента. С этой целью активно изучается связь между фенотипом и функциональной активностью гемопоэтических предшественников in vitro и их поведением при экспериментальной и клинической трансплантации.
Основным недостатком ПК является небольшое абсолютное количество гемопоэтических предшественников. Для решения этой проблемы на основе накопленных знаний о механизмах самообновления и дифференцировки этих клеток разработан ряд методик для увеличения количества ГСК/ГПК без потери их биологических свойств. Однако необходимо проведение дальнейших исследований с целью адаптации этих методик для клинического применения, определения их эффективности и безопасности для пациентов.
Разработка методик характеристики и экспансии ГСК/ГПК является одной из приоритетных задач для банков ПК персонального хранения, так как это позволяет широко использовать криоконсервирован-ный образец в клинической практике.
10. Zhang C.C., Lodish H.F. Cytokines regulating hematopoietic stem cell function. Curr. Opin. Hematol. 2008; 15(4): 307-11.
11. Oh I.H., Kwon K.R. Concise review: multiple niches for hematopoietic stem cell regulations. Stem Cells 2010; 28(7): 1243-9.
12. Arai F., Hirao A., Ohmura M. et al. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell 2004; 118(2): 149-61.
13. Cerdan C., Bhatia M. Novel roles for Notch, Wnt and Hedgehog in hematopoesis derived from human pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 2010; 54(6-7): 955-63.
14. Delaney C., Ratajczak M.Z., Laughlin M.J. Strategies to enhance umbilical cord blood stem cell engraftment in adult patients. Expert. Rev. Hematol. 2010; 3(3): 273-83.
15. Hofmeister C.C., Zhang J., Knight K.L. et al. Ex vivo expansion of umbilical cord blood stem cells for transplantation: growing knowledge from the hematopoietic niche. Bone Marrow Transplant. 2007; 39(1): 11-23.
16. Peled A., Petit I., Kollet O. et al. Dependence of human stem cell engraftment and repopulation of NOD/SCID mice on CXCR4. Science 1999; 283(5403): 845-8.
17. Aiuti A., Webb I.J., Bleul C. et al. The chemokine SDF-1 is a chemoattractant for human CD34+ hematopoietic progenitor cells and provides a new mechanism to explain the mobilization of CD34+ progenitors to peripheral blood. J. Exp. Med. 1997; 185(1): 111-20.
18. Peled A., Kollet O., Ponomaryov T. et al. The chemokine SDF-1 activates the integrins LFA-1, VLA-4, and VLA-5 on immature human CD34( + ) cells: role in transendothelial/stromal migration and engraftment of NOD/SCID mice. Blood 2000; 95(11): 3289-96.
19. Avigdor A., Goichberg P., Shivtiel S. et al. CD44 and hyaluronic acid cooperate with SDF-1 in the trafficking of human CD34+ stem/ progenitor cells to bone marrow. Blood 2004; 103(8): 2981-9.
20. Christopherson K.W., Hangoc G., Broxmeyer H.E. Cell surface peptidase CD26/dipeptidylpeptidase IV regulates CXCL12/stromal cell-derived factor-1 alpha-mediated chemotaxis of human cord blood CD34+ progenitor cells. J. Immunol. 2002; 169(12): 7000-8.
21. Krause D.S., Fackler M.J., Civin C.I. et al. CD34: structure, biology, and clinical utility. Blood 1996; 87(1): 1-13.
22. Sutherland D.R., Anderson L., Keeney M. et al. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. J. Hematother. 1996; 5(3): 213-26.
23. Craig W., Kay R., Cutler R.L. et al. Expression of Thy-1 on human hematopoietic progenitor cells. J. Exp. Med. 1993; 177(5): 1331-42.
24. Yin A.H., Miraglia S., Zanjani E.D. et al. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood 1997; 90(12): 5002-12.
25. Encabo A., Mateu E., Carbonell-Uberos F. et al. CD34 + CD38-is a good predictive marker of cloning ability and expansion potential of CD34+ cord blood cells. Transfusion 2003; 43(3): 383-9.
26. Zanjani E.D., Almeida-Porada G., Livingston A.G. et al. Human bone marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multilineage expression that includes giving rise to CD34+ cells. Exp. Hematol. 1998; 26(4): 353-60.
27. Bhatia M., Bonnet D., Murdoch B. et al. A newly discovered class of human hematopoietic cells with SCID-repopulating activity. Nat. Med. 1998; 4(9): 1038-45.
28. Goodell M.A., Rosenzweig M., Kim H. et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat. Med. 1997; 3(12): 1337-45.
