CC BY
18
СОВРЕМЕННАЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА И ПРОФИЛАКТИКА ВИЧ-ИНФЕКЦИИ
К.А. Бочарова, доцент Д.Р. Кретов, ординатор
Белгородский государственный национальный исследовательский университет (Россия, г. Белгород)
Б01:10.24412/2500-1000-2024-1-1-90-93
Аннотация. В данной статье рассматриваются современные молекулярно-генетические подходы к диагностике ВИЧ-инфекции, а также превентивные мероприятия, направленные на предотвращение передачи вируса иммунодефицита человека. Цель - изучение методов лабораторной диагностики и профилактики ВИЧ-инфекции. Проводится сравнительный анализ методов молекулярно-генетических исследований, используемых в практическом здравоохранении. Исследуются проблемы получения ложнополо-жительных и ложноотрицательных результатов клинических исследований на ВИЧ-инфекцию.
Ключевые слова: ВИЧ-инфекция, лабораторная диагностика, молекулярно-генетические, профилактика, половой, медицинских.
Эпидемиологическая ситуация по ВИЧ-инфекции в Российской Федерации остается напряженной и продолжает ухудшаться. Основной причиной инфицирования продолжает оставаться употребление инъекционных наркотиков, также увеличивается число лиц, заразившихся половым путем, не входящих в группы высокого риска. В последние годы возросло число лиц, инфицированных при гемотранс-фузиях компонентов крови, не подлежащих длительному хранению от доноров, находящихся с серонегативном периоде. Особую тревогу вызывает обстоятельство, что медицинские работники в большинстве случаев принимают неверные решения по вопросам лабораторной диагностики и профилактики ВИЧ-инфекции. Зачастую медицинские работники, чья трудовая детальность не связана непосредственно с ВИЧ-инфицированными, испытывают к ним чувство неприязни и пренебрежения, что затрудняет оказание ВИЧ-инфицированным больным специализированной медико-санитарной помощи. Инфицирование вирусом клеток хозяина определяется их свойствами, а также тропностью самого вируса. Разные изоля-ты ВИЧ отличаются по тропизму к клеткам: оболочечный §р 120 лиганд изолятов, адаптированных к переживающим Т-
клеткам, не обеспечивает рецепции к макрофагам и, наоборот, адаптированные к макрофагам не способны инфицировать Т клетки [1]. Основным естественным путем проникновения ВИЧ в организм человека является половой. Входными воротами для вируса при этом служат гениталии или прямая кишка, конкретно их слизистые оболочки. Отсюда ВИЧ распространяется лимфогенно, поступает в кровоток и различные органы и ткани. Патоген проникает через однослойный эпителий прямой кишки намного лучше, чем через многослойный эпителий влагалища, в этом причина повышенного риска передачи ВИЧ при анальных половых контактах между гомо- и гетеросексуалистами по сравнению с вагинальными контактами. ВИЧ лимфотропен вдвойне так как с одной стороны он поражает в первую очередь клетки лимфоидного ряда, с другой - распространяется лимфогенно. Не менее важно нарушение реакции В- клеток на растворимые антигены, продуцируемые микробами - пришельцами. Поликлональная активация В-клеток приводит к гипергам-маглобулинемии и ослаблению их способности продуцировать новые антитела. Т -лимфоциты, подвергающиеся воздействию вирусных белков, которые образуются при гибели ВИЧ - инфицированных клеток и
вирионов, теряют способность к пролиферации под влиянием митогенов. Кроме того, инфицированные вирусом Т4- лимфоциты теряют способность экспрессировать СБ4+ молекулы на своей поверхности, что отражается на эффективности их взаимодействия с клетками главного комплекса гистосовместимости. Инфицирование вирусом макрофагов и моноцитов ослабляет их антиген - представляющую и фагоцитарную функции. Самокупирование острой ретровирусной инфекции сопровождается нарастанием в крови специфических антител до уровня, определяемого доступными методами [2]. Основными целями молекулярно - генетических исследований ВИЧ-инфекции являются установление факта инфицирования ВИЧ, а также установление детального клинического диагноза. Имеется несколько поколений тест систем для определения антител и антигенов к ВИЧ. В тест-системах первого поколения в качестве антигена на твердую фазу нанесен лизат инактивиро-ванный нагреванием лизат культуры лим-фоидных клеток человека, инфицированных ВИЧ-1. Данные тест-системы включают все антигены ВИЧ-1, поэтому они выявляют весь спектр специфических ан-ти-ВИЧ антител предпочтительны для проведения скрининговых обследований. В тест системах второго поколения в качестве антигена нанесены отдельные антигены ВИЧ-1 и ВИЧ-2, полученные генноин-женерным способом - рекомбинанатные тест-системы. Качество скрининговых тест-систем этого поколения характеризуется полнотой представленных на твердой фазе вирусных антигенов, отсутствие каких-либо из них является приводит к лож-ноотрицательным результатам [3]. В тест системах третьего поколения используются синтетические пептиды, которые состоят из отдельных антигенных детерминант ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Они достаточно специфичны, что обеспечивает стандартность тестов и воспроизводимость результатов. Их производство безопасно и относительно недорого. В тест-системах четвёртого поколения используются комбинированные иммуносорбенты, которые содержат лизатный ВИЧ-1, а также рекомбинантные
