CC BY
134
УДК 543.219
О.В. СКРОПИШЕВА, В.П. ГН1ДЕЦЬ, В.А. ЛИСЕНКО
Херсонський нащональний техшчний ушверситет
СУЧАСН1 МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ АМ1НОКИСЛОТ В ХАРЧОВИХ ПРОДУКТАХ
Для визначення та аналгзу амтокислот харчових продуктах дослгджено
спектрофотометричний метод з використанням н1нг1дриново1 реакцИ у фосфатно-буферному розчин г1дрофосфату та диггдрофосфату калЮ, який об'еднуе в собг точнкть, селективнкть та вгдтворювангсть в процесi аналгзу. Головною перевагою цього методу е здаттсть до аналгзування слабо забарвлених чи розбавлених розчитв, як не можливо проаналгзувати тшими методами.
Встановлено, що: оптимальними параметрами проведення нтггдриново1 реакцИ для визначення концентрацИ амгнокислот у фосфатно-буферному розчиш е температура 70°С, тривалгсть нагргву 1030 хв. Побудован графжи залежностг оптичног щшьностг розчитв тнггдриново1 реакцИ амгнокислот вгд концентрацИ стандартних розчингв амтокислот : глутамгновог, лгзину, глщину та аргтгн глутамату з концентращею амтокислот 0,5*10-9 - 20*10'9 моль/л.
Ключовг слова: амтокислоти, спектрофотометричний метод, тнггдринова реакцгя.
Е.В. СКРОПЫШЕВА, В.П. ГНИДЕЦ, В.А. ЛЫСЕНКО
Херсонский национальный технический университет
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
Для определения и анализа аминокислот в пищевых продуктах исследовано спектрофотометрический метод с использованием нингидриновой реакции в фосфатно-буферном растворе гидрофосфата и дигидрофосфата калия, который объединяет в себе точность, избирательность и воспроизводимость в процессе анализа. Главным преимуществом этого метода является способность к анализу слабо окрашенных или разбавленных растворов, которые невозможно проанализировать другими методами.
Установлены оптимальные параметры проведения нингидриновой реакции для определения концентрации аминокислот в фосфатно-буферном растворе: температура 70 ° С, продолжительность нагрева 10-30 мин. Построены графики зависимости оптической плотности растворов нингидриновой реакции аминокислот от концентрации стандартных растворов аминокислот: глутаминовой, лизина, глицина и аргинин глутамата с концентрацией аминокислот 0,5 * 10-9 - 20 * 10-9 моль /л.
Ключевые слова: аминокислоты, спектрофотометрический метод, нингидриновая реакция.
EV. SKROPYSHEVA, V.P. HNIDETS, V.A. LYSENKO
Kherson National Technical University
MODERN METHODS OF DETERMINATION OF AMINO ACIDS IN FOODSTUFFS
To determine and analyze amino acids in food, a spectrophotometry method was studied using a ninhydrin reaction in a phosphate-buffered solution of hydrophosphate and potassium dihydrogen phosphate, which combines accuracy, selectivity and reproducibility in the analysis. The main advantage of this method is the ability to analyze slightly colored or diluted solutions, which can not be analyzed by other methods.
The optimal parameters for the ninhydrin reaction to determine the concentration of amino acids in the phosphate buffer solution were established: temperature 70 ° C, heating time 10-30 min. The dependences of the optical density of the solutions of the ninhydrin reaction of amino acids on the concentrations of standard solutions of amino acids glutamine, lysine, glycine and arginine of glutamate with an amino acid concentration of 0.5 * 10-9 - 20 * 10-9 mol /1 are plotted.
Keywords: amino acids, spectrophotometric method, ninhydrin reaction.
Постановка проблеми
Харчування e одшею з основних умов юнування людини та важливим еколопчним фактором який визначае и здоров'я. Своечасне, повноцшне та збалансоване харчування створюе умови для нормального ф1зичного i розумового розвитку, впливае на працездатнють та на здатшсть оргашзму протистояти впливу несприятливих факторiв навколишнього середовища.
Яюсть продукпв харчування е не менш важливим фактором, що мютить в соб1 ряд властивостей { характеристик, продовольчо! сировини та харчових продукпв, як визначаютъ здатшсть задовольнити ф1зюлопчт потреби людини при звичайних умовах !х використання.
Визначення якост харчового продукту е нелегким аналпичним завданням в якому враховуетъся юльюсть компонента з яких складаетъся речовина, агрегатний стан та фвичт властивост! Яксть харчово!сировини або готово! продукцп визначаетъся тсля проведення комплексного дослщження, що складаетъся з ф1зичного, х1м1чного, мшробюлопчного, ф1зико-х1м1чного 1 бактер1алъного анал1зу[1,2,3,4].
