CC BY
44
Изучение антигенных свойств рекомбинантного аналога белка NEF вируса иммунодефицита человека
Г.И. Алаторцева1 (alatortseva@gmail.com), М.Н. Носик1 (mnossik@yandex.ru), Л.Н. Нестеренко1 (lnnesterenko@pochta.ru), И.И. Амиантова1 (amianti@yandex.ru), В.В. Доценко1 (VerraMal@gmail.com), Л.Н. Лухверчик1 (lexx294@yandex.by), М.В. Жукина1 (alatortseva@gmail.com), В.Ю. Кабаргина (v.cabargina@yandex.ru), Е.Н. Кудрявцева2 (kudravtseva@mail.ru), В.В. Зверев1 (vitalyzverev@outlook.com)
1ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», Москва 2ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского», Москва
Резюме
Белок р27/р25 - продукт гена nef вируса иммунодефицита человека - многофункциональный фактор патогенности ВИЧ. Антигенные свойства рекомбинантного полипептида NEF, содержащего слитный с р-галактозидазой E. coli N-концевой фрагмент белка р27 ВИЧ-1, исследованы с применением серологических и вирусологических методов. Методами ИФА, Вестерн-блоттинга и линейного иммуноаналаза показано взаимодействие рекомбинантного антигена NEF и сывороток крови ВИЧ-инфицированных пациентов и отсутствие положительных реакций с сыворотками крови здоровых людей. Антигенная специфичность рекомбинантного антигена подтверждена в реакциях с коммерческим аналогом белка р27/р25 ВИЧ-1 и с поликлональными антителами к синтетическим пептидам, соответствующим N- и С-концевым участкам белка р27/р25 ВИЧ-1. Показано взаимодействие IgG кроликов, иммунизированных рекомбинантным антигеном NEF, с вирусными антигенами в реакциях непрямой иммунофлуорес-ценции и нейтрализации. Таким образом, экспериментально обоснована возможность применения рекомбинантного белка NEF в качестве антигена в диагностических и исследовательских целях.
Ключевые слова: вирус иммунодефицита человека, ВИЧ-1, ген nef, рекомбинантный антиген NEF, иммуноферментный анализ, Вестерн-блоттинг, линейный иммуноанализ, метод непрямой иммунофлуоресценции, реакция нейтрализации
Study of Antigenic properties of Human immunodeficiency Virus NEF protein Recombinant Analog
G.I. Alatortseva1 (alatortseva@gmail.com), M.N. Nosiк1 (mnossik@yandex.ru), L.N. Nesterenko1 (lnnesterenko@pochta.ru), I.I. Amiantova1 (amianti@yandex.ru), V.V. Dotsenko1 (VerraMal@gmail.com), L.N. Luhverchik1 (lexx294@yandex.by), M.V. Zhuckina1 (alatortseva@gmail.com), V.U. Kabargina1 (v.cabargina@yandex.ru), E.N. Kudryavtseva2 (kudravtseva@mail.ru), V.V. Zverev1 (vitalyzverev@outlook.com)
1 Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow
2 State Budgetary Institution of Public Health of Moscow Region «M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research Clinical Institute», Moscow Abstract
Protein р27/р25 is a product of HIV nef gene and is a multifunctional factor of HIV pathogenicity. Antigenic properties of recombinant NEF polypeptide which includes N-terminal fragment of HIV-1 p27 protein fused to E. coli в-galactosidase were studied by serological and virological methods. The interaction was shown between recombinant NEF antigen and serums of HIV-positive individuals by ELISA, Western blot and line immunoassay. There was no interaction with sera of healthy individuals. The antigen specificity of recombinant antigen was shown in the reactions with commercial HIV-1 р27/р25 protein analog and with polyclonal antibodies to synthetic peptides corresponding to N-, C-terminal regions of HIV-1 р27/р25 protein. The interaction between IgG of rabbits immunized with recombinant NEF antigen and viral antigens was shown by indirect immunofluorescence and neutralizing assays. Thus it was proven the possibility of using recombinant NEF protein as an antigen for diagnostic and experimental purposes.
Key words: Human Immunodeficiency Virus; HIV-1, nef gene; glycoprotein G; recombinant NEF antigen; enzyme immunoassay; Western blot; line immunoassay; indirect immunofluorescence; neutralizing assay
введение генной основы присутствуют вирусный лизат, ре-
Основным лабораторным диагностическим по- комбинантные белки или синтетические пептиды.