29. Wang J., Kimura T., Asada R. et al. SCID-repopulating cell activity of human cord blood-derived CD34- cells assured by intra-bone marrow injection. Blood 2003; 101(8): 2924-31.
30. Sonoda Y. Immunophenotype and functional characteristics of human primitive CD34-negative hematopoietic stem cells: the significance of the intra-bone marrow injection. J. Autoimmun. 2008; 30(3): 136-44.
31. Yahata T., Ando K., Sato T. et al. A highly sensitive strategy for SCID-repopulating cell assay by direct injection of primitive human hematopoietic cells into NOD/SCID mice bone marrow. Blood 2003; 101(8): 2905-13.
32. Kimura T., Asada R., Wang J. et al. Identification of long-term repopulating potential of human cord blood-derived CD34-flt3- severe combined immunodeficiency-repopulating cells by intra-bone marrow injection. Stem Cells 2007; 25(6): 1348-55.
33. Chen C.Z., Li M., de Graaf D. et al. Identification of endoglin as a functional marker that defines long-term repopulating hematopoietic stem cells. PNAS USA 2002; 99(24): 15468-73.
34. Balazs A.B., Fabian A.J., Esmon C.T. et al. Endothelial protein C receptor (CD201) explicitly identifies hematopoietic stem cells in murine bone marrow. Blood 2006; 107(6): 2317-21.
35. Wagers A.J. Stem cell grand SLAM. Cell 2005; 121(7): 967-70.
36. Challen G.A., Little M.H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells 2006; 24: 3.
37. Goodell M.A., Brose K., Paradis G. et al. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 1996; 183(4): 1797-806.
38. Liu H., Verfaillie C.M. Myeloid-lymphoid initiating cells (ML-IC) are highly enriched in the rhodamine-c-kit( + )CD33(-)CD38(-) fraction of umbilical cord CD34( + ) cells. Exp. Hematol. 2002; 30: 582.
39. McKenzie J.L., Takenaka K., Gan O.I. et al. Low rhodamine 123 retention identifies long-term human hematopoietic stem cells within the Lin-CD34+CD38- population. Blood 2007; 109: 543.
40. Arai F., Hirao A., Suda T. Regulation of hematopoietic stem cells by the niche. Trends Cardiovasc. Med. 2005; 15(2): 75-9.
41. Pierre-Louis O., Clay D., Brunet de la Grange P. et al. Dual SP/ALDH functionalities refine the human hematopoietic Lin-CD34+CD38- stem/progenitor cell compartment. Stem Cells 2009; 27(10): 2552-62.
42. Hess D.A., Meyerrose T.E., Wirthlin L. et al. Functional characterization of highly purified human hematopoietic repopulating cells isolated according to aldehyde dehydrogenase activity. Blood 2004; 104(6): 1648-55.
43. Christ O., Lucke K., Imren S. et al. Improved purification of hematopoietic stem cells based on their elevated aldehyde dehydrogenase activity. Haematologica 2007; 92(9): 1165-72.
44. Lioznov M.V., Freiberger P., Kröger N. et al. Aldehyde dehydrogenase activity as a marker for the quality of hematopoietic stem cell transplants. Bone Marrow Transplant. 2005; 35(9): 909-14.
45. Fallon P., Gentry T., Balber A.E. et al. Mobilized peripheral blood SSCloALDHbr cells have the phenotypic and functional properties of primitive haematopoietic cells and their number correlates with engraftment following autologous transplantation. Br. J. Haematol. 2003; 122: 99-108.
46. Yang H., Acker J.P., Cabuhat M. et al. Association of post-thaw viable CD34+ cells and CFU-GM with time to hematopoietic engraftment. Bone Marrow Transplant. 2005; 35(9): 881-7.
47. International standards for cord blood collection, processing, testing, banking, selection, and release. 3rd Edn; 2006.
48. Nadali G., de Wynter E.A., Perandin F. et al. Regulation of the proliferative potential of cord blood long-term culture-initiating cells (LTC-IC) by different stromal cell lines: implications for LTC-lC measurement. Haematologica 1998; 83(12): 1059-65.
49. Denning-Kendall P., Singha S., Bradley B. et al. Cobblestone area-forming cells in human cord blood are heterogeneous and differ from long-term culture-initiating cells. Stem Cells 2003; 21(6): 694-701.
50. Bhatia M., Wang J.C., Kapp U. et al. Purification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient mice. PNAS USA 1997; 94(10): 5320-5.
51. Chao N.J., Emerson S.G., Weinberg K.I. Stem cell transplantation (cord blood transplants). Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2004; 354-71.