Серед велико! кшькосп харчових продукта найбшьший попит мають плоди та овоч1, а також продукти !х переробки, оскльки вони мстить необх1дт компоненти для життед1ялъност1 оргашзму: вгтамши; незамшт амшокислоти; оргатчт кислоти; макро- 1 мжроелементи[5].
Визначення амшокислот е важливим аналпичним завданням при визначент якост харчового продукту, оскльки 1з загалъних бюх1м1чних параметр1в концентращя амшокислот найбшьш адекватний показник якост!
Аналiз останнiх досл1джень i публiкацiй
Амшокислоти у сво1й будов1 одночасно мютятъ кислу карбоксилъну групу - СООН 1 основну амшогрупу - КН2 та е основними складовими бшюв живих оргашзм1в. Вивчення залишюв мжрооргатзм1в в кремшевих осадах за допомогою рубщш-цезшового методу датування, як мстять вуглецъ 1з докембршського геолопчного перюду, доводить що термш юнування амшокислот на нашш планет складае бшьше трьох мшьярд1в рокв.
Найчаспше, термш «Амшокислота» використовуеться для позначення а-амшокислоти у яко1 амшогрупа знаходиться в а-положенш до карбоксильно! групи. Також вщом1 амшокислоти, у яких амшо- та карбоксильт групи роздшент декшькома атомами вуглецю - так кислоти називають р -, у- 1 5-амшокислотами.
СН3-СН-СООН а-а\пнопропюнова кислота
Н2]Х-СН,-СН,-СООН |5-а\пнопроп1онова кислота
Н2Х-СН,-СН2-С'Н2-СООН у-амшомасляна кислота
Н2Х-(СН,) 5-СООН б-а\пнокапронова кислота
За ф1зичними властивостями амшокислота тверда та безбарвна кристал1чна речовина з високою температурою плавлення, вщ 230 до 280°С. Бшьшють амшокислот дуже добре розчиняються в вод1 але погано або зовс1м не розчиняються оргатчними розчинниками. Деяк амшокислоти можуть бути солодкими, а деяк пркими. Завдяки тому, що амшокислоти одночасно володшть амшогрупою з 11 основними властивостями та карбоксильною групою з кислотними властивостями, реакщя водних розчишв одноосновних амшокислот майже завжди близька до нейтрально!. Висока температура плавлення, гарна розчиншсть у вод1, електропров1дт можливост водних розчишв, вщсутшсть лшш в спектра як характерт для карбоксильно! групи та амшогрупи, пояснюеться тим, що молекули а-амшокислот представляють собою внутршш сол1 (бшолярт юни), як утворюються за рахунок переходу протона вщ карбоксильно! групи до ам1ногрупи.
ЩЧ-СН, — с^
о" або
Н31Ч-СН2 — С:
о
В залежност вщ середовища, так юни ведуть себе по р1зному: в кислому середовищ1, коли вщбуваеться пониження процесу дисощацп карбоксильно! групи, юн веде себе як катюн, а в лужному -як атон. Р1вень кислотного середовища, при якому молекула амшокислоти нейтральна, тобто, концентращя катютв та анюшв знаходиться у р1вноваз1, а концентрац1я бшолярного юна максимальна 1 передача електричного заряду не вщбуваеться, називаеться 1зоелектричною точкою (р1). Р1вень кислотного середовища (рН) напряму впливае на р1вень р1вноваги.
Амшокислоти проявляють основш та кислотн властивост!, оскльки в молекул! амшокислоти одночасно мютяться карбоксильна група 1 амшогрупа. Для а-амшокислоти при взаемодп з юнами важких метал1в характерне утворення внутршньокомплексних солей. Завдяки утворенню глибокому синьому кольору, комплекси мщ (II) використовують в так названих б1уретових реакщях - для виявлення наявност а-амшокислоти вах бшк1в та продукта 1х пдрол1зу. Пдроксид м1д1 (II) у реакци з двома молекулами а-ам1нооцтово! кислоти утворюе м1дну с1ль гл1цину штенсивного синього кольору.