и пептидные антигены. На твердую фазу наносят лизатные или рекомбинантные белки ВИЧ-1.В отличие от непрямого ИФА, тестируемую сыворотку добавляют в лунку с сорбированным антигеном одновременно с коньюгатом.Коньюгат в этих тест-системах состоит из антител к ВИЧ-1, меченых пероксидазой. Происходит кон-куретное связывание между сывороточными антителами и коньюгатом за антиген ВИЧ-1. В указанной тест-системе используется неразведенная сыворотка, благодаря чему даже при низком содержании антител их количество будет доминировать над концентрацией меченых антител в ко-ньюгате, разведенным в эквимолярном соотношении с сорбированным на планшете антигеном [4]. При учете результатов все окрашенные лунки будут соответствовать отрицательному результату, а бесцветные - позитивному. Исследования с помощью конкуретной тест-системы занимают меньше времени и являются весьма чувствительными. Использование плашечных тест -систем в хорошо оснащенных лабораториях позволяет тестировать большие серии сывороток. После проведения скри-нингового исследования сывороток возникает вопрос, насколько истинны получаемые результаты. Ложноположительные результаты могут быть получены при обследовании больных хроническими инфекционными, аутоиммунными, а также онкологическими заболеваниями. Сыворотки неинфицированных беременных женщин, пациентов после гемотрансфу-зий, хронических алкоголиков, также часто проявляются как положительные. Причинами положительных реакций могут быть перекрестные реакции аутоантител с эпиттопами ВИЧ, а также с антигенами главного комплекса гистосовместимости I и II класса, входящих в иммуносорбент, в виде неспецифических примесей. Ложно-отрицательные результаты бывают обусловлены несоответствием антигенов, нанесенных на твердую фазу и выявляемыми антителами. Проблему достоверности положительных результатов, которые получают первичным скринингом пытаются решить, вычисляя показатель прогностического значения положительного
результата, полученного в используемой тест-системе. Для его определения применяют панель истинно положительных и отрицательных сывороток, предварительно подтвержденных в иммуноблоте. Большинство тест-систем при высокой чувствительности и специфичности характеризуется низким показателем прогностического значения, что указывает на необходимость дальнейшего подтверждения позитивных результатов скрининга. После проведения скринингового теста, все положительные результаты перепроверяют в другой иммуноферментной тест-системе, а затем в более чувствительном тесте - иммуноблоте [5]. В этой системе отдельные структурные и промежуточные белки, полученные из лизата инфицированных вирусом лимфоидных клеток, фракционируют в полиакриламидном геле методом электрофореза.Затем на гель помещают нитроцеллюлозную мембрану и методом электрофореза переносят на нее фракционированные белки ВИЧ. Учитывают результаты иммуноблота по выявлению окрашенных полос на диагностических нитроцеллюлозных мембранах. Повышение чувствительности данного метода достигается за счет того, что на твердой фазе представлены все индивидуальные структурные и промежуточные белки ВИЧ. Кроме того, нитроцеллюлозные мембраны лучше фиксируют специфические иммунные комплексы, за счет большей эффективности связывания белков. Использование биотин-авидиновой системы коньюгатов в иммуноблоте также приводит к существенному повышению его чувствительности. В соотвествии с рекомендациями экспертов ВОЗ, результат, полученный методом иммуноблота, считается положительным, если хотя бы одна окрашенная полоса с наружными белками ВИЧ-1 и/или ВИЧ-2. Сыворотки, подтвержденные с помощью иммуноблота, можно считать истинно положительными, содержащими антитела к ВИЧ. Однако, при интерпретации результатов в иммуноблоте можно столкнуться с определенными трудностями. Выявление отдельных полос с другими белками ВИЧ, трактуется как неопределенный или сомнительный ре-
зультат. Причины таких результатов до конца не ясны. В иммуноблоте могут встречаться и ложноположительные результаты. Доказано, что антитела к клеточным антигенам главного комплекса ги-стосовместимости I класса могут давать ложноположительный результат в области §р41 ВИЧ-1, а аутоантитела к клеточным антигенам главного комплекса гистосов-местимости II класса. Таким образом, несмотря на несомненные преимущества, иммуноблот имеет ряд недостатков. К ним относятся: высокая стоимость одного анализа, трудоемкость исследования, недостаточная стандартизация при учете результатов. При ВИЧ-инфекции с использованием полимеразно цепной реакции определяют провирусную ДНК, геномную РНК и м-РНК вируса. Эффективность данной реакции настолько высока, что можно получить результат, исследуя ДНК одной клетки. Это достигается селективным умножением специфических последовательностей ДНК до такого уровня, когда они могут быть легко выявлены. Парадоксально, но широкое распространение ПЦР в лабораторной практике лимитировано именно его сверхвысокой чувствительностью. Контаминация реагентов и ДНК при проведении ПЦР является главной причиной получения ложноположительных результатов [6].