52. Gammaitoni L., Weisel K.C., Gunetti M. et al. Elevated telomerase activity and minimal telomere loss in cord blood long-term cultures with extensive stem cell replication. Blood 2004; 103(12): 4440-8.
53. Harris D.T., Schumacher M.J., Locascio J. et al. Phenotypic and functional immaturity of human umbilical cord blood T lymphocytes. PNAS USA 1992; 89(21): 10006-10.
54. Rocha V., Gluckman E. Eurocord-Netcord registry and European Blood and Marrow Transplant group. Improving outcomes of cord blood transplantation: HLA matching, cell dose and other graft- and transplantation-related factors. Br. J. Haematol. 2009; 147(2): 262-74.
55. Koestenbauer S., Zisch A., Dohr G. et al. Protocols for hematopoietic stem cell expansion from umbilical cord blood. Cell Transplant. 2009; 18(10): 1059-68.
56. Gluckman E., Rocha V. Cord blood transplantation: state of the art. Haematologica 2009; 94(4): 451-4.
57. Laughlin M.J., Eapen M., Rubinstein P. et al. Outcomes after transplantation of cord blood or bone marrow from unrelated donors in adults with leukemia. N. Engl. J. Med. 2004; 351(22): 2265-75.
58. Gilner J.B., Walton W.G., Gush K. et al. Antibodies to stem cell marker antigens reduce engraftment of hematopoietic stem cells. Stem Cells 2007; 25(2): 279-88.
59. Kobayashi M., Laver J.H., Lyman S.D. et al. Thrombopoietin, steel factor and the ligand for flt3/flk2 interact to stimulate the proliferation of human hematopoietic progenitors in culture. Int. J. Hematol. 1997; 66(4): 423-34.
60. Herrera C., Sánchez J., Torres A. et al. Early-acting cytokine-driven ex vivo expansion of mobilized peripheral blood CD34+ cells generates post-mitotic offspring with preserved engraftment ability in non-obese diabetic/severe combined immunodeficient mice. Br. J. Haematol. 2001; 114(4): 920-30.
61. Zandstra P.W., Conneally E., Petzer A.L. et al. Cytokine manipulation of primitive human hematopoietic cell self-renewal. PNAS USA 1997; 94(9): 4698-703.
62. Berger M., Fagioli F., Piacibello W. et al. Role of different medium and growth factors on placental blood stem cell expansion: an in vitro and in vivo study. Bone Marrow Transplant. 2002; 29(5): 443-8.
63. Henschler R., Brugger W., Luft T. et al. Maintenance of transplantation potential in ex vivo expanded CD34( + )-selected human peripheral blood progenitor cells. Blood 1994; 84(9): 2898-903.
64. Kobari L., Pflumio F., Giarratana M. et al. In vitro and in vivo evidence for the long-term multilineage (myeloid, B, NK, and T) reconstitution capacity of ex vivo expanded human CD34+ cord blood cells. Exp. Hematol. 2000; 28(12): 1470-80.
65. Donaldson C., Denning-Kendall P., Bradley B. et al. The CD34( + ) CD38(neg) population is significantly increased in haemopoietic cell expansion cultures in serum-free compared to serum-replete conditions: dissociation of phenotype and function. Bone Marrow Transplant. 2001; 27(4): 365-71.
66. Shpall E.J., Quinones R., Giller R. et al. Transplantation of ex vivo expanded cord blood. Biol. Blood Marrow Transplant. 2002; 8(7): 368-76.
67. Mohamed A.A., Ibrahim A.M., El-Masry M.W. et al. Ex vivo expansion of stem cells: defining optimum conditions using various cytokines. Lab. Hematol. 2006; 12(2): 86-93
68. Robinson S.N., Ng J., Niu T. et al. Superior ex vivo cord blood expansion following co-culture with bone marrow-derived mesenchymal stem cell. Bone Marrow Transplant. 2006; 37(4): 359-66.
69. Wagner W., Roderburg C., Wein F. et al. Molecular and secretory profiles of human mesenchymal stromal cells and their abilities to maintain primitive hematopoietic progenitors. Stem Cells 2007; 25(10): 2638-47.
70. Kadereit S., Deeds L.S., Haynesworth S.E. et al. Expansion of LTC-ICs and maintenance of p21 and BCL-2 expression in cord blood CD34+/CD38- early progenitors cultured over human mscs as a feeder layer. Stem Cells 2002; 20(6): 573-82.
71. Mishima S., Nagai A., Abdullah S. et al. Effective ex vivo expansion of hematopoietic stem cells using osteoblast-differentiated mesenchymal stem cells is CXCL12 dependent. Eur. J. Haematol. 2010; 84(6): 538-46.