Утворення полiпептидiв вщбуваеться за рахунок створення пептидного зв'язку мiж a -карбоксильною групою одше'1 амшокислоти та амшогрупою шшо'!. В проце^ утворення пептидного зв'язку вщбуваеться вщокремлення молекули води [4,5].
nh2—сн2—co[i
он + nh2
—сн,—соон-
-н2о
-н2о
-н2о
nh2—сн5—
со —nh
со — nh
—сн3— со
он + nh2
—сн2—соон
-н2о
nh?—сн?— co —nh — сн?— со—nh — сн7— соон
Амiнокислоти - це бюлопчно активнi речовини, якi е життево важливими для росту, розвитку та функцюнування людського оргашзму. Широко використовують амiнокислоти в медицинi, як лжарсью препарати в харчовiй промисловостi, у якоот бiологiчно активних добавок та сировини для ix виробництва, як продукти спортивного харчування та ш. [4,5].
Основним джерелом a-амiнокислот для живого оргашзму слугують xарчовi бшки, якi гiдролiзуються органiзмами до амшокислот. Завдяки ферментативному гiдролiзу в шлунково-кишковому, xарчовi бiлки видшяють a-амiнокислоти. Отриманi таким чином a-амшокислоти являють собою структурну xiмiчну одиницю, яка приймае участь при сиш^ бiлка в органiзмi людини. Завдяки тому, що бшки приймають участь у вшх процесах оргашзму, а a-амшокислоти е будiвельним матерiалом для ix синтезу, можна говорити що амшокислоти е важливими елементами в житл людини [ 5].
В органiзмi людини зустрiчаeться близько 150 амшокислот, але для синтезу нових бшюв потрiбно лише 20. Потрiбнi для синтезу бшка амiнокислоти роздiляють на двi групи. Амшокислоти, що потрапляють до оргашзму з 1жею або як при вщсутност ix в 1ш, можуть синтезуватися оргашзмом з iншиx амшокислот, за умови, якщо в органiзмi вистачае матерiалу, класифiкують як замшш амiнокислоти [3]. Амiнокислоти, якi оргашзм не здатен синтезувати самостiйно, а потрапляння ix до оргашзму вщбуваеться тшьки через продукти харчування, називають незамшними амiнокислотами [3,4].
Таблиця 1
Замшш амшокислоти Незамшш амiнокислоти
Аланш Валiн
Аргшш Пстидин
Аспарагш 1золейцин
Аспарагiнова кислота Лейцин
Глiцин Лiзин
Глутамш Метiонiн
Глутамiнова кислота Треонш
Пролiн Трiптофан
Серин Фенiлаланин
Тирозин
Цистин
О^м участi в створеннi нових бшюв, амiнокислоти беруть участь у робо^ головного мозку та використовуються в ролi нейромедiаторiв, транслюючи ^зь себе нервовi iмпульси мiж клггинами. Вплив амiнокислот розповсюджуеться на пам'ять, увагу, штелект, збудливiсть центрально! нервово! системи, психiчну стiйкiсть та актившсть, рiвновагу настрою. Дефiцит амiнокислот викликае втрату тонусу м'язiв, сприяе виникненню дисбалансу в процесах органiзму, який з часом перетворюеться у хвороби [3,4,5].
Сукупшсть властивостей продукцп, як обумовлюють 11 придатнiсть для задоволення конкретних потреб у вщповщному зазначеш, називають якiстю харчових продуктiв [2]. На сьогодшшнш день iснуе безлiч аналiтичних методiв за допомогою яких вщбуваеться оцiнка якостi того чи шшого харчового продукту. Такi методи визначення складу i властивостей харчових продук^в складаються як з кшьюсних - хiмiчних та фiзико-хiмiчних методiв, так i з суб'ективних органолептичних методiв аналiзу. Яюсть харчових продуклв чiтко характеризуеться в стандартах, i частiше використанi методи визначення категорш якостi, обгрунтоваш на зазначенi граничних ознак, що дозволяють вiднести об'ект дослщження тiльки до конкретного рiвня якостi.
У визначеннi якостi продукту вщсутш достовiрнi критерп оцiнки якост та збереження харчових продуктiв. Цю проблему можна вирiшити за допомогою кшьюсно! оцiнки якостi i збереження продукту
при визначенш широкого спектру метабол1чно-активних ендогенних сполук у продуктах. Шформатившсть останшх визначаеться не тшьки !х бюлопчною щнтстю, але й р1внями штеграцп та регуляци процеав обмшу речовин в оргашзм!, вщображенням яких виступають щ показники. Насамперед, вказаним вимогам вщповщае фонд в1льних амшокислот та !х високоактивних метаболтв, головною роллю яких е штеграц1я основних метабол1чних потоков.