Выявление источников инфекции, скрининговое тестирование населения являются одним из направлений государственного санитарно-эпидемиологического надзора, другим аспектом является медицинская профилактика. Имеются два приоритета в профилактике ВИЧ-инфекции и в максимальной отсрочке ее манифестной стадии - собственно синдрома приобретенного иммунодефицита. Главным приоритетом был и остается сам вирус иммунодефицита человека и вызываемый им паралич иммунной системы у инфицированного человека. Возможные меры воздействия при этом подходе хорошо известны - использование средств контрацепции при половых контактах, эффективные лекарственные препараты и надежные вакцины. К сожалению, применяемые в настоящее время ан-
тивирусные препараты отличаются огра- инфекций, которые обуславливают фа-ниченной эффективностью и выраженной тальный исход заболевания. Именно пото-токсичностью, надежды на создание в му всё более актуальным становятся раз-ближайшем будущем вакцины против работка и применение методов их ранней ВИЧ также не оправдываются. Опреде- диагностики, адекватной терапии и вто-ленные успехи принесли методы неспеци- ричной профилактики, которые могут фической профилактики, однако теорети- служить действенным дополнением и в чески действенные рекомендации исполь- какой-то степени психологической ком-зования презервативов внедряются трудно пенсацией пока еще ограниченных вози не повсеместно. Другим приоритетным можностей радикального излечения и вак-подходом является первичная и вторичная цинопрофилактики. профилактика тех СПИД-ассоциируемых
Библиографический список
1. Покровский В.В. Эпидемиология и профилактика ВИЧ-инфекции и СПИД. - М.: Медицина, 2016. - 248 с.
2. Рахманова А.Г. ВИЧ-инфекция / А.Г. Рахманова, Е.Н. Виноградова, Е.Е. Воронин, А.А. Яковлев. - СПб.: Питер, 2017. - 187 с.
3. Брико Н.И., Зуева Л.П., Покровский В.И. и др.: Эпидемиология: Учебник. Т. 1. - М.: ООО «Издательство «Медицинское информационное агентство», 2018. - 832 с.
4. Аглиуллина С.Т., Хасанова Г.Р. Современные стратегии профилактики ВИЧ-инфекции (обзор литературы) // Acta biomedica scientifica. - 2018. - Vol. 3, № 1. - С. 26-33.
5. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. Клиническая иммунология и аллергология с основами общей иммунологии. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015.
6. Покровский В.В., Юрин О.Г., Кравченко А.В. и др. Национальные рекомендации по диспансерному наблюдению и лечению больных ВИЧ-инфекцией // Эпидемиология и инфекционные болезни (приложение). - 2016. - № 6. - 124 с.
MODERN MOLECULAR GENETIC DIAGNOSIS AND PREVENTION
OF HIV INFECTION
K.A. Bocharova, Associate Professor D.R. Kretov, Resident
Belgorod State National Research University (Russia, Belgorod)
Abstract. This article discusses modern molecular genetic approaches to the diagnosis of HIV infection, as well as preventive measures aimed at preventing the transmission of the human immunodeficiency virus. The goal is to study methods of laboratory diagnosis and prevention of HIV infection. A comparative analysis of molecular genetic research methods used in practical healthcare is carried out. The problems of obtaining false-positive and false-negative results from clinical trials for HIV infection are explored.
Keywords: HIV-infection, laboratory diagnostics, molecular genetic, prevention, sexual, medical.