72. Jang Y.K., Jung D.H., Jung M.H. et al. Mesenchymal stem cells feeder layer from human umbilical cord blood for ex vivo expanded growth and proliferation of hematopoietic progenitor cells. Ann. Hematol. 2006; 85(4): 212-25.
73. Yildirim S., Boehmler A.M., Kanz L. et al. Expansion of cord blood CD34+ hematopoietic progenitor cells in coculture with autologous umbilical vein endothelial cells (HUVEC) is superior to cytokine-supple-mented liquid culture. Bone Marrow Transplant. 2005; 36(1): 71-9.
74. Ehring B., Biber T.M., Upton T.M. et al. Expansion of HPCs from cord blood in a novel 3D matrix. Cytotherapy 2003; 5: 490-9.
75. Feng Q., Chai C., Jiang X.S. et al. Expansion of engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells in three-dimensional scaffolds with surfaceimmobilized fibronectin. J. Biomed. Mater. Res. 2006; 78: 781-91.
76. Takagi M., lemoto N., Yoshida T. Effect of concentrations of murine stromal and hematopoietic cells on the progenitors expansion in their three-dimensional coculture in nonwoven fabrics. J. Biosci. Bioeng. 2002; 94(4): 365-7.
77. Okamoto T., Takagi M., Soma T. et al. Effect of heparin addition on expansion of cord blood hematopoietic progenitor cells in three-dimensional coculture with stromal cells in nonwoven fabrics. J. Artif. Organs. 2004; 7(4): 194-202.
78. Purton L.E., Bernstein I.D., Collins S.J. All-trans retinoic acid delays the differentiation of primitive hematopoietic precursors (lin-c-kit + Sca-1( + )) while enhancing the terminal maturation of committed granulocyte/monocyte progenitors. Blood 1999; 94(2): 483-95.
79. Peled T., Landau E., Prus E. et al. Cellular copper content modulates differentiation and self-renewal in cultures of cord blood-derived CD34+ cells. Br. J. Haematol. 2002; 116(3): 655-61.
80. Boitano A.E., Wang J., Romeo R. et al. Cooke M.P. aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science 2010; 329(5997): 1345-8.
81. Delaney C., Heimfeld S., Brashem-Stein C. et al. Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution. Nat. Med. 2010; 16(2): 232-6.
82. Drake A.C., Khoury M., Leskov I. et al. Human CD34+ CD133+ hematopoietic stem cells cultured with growth factors including angptl5 efficiently engraft adult NOD-SCID Il2rc2/2 (NSG) mice. PLoS One 2011; 6(4): e18382.
83. Trevis A., Peled T., Rosen O., inventors; Gamida-Cell Ltd., assignee. Ex-vivo expansion of hematopoietic stem cell populations in mononuclear cell cultures. AU patent 2005200679. 2005 Feb16.
84. De Felice L., Tatarelli C., Mascolo M.G. et al. Histone deacetylase inhibitor valproic acid enhances the cytokine-induced expansion of human hematopoietic stem cells. Cancer Res. 2005; 65(4): 1505-13.
85. Milhem M., Mahmud N., Lavelle D. et al. Modification of hematopoietic stem cell fate by 5aza 2'deoxycytidine and trichostatin A. Blood 2004; 103(11): 4102-10.
86. Yang M., Li K., Ng P.C. et al. Promoting effects of serotonin on hematopoiesis: ex vivo expansion of cord blood CD34+ stem/progenitor cells, proliferation of bone marrow stromal cells, and antiapoptosis. Stem Cells 2007; 25(7): 1800-6.
87. Himburg H.A., Muramoto G.G., Daher P. et al. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat. Med. 2010; 16(4): 475-82.
88. Pirih F.Q., Michalski M.N., Cho S.W. et al. Parathyroid hormone mediates hematopoietic cell expansion through interleukin-6. PLoS One 2010; 5(10): e13657.
89. Kowalczyk M., Waldron K., Kresnowati P. Process challenges relating to hematopoietic stem cell cultivation in bioreactors. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2011; 38(7): 761-7.
90. Nielsen L.K. Bioreactors for hematopoietic cell culture. Annu. Rev. Biomed. Eng. 1999; 1: 129-52
91. de Lima M., McMannis J., Gee A. et al. Transplantation of ex vivo expanded cord blood cells using the copper chelator tetraethylenepentamine: a phase l/ll clinical trial. Bone Marrow Transplant. 2008; 41(9): 771-8.
Поступила 18.07.2012