При визначеш модел оцшки якосп продукту, фонд вшьних амшокислот розглядають як гетерогенну систему функцюнально та метабол1чно взаемозв'язаних з'еднань. Технолопчний процес виробництва та збертання призводить до змши в сшввщношенш органолептичних, ф1зико-х1м1чних 1 структурно -мехатчних властивостях харчових продукпв. Щ змши впливають на вмют вшьних амшокислот та !х похщних. Визначеш змши вмюту вшьних амшокислот, е достов1рним критер1ям для оцшки якосп харчового продукту. В результат! змша показника ввд нормального, тобто, зниження показника, слугуе сигналом неяк1сного продукту [3].
Анал1з амшокислот е не менш важливим процесом шж !х рол! в життед!яльност! оргашзму. Завдяки важливосп учасп амшокислот в бюлопчних процесах, методи к1льк1сного визначення амшокислот викликають пост1йний 1нтерес. Методи оц1нки вм1сту в1льних ам1нокислот та !х похвдних використовуються в харчов1й промисловост1, громадському харчуванн1 та сан1тарн1й г1г1ен1, 1 можуть бути використаними для оцшки якост1 при збер1ганн1 харчових продукпв. Про як1сть судять по шлькосп абсолютно незам1нних кислот та !х сп1вв1дношенню з загальною к1льк1стю вшьних амшокислот, яш м1стяться в продукта Про збережен1сть харчового продукту судять по кшькосп вшьних амшокислот-глутамшу та аспараг1ну в ньому. Визначення якосп б1лкового продукту по вмюту в1льних ам1нокислот в продукт1 потребуе менше часу для проведения анал1зу. Метод е б1льш достов1рним за рахунок визначення великого спектру бюлопчно активно! субстанцИ конкретного харчового продукту [6].
На сьогодш 1снуе дуже велика к1лькост1 метод1в к1льк1сного визначення амшокислот. Всю р1зномаштшсть таких метод1в розпод1ляють на чотири основн1 групи: електрох1м1чш; хроматограф1чн1; титриметричн1 та спектрофотометричш методи анал1зу [6,7,8,9,10].
Електрох1м1чн1 методи анал1зу ам1нокислот, так1 як полярограф1чш, вольт- амперометричн1 та потенц1ометричн1 методи, завдяки свош точност1, набули велико! популярносп за останн1 роки [6].
Таш методи основан! на електрох!м!чних явищах як1 в!дбуваються п!д час дослщження речовини. В результат! анал!зують зм!ни х!м!чно! структури, ф!зичних властивостей чи концентрацп речовини, ! вже по результатах змш роблять висновки. Електрох!м!чн! методи е методами як яшсного так ! к1льк!сного анал!зу ам!нокислот. Треба зауважити, що часпше !х використовують в визначен! окремих а-амшокислот [6,11,12].
Хроматограф!чн! методи анал!зу ам!нокислот основан! на розпод!ленн! компоненпв м!ж рухомою та нерухомою фазою. Нерухомою фазою слугуе так названий сорбент - тверда пориста речовина чи пл!вка рщини, яка нанесена на тверду речовину. Рухомою фазою е рщина чи газ, як! пропкають через нерухому фазу, школи п!д надм!рним тиском. Для визначення амшокислот використовують один !з вид!в хроматограф!! - газор!динну хроматограф!ю (ГРХ). Газова та високоефективна рщинна хроматограф!я е б!льш ефективними методами, але через велику щну обладнання, б!льш!сть лаборатор!й не можуть соб! дозволити використання саме цих метод!в анал!зу[7].
Титрометричн! методи анал!зу ам!нокислот базуються на визначенш об'ему розчину з точною вщомою концентрац!ею титранту, витраченого на взаемод!ю з речовиною яка визначаеться. Амшокислоти вщносяться до речовин як! дуже погано титруються у вод! через слабш кислотно -основш властивост! та слабку розчинн!сть.
Спектрофотометричш методи анал!зу е найб!льш популярними при к!льк!сному анал!з! а-амшокислот. Данн! методи основан! на здатносп ам!нокислот, або продукт!в !х взаемодп з конкретним реагентами утворювати забарвлеш сполуки, як! поглинають певн! обласп видимого спектру св!тла.