казателем ВИЧ-инфекции является выявление Одним из преимуществ применения рекомбинант-
специфических антител методом ИФА и иммуно- ных антигенов является возможность использо-
блоттинга. В известных к настоящему времени вания минорных вирусных белков в количествах,
диагностических тест-системах в качестве анти- которые не могут быть представлены в препаратах
вирусного лизата. При наличии положительной реакции только с одним из белков оболочки вируса (gp160, gp120 или gp41) даже в сочетании с реакцией с другими белками, результат исследования считается сомнительным [1]. В этой ситуации введение в реакцию дополнительных антигенов может сделать интерпретацию результатов более определенной. В качестве таких антигенов можно рассматривать рекомбинантные белки, содержащие антигенные детерминанты регуляторных белков ВИЧ, в частности, белок р27/р25 - продукт гена nef, который по современным представлениям относится к многофункциональным факторам патогенности ВИЧ, обеспечивающим снижение экспрессии CD4 на клеточной поверхности, нарушение активации Т-лимфоцитов и стимуляцию инфекционности ВИЧ. Являясь продуктом раннего гена, белок NEF первым после инфицирования ВИЧ накапливается в клетках в детектируемых количествах [2]. Тем не менее, его содержание в вирусных лизатах является недостаточным для выявления специфических антител тест-системами в форматах ИФА и Вестерн-блоттинга. Возможно, это является следствием расщепления белка вирусной протеазой после его упаковки в вирусные частицы на стадии созревания вириона [3]. Диагностическая значимость этого полипептида, как и других регуляторных белков ВИЧ, изучена недостаточно, однако есть данные о том, что антитела к белку NEF могут обнаруживаться в латентный период развития ВИЧ-инфекции в отсутствие антител к структурным белкам вируса [4, 5].
Изучение антигенных свойств рекомбинантных или синтетических аналогов природных антигенов является основополагающим этапом создания на их основе диагностических тест-систем.
Ранее нами был получен рекомбинантный белок NEF, содержащий слитный с ß-галактозидазой E. coli фрагмент (K4 - P122) белка р27/р25 (M1 - D123) ВИЧ-1 [7]. Поскольку в области W13 - Y114 в структуре вирусного белка NEF предположительно присутствует не менее 27 антигенных детерминант [http://www.bioafrica.net/proteomics/NEFprot.html, 6], мы полагаем, что полученный нами рекомбинантный белок может сохранять специфическую антигенную активность.
Цель настоящей работы - исследование антигенной специфичности рекомбинантного полипептида NEF с применением серологических, вирусологических и серологических методов.
Материалы и методы
Бактериальные и вирусный штаммы, культуры клеток. Рекомбинантный штамм E. coli - продуцент полипептида NEF [7], созданный на основе штамма E. coli PLT90 (F-, lon::Tn10(TetR), endAl, malPpa::[ PR, C1857](Mal-, limm) thi, hsdR17) [8]. Штамм ВИЧ-1 и перевиваемая лимфобластоид-ная клеточная линия МТ-4 из коллекции вирусов ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова». Клетки E. coli
штамма PLT90, трансформированные векторной плазмидой pEL5a [9].
Иммунореагенты. Поликлональные антитела производства компании Santa Cruz Biotechnology Inc., Канада: IgG коз vC-19 (Кат. № sc-17438), иммунизированных синтетическим пептидом vC-19-Р, соответствующим C-концевому участку белка NEF ВИЧ-1; IgG коз vA-19 (Кат. № sc-17437), иммунизированных синтетическим пептидом vA-19-Р, соответствующим N-концевому участку белка NEF ВИЧ-1. Слитный с ß-галактозидазой E. coli рекомбинантный антиген HIV-1 NEF производства компании Prospec-Tany TechnoGene Ltd Inc., Израиль (Кат. № 108HIVNEF01). Рекомбинантные антигены gp41, gp 120, р24, Pol ВИЧ-1, env ВИЧ-1 группы 0, gp38 ВИЧ-2 из коллекции рекомбинантных антигенов ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова».
Серологический материал. Образцы сывороток крови ВИЧ-инфицированных лиц и сывороток крови здоровых доноров из ГБУЗ МО «Московского областного НИКИ им. М.Ф. Владимирского». Образцы сывороток пациентов с кишечными патологиями из ФГУ «ГНЦ колопроктологии». Стандартная панель образцов сывороток крови, не содержащих антител к ВИЧ-1, ВИЧ-2 и антигена р24 ВИЧ-1 (ОСО 42028-214-02П).