Спектрофотометричн! методи анал!зу е простими у виконанш, ! мають високу точн!сть визначення. Розробка простих та точних спектрофотометричних метод!в анал!зу ам!нокислот е нелегким, але важливим аналггичним завданням. Це обумовлено важливою роллю самих амшокислот в бюлопчних процесах орган!зму. Наприклад, для визначення цисте!ну, який бере участь в реакщях транс -амшування та обмшу с!рки в оргашзм^ розроблена методика к!льк!сно! оц!нки цисте!ну в б!олог!чних р!динах, яка основана на його окисно-вщновних можливостях з солями зал!за (III) в присутносп 1,10-фенантрол!ну, з наступним спектрофотометричним визначенням продукту реакцп. Деяк! методи мають виключення в процес! виявлення та анал!з! а-ам!нокислот. Наприклад, метод спектрофотометричного визначення сумарного вм!сту ам!нокислот в сироватщ кров!, який оснований на метод! шльшсно! оц!нки продукту реакцп амшокислоти з ортофталевим альдег!дом, мае високу чутливють та дозволяе кшьшсно визначити вс! а-ам!нокислоти за виключенням цистину, прол!ну ! оксипрол!ну. Це характеризуемся тим, що продукт реакцп визначаеться спектрофотометричним методом в присутносп меркаптоетанолу при довжин! хвил! 340нм [12,13].
Для визначення та aнaлiзy aмiнoкислoт, на oснoвi aнaлiзy лiтеpaтypниx даних, бyлo oбpaнo спектpoфoтoметpичний метод з викopистaнням нiнгiдpинoвoï pеaкцГí a-aмiнoкислoт, який oб'eднye в co6í точшсть, селективнгсть та вiдтвopювaнiсть в npo^ri aнaлiзy. Гoлoвнoю пеpевaгoю цьoгo методу e здатнгсть дo aнaлiзyвaння слaбo зaбapвлениx чи poзбaвлениx poзчинiв, якг немoжливo пpoaнaлiзyвaти гншими метoдaми.
Формулювання мети дослщження
Метoю poбoти 6ули oбrpyнтyвaння та вибip найбгльш oптимaльниx лaбopaтopниx метoдик визначення aмiнoкислoт в xapчoвиx пpoдyктax.
Для дoсягнення пoстaвленoï мети неoбxiднo бyлo виpiшити такг задачг:
1. Пpoвести визначення oптимaльниx yмoв пpoведення нiнгiдpинoвoï pеaкцГí aмiнoкислoт.
2. Пoбyдyвaти кaлiбpyвaльнi гpaфiки для визначення гpaничниx кoнцентpaцiй a-aмiнoкислoт.
Пpи виpiшеннi пoстaвлениx y po6o^ завдань були викopистaнi фiзикo -хгмгчнг метoди
дoслiджень, якг дoзвoляють oб'eктивнo oцiнювaти якгснг xapaктеpистики xapчoвиx пpoдyктiв на пгдставг експеpиментaльнo oдеpжaниx даних.
Викладення основного матерiалy дoслiджень
Реакцгя нiнгiдpинy з a-aмiнoкислoтaми e вдомим метoдoм аналгзу aмiнoкислoт. У npo^ri аналгзу нiнгiдpин з a-aмiнoкислoтaми yтвopюe зaбapвлений бapвниx, кoнцентpaцiю якoгo мoжнa аналгзувати на спектpoфoтoметpичнoмy oблaднaннi. Н^^идова pеaкцiя пpoтiкae за сxемoю oкиснювaльнoгo дезамгнування [14]. Oкисникoм виступае теткин, який як тpикетoнoм гз сильнoaкцептopними гpyпaми бгля центpaльнoгo кapбoнiлy та гснуе y гiдpaтнiй фopмi. ^и цьoмy aмiнoгpyпa oкиснюeться дo aмoнiaкy, а нiнгiдpин вiднoвлюeться дo дикетoгiдpoксигiдpинденy. Oднoчaснo вгдбуваеться декapбoксилювaння COOH-гpyпи i yтвopення альдеггду з aмiнoкислoти. Утвopений aмoнiaк взaeмoдie з вiднoвленим н^г^итом та дpyгoю мoлекyлoю нiнгiдpинy з yтвopенням вiдпoвiднoгo бapвникa синьo-фioлетoвoгo m^bopy, яку називають „фюлетовий Руемана". Вмгст бapвникa y aнaлiзyeмo му poзчинi визначають спектpoфoтoметpичним метoдoм. Чутливгсть нiнгiдpинoвoï pеaкцГí дoстaтньo висoкa (виявлення aмiнoкислoти стaнoвить дo 1 нмоль (1 наномоль = 10-9 моль) Цю pеaкцiю зaстoсoвyють тaкoж для xpoмaтoгpaфiчнoгo aнaлiзy нaявнoстi aмiнoкислoт пpи xpoмaтoxpaфГí на пaпеpi
[13].
Cеpед усгх poзpoблениx метoдiв спектpoфoтoметpичнoгo aнaлiзy з викopистaнням нiнгiдpинoвoï pеaкцГí, oкpемi yмoви пpoведення таких pеaкцГí мoжyть в^гз^тися вгд гнших [9,11,12]. Дo таких yмoв вiднoситься: темпеpaтypa викoнaння pеaкцiï; тpивaлiсть нaгpiвaння; piвень кислoтнoстi; ма^ва кшькгсть pеaгентy. Bиxoдячи з ^oro, для пpoведення нiнгiдpинoвoï pеaкцГí тpебa визначити oптимaльнi yмoви пpи яких спектpoфoтoметpичний аналгз надасть мaксимaльнo якгсний pезyльтaт.
Пpoвoдячи визначення oптимaльниx yмoв пpoведення нiнгiдpинoвoï pеaкцГí, слгд визначити i yмoви пpoведення вимipювaння oптичнoï щiльнoстi, а саме, дoвжинy хвилг на якгй буде вимipювaтися ornrarn щшьшсть дoслiджyвaниx зpaзкiв.
Визначення кoнцентpaцiï aмiнoкислoт y poзчинax нами бyлo пpoведенo на зpaзкax aмiнoкислoт, як шиpoкo пpисyтнi y xapчoвиx пpoдyктax - глyтaмiнoвiй aмiнoкислoтi, aмiнoкислoтax лгзинг та глщиш. Аналгз poзчинiв пpoдyктiв pеaкцГí aмiнoкислoт та нiнгiдpинy пpoвoдили y фoсфaтнo-бyфеpнoмy poзчинi гiдpoфoсфaтy та дигiдpoфoсфaтy калгю пpи pH 6,6.
Для визначення дoвжини хвилг аналгзу кoнцентpaцiï aмiнoкислoт y poзчинax гoтyвaли сеpГí poзчинiв з кoнцентpaцieю aмiнoкислoт 1*1 G-9 - 20*10-9 мoль/л та встaнoвлювaли дoвжинy хвилг зг стабгльним пoкaзникoм oптичнoï щг^ьгость Пpи пpoведенi дoслiдження, викopистoвyвaли oтpимaнi oптимaльнi yмoви пpoведення нiнгiдpинoвoï pеaкцiï: темпеpaтypy i тpивaлiсть нaгpiвaння. Пгсля pеaкцГí дoслiджyвaнi poзчини набувають ^rno-фioлетoвoгo кoльopy. Oxoлoдивши poзчини дo 2G°C, пpoвoдили вимipювaння 1'х om^ro'i щiльнoстi в дiaпaзoнi 32G - 75G нм дoвжинax хвиль. В я^стг кoнтpoльнoгo зpaзкy викopистoвyвaли poзчин фoсфaтнoгo бyфеpy.
Для aнaлiзy oтpимaниx дaниx тa вибopy oптимaльнoï дoвжини xßrai пpи дoслiдженi бyдyвaли гpaфiки зaлежнoстi oптичнoï щiльнoстi oбpaниx aмiнoкислoт вщ ïx кoнцентpaцiï тa дoвжини xвилi (pис.1
- 3).
Як видш з нaведениx дaниx дoслiджyвaнi poзчини мaють двa пiки oптичнoï щ^льдосп, нa пoзнaчцi 400 нм тa 540-570 нм. У випaдкax мaлoï кoнцентpaцiï aмiнoкислoт в poзчинi га дoвжинi xвилi 4OO нм вщсутне мaксимaльне пoглинaння y видимiй oблaстi спектpy. Виxoдячи з цьoгo, для пpoведення визнaчення oптичнoï щiльнoстi дoслiджyвaниx poзчинiв, бyлa вибpaнa дoвжинa xвилi 540 нм фoтoметpичнoгo пpилaдy, ocr^em вoнa мae бiльш чiткий тa стaбiльний пoкaзник пpи мaлiй кoнцентpaцiï aмiнoкислoт в poзчинi.
Рис. 1. Зaлежмicть оптично'1 щiльнicть розчину n^yTaMiHOBOÏ кислоти в1д ïï Konueurpaulï Ta довжини хви. ii
Рис. 2. Зaлежнicть оптично'1 щ1льн1сть розчину л1зину в1д ÏÏ концентрaцiï тa довжини хвил1
Рис. 3. Зaлежнicть оптично'1 щшьшсть розчину гл1цину в1д ïï концентрaцïï тa довжини хвил1
Гoлoвнoю yмoвoю пpoведення взaeмoдiï a-aмiнoкислoти з нiнгiдpинoм e нaгpiв сyмiшi, тoмy не менш вaжливим e визнaчити oптимaльнy темпеpaтypy пpи якiй мoжливo пpoвoдити всi дoслiдження пpи yчaстi нiнгiдpинoвoï pеaкцiï. Лiтеpaтypнi джеpелa [9-13] свiдчaть, щo для piзниx спектpoгpaфiчниx метoдiв визнaчення aмiнoкислoт pеaкцiю yтвopення бapвникa пpoвoдять пpи кипятiннi poзчинiв (габл.2.).
Тaблиця 2
Умови проведення ншпдриново'1 реaкцiï визнaчення aмiнокиcлот рнними _спектрофотометричними методaми_
Темпеpaтypa °C Рiвень pH Реaгент Джеpелo iнфopмaцiï
lOO 6.4 2% poзчин нiнгiдpинy в метилцелoзoльвi [lO]
lOO 5-6 2% спиpтoвий poзчин нiнгiдpинy [ll]
lOO 6,4 1% спиpтoвий poзчин нiнгiдpинy [l2]
95 5-6 2% га^товий poзчин нiнгiдpинy [l3]
lOO 6,4 0,2% poзчин нiнгiдpинy в етилoвoмy спиpтi [9]
Нaми бyлo дoслiдженo вплив темпеpaтypи пpoведення pеaкцiï нa пpиклaдi нiнгiдpинoвoï pеaкцiï з aмiнoкислoтoю глiцинoм y фoсфaтнoмy бyфеpi.
Резyльтaти дoслiдження ВПЛИВУ темпеpaтypи га oптичнy щiльнiсть oднaкoвиx зa кoнцентpaцieю дoслiдниx poзчинiв нiнгiдpинoвoï pеaкцiï гаведеш в тaблицi 3. Тpебa o^aßy зayвaжити, щo пpи темпеpaтypi ввд 50°С дo 60°С yтвopення зaбapвлення мaйже не вiдбyвaлoсь, тoмy тaкi пoкaзники не 6ули взятi дo yвaги.
Даш дослвджень сввдчать, що максимальний показник оптично! щiльностi реакцшного розчину досягаеться уже при проведенш реакци при 70°С.
Таблиця 3
Температура на^ву(°С) 60 65 70 75 80 85 90 95 100
Оптична щiльнiсть 0,114 0,128 0,134 0,136 0,134 0,135 0,134 0,135 0,134
О^м температури проведення реакци, важливим фактором е тривалiсть нагрiву сумш^ Для визначення оптимально! тривалостi на^ву було проведено дослвдження залежностi величини оптично! щiльностi вiд тривалостi на^ву сумiшi при температурi 70°С та з рiвнем кислотностi розчину pH 6,6. Отриманi результати наведенi в таблиц 4.
Таблиця 4
Залежшсть оптично'1 щiльностi дослiджуваного розчину ввд тривалостi нагрiву
Тривалють на^вання, хв 5 10 15 20 25 30
Оптична щшьшсть (1=540^) 0,133 0,134 0,134 0,133 0,135 0,134
Аналiз результатiв експериментальних дослвджень показав, що уже шсля 5-10 хвилинного нагрiвання реакцiйно! сумiшi у буферному розчинi величина оптично! щшьносп залишаеться практично незмiнною. Тобто необхвдною та достатньою тривалiстю реакци утворення барвника для визначення концентрацп амiнокислоти у продуктах при температурi 70°С е нагрiвання розчину в продовж 10- 30 хвилин.
Для анал1зу концентрацi! амiнокислот у фруктових соках нами було дослщжено та побудовано графiки залежностi оптично! щiльностi вщ концентрацi! стандартних розчинiв амiнокислот -глутамшово!, лiзину, гл1цину та арпнш глутамату з концентрацiею амiнокислот 0,5*10-9 - 20*10-9 моль/л. Данi залежносп оптично! щiльностi вiд концентрацi! стандартних розчишв амiнокислот при довжинi хвилi 540 нм наведенi в табл. 5.
Таблиця 5
Залежшсть оптично'1 щшьносп вiд концентрацi'l' стандартних розчишв амiнокислот
■—-—^^концентрашя амшокислота" " "———____ 0,625 1,25 2,5 5 10 15 20
Аргiнiн глутамат 0,042 0,059 0,077 0,108 0,157 0,233 0,279
Глутамiнова кислота 0,059 0,072 0,085 0,125 0,199 0,257 0,308
Глщин 0,104 0,149 0,211 0,322 0,510 0,677 0,824
Лiзин 0,088 0,091 0,122 0,155 0,210 0,244 0,290
С, *10-9 моль/л
С, *10-9 моль/л
Рис. 4. Залежнiсть оптично'1 щiльностi розчину Рис. 5. Залежшсть оптично'1 щiльностi розчину вщ концентрацИ аргшш глутамату вiд концентрацп глутамшово!" кислоти
Наведенi графiки залежносп оптично! щiльностi розчинiв нiнгiдриново! реакци амшокислот ввд концентрацi! стандартних розчишв амшокислот - глутамшово!, л1зину, глщину та аргiнiн глутамату з концентрашею амiнокислот 0,5*10-9 - 20*10-9 моль/л. Графки залежностi оптично! щiльностi
Рис. 6. Залежнкть оптичноТ щшьносл Рис. 7. Залежнкть оптичноТ щiльностi розчину
розчину в1д концентрацп глiцину в1д концентрацп лiзину
Висновки
В результатi проведених експериментiв було дослiджено вплив температури та тривалосп проведения ншпдриново! реакцп для визначення концентрацп амiнокислот у фосфатно-буферному розчиш гвдрофосфату та дигвдрофосфату калiю.
Встановлено, що: оптимальними параметрами проведення ншпдриново! реакцп для визначення концентрацп амшокислот у фосфатно-буферному розчинi е температура 70°С, тривал1сть нагрiву 10-30 хв.
На основi дослiджень побудованi графши залежиостi оптично! щiльностi розчинiв ншпдриново! реакцп амiнокислот вiд концентрацй' стандартних розчинiв амiнокислот : глутамшово!, лiзину, гл1цину та аргiнiн глутамату з концентращею амiнокислот 0,5*10-9 - 20*10-9 моль/л.
Список використаноТ лiтератури
1. Якубке Х. Д., Эшкайт Х. Аминокислоты, пептиды, белки: Пер. с нем. - М.: Свет, 1985. - 456 с.
2. Строение и свойства аминокислот, входящих в состав кислот: Биохимия - Учебник для ВУЗов. Под ред. Е.С. Северина., 2003. 432с.
3. Гараева С.Н. Аминокислоты в живом организме/Гараева С.Н., Редкозубова Г.В., Посталати Г.В.; Акад. наук Молдовы, Ин-т физиологии и санокреатологии. Кишинев: Б.И., 2009. - 552 с.
4. Смирнов В.А. Аминокислоты и полипептиды: [Уч. пособие] / В.А. Смирнов, Ю.Н. Климочкин. - Самара: Самар. гос. техн. ун-т, 2007. - 110 с.
5. Пищевая химия: Учебн. для студ. ВУЗов, которые обуч. по нап.: «Технология продуктов питания» / А.П. Нечаев, С.Е. Траубенберг, А.А. Коченкова. - 2-е издан., перераб. и исправ. -С.Пб.: ДИОРД, 2003. - 640 с.
6. З. Галюк Теоретические основы электрохимического анализа / Галюк З.: пер. с пол. д.х.н. Б.Я. Каплан, ред. И.В. Селищева, - М.: «Мир», 1974.- 546 с.
7. Шаповалова Е.Н, Пирогова А.В. Хроматографические методы анализа / Метод. пособие. для спец. курсу, ред. О.А. Шпигун, - М.: Мос. гос. ун-т. им. М.В. Ломоносова, 2007.- 109 с.
8. Титрометрический анализ: [Електронний ресурс]/Тернопольский гос. мед.ун-т. им. 1.Я. Горбачевського, 2017.
9. Д.С. Лазарян, А.Ю. Спектрофотометрические методы в анализе биологически активных веществ растительного и животного образования / Д.С. Лазарян, А. Ю. Айрапетова, Л. Б. Губанова, Х. Н. Гюльбакова. - Пятигорск: ПМФИ - филиал дБоУ ВПО Волг. ДМУ. 2015. - 132 с.
10. Бондаренко Б. Н. Количественное определение аминокислот при хроматографии в тонком слое // ж. Лабораторное дело. - 1984. №2. - С.118-120.
11. Лазарян Г. Д., Диханша I. В., Айрапетова А. Ю. Юльшсне визначення амшокислот в пилку // Хiм.фарм. журнал. - 2006.Том 40. №20. - С. 142-146.
12. Крищенко В. П. Комплексная методика определения аминокислот в разных фракциях азотного комплекса растений / В.П. Крищенко // Изд. АН СРСР. Сер. Биология. - 1978. №3. - С. 327-331.
13. Ластухш Ю.О. Хiмiя природних оргашчних сполук: Навч. поабник. - Львiв: Нацюнальний ушверситет «Львiвська полггехшка», «!нтелект-Зах1д». 2005. - 560 с.