Выделение и очистка рекомбинантных полипептидов. Ночные культуры клеток E. coli, содержащие векторную или рекомбинантную плаз-миду, разводили в 100 раз средой LB с 100 мкг/ мл ампициллина и выращивали при постоянной аэрации при температуре +30 °С. После достижения культурой оптической плотности 0,5 о.е./мл при l = 550 нм экспрессию гибридных генов индуцировали повышением температуры культивирования до +39 °С в течение 2 часов. Клетки разрушали добавлением хлороформа, фракцию телец-включений собирали центрифугированием и обрабатывали ультразвуком в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl pH 8,0 и 10 мМ Na-ЭДТА. Дальнейшую процедуру выделения и очистки проводили по ранее описанному методу [10, 11].
Иммунизация лабораторных животных. Кроликам-самцам породы «Шиншилла» массой 2,5 - 3,0 кг в подколенные лимфатические узлы задних конечностей и подкожно в подушечки стоп задних конечностей вводили по 0,3 мл эмульсии, содержащей 10 мкг/мл рекомбинантного антигена или ß-галактозидазы E. coli в смеси с полным адъюван-том Фрейнда. Через 8 недель проводили повторную иммунизацию путем подкожного введения в каждую конечность по 5 мкг антигена в неполном адъюванте Фрейнда. Подкожные инъекции антигена в физиологическом растворе повторяли с недельным интервалом, контролируя нарастание титра антител методом ИФА. Забор крови производили через 1 неделю после последней иммунизации.
Выделение и очистка фракции IgG из сывороток крови иммунизированных животных. Гамма-глобу-линовую фракцию сывороток крови кроликов, им-
мунизированных рекомбинантным полипептидом NEF или ß-галактозидазой E. coli, и сывороток крови неиммунизированных кроликов осаждали сульфатом аммония. Затем фракцию IgG подвергали дополнительной очистке методами ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе и аффинной хроматографии на сефарозе «Oba^on Blue» [12, 13].
Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли [14].
Твердофазный непрямой иммуноферментный метод. Рекомбинантные полипептиды или ß-галактозидазу E. coli в концентрации 4 мкг/мл в 10 мМ карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,6 сорбировали в лунки 96-луночных полистироловых планшетов (Биомедикал, Россия) в течение 16 часов при температуре +4 °С. Сыворотки разводили в 100 раз в растворе 0,1 М фосфатно-солевого буфера pH 7,5, содержащем 0,1% Твин 20 и лизат культуры E. coli, и вносили в лунки планшетов с иммуносорбентом. Связывание антител с реком-бинантным белком выявляли с помощью конъюги-рованных с пероксидазой хрена моноклональных антител к IgG человека (Сорбент-Сервис, Россия, Кат. № CH1), антител козы к IgG кролика (Sigma Aldrich, Кат № 6154) или антител кролика к IgG козы (Calbiochem, Германия, Кат. № 401504) в зависимости от видовой принадлежности исследуемого образца сыворотки или антител. В качестве хромогена использовали 3,3',5,5'-тетраметилбен-зидин.
Конкурентный твердофазный непрямой метод иммуноферментного анализа. Перед внесением в лунки планшета с иммобилизованным рекомби-нантным белком NEF- ProSpec-Tany (Prospec-Tany TechnoGene Ltd Inc) или ß-галактозидазой E. coli, антитела иммунизированных синтетическими пептидами коз разводили в 100 раз в растворе, содержащем рекомбинантный полипептид NEF в разведениях от 1:10-1 до 1:10-5, затем по 100 мкл полученных разведений сывороток вносили в лунки планшета с иммуносорбентом и инкубировали при +37 °С в течение 1 часа. Все остальные манипуляции осуществлялись по схеме твердофазного непрямого иммуноферментного анализа.
Вестерн-блоттинг. Иммобилизацию белков на нитроцеллюлозной мембране проводили по ранее описанному методу [15] на оборудовании и по рекомендации компании Bio-Rad, США. Нитроцеллю-лозную мембрану с иммобилизованными белками инкубировали в течение 1 часа в блокирующем растворе, содержащем 5% сухого обезжиренного молока в Трис-солевом буфере (20 мм TrisHCl pH7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% Твин 80), затем мембрану выдерживали с сывороткой крови человека или c содержащей антитела к рекомбинантному антигену кроличьей сывороткой в 100-кратном разведении в Трис-солевом буфере с добавлением лизата E. coli в течение 1 часа при температуре +37 °С. Связывание антител с иммобилизованными белками выявляли с помощью конъюгирован-
ных с пероксидазой хрена моноклональных антител к IgG человека (фирма Сорбент-Сервис, Россия, Кат. № CH1) или антител козы к IgG кролика (Sigma Aldrich, Кат. № 6154) соответственно. В качестве хромогена использовали 3,3'-диаминобензидин или 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. Результат учитывали визуально.
Линейный иммуноанализ. На поверхности им-муносорбента - полосок нитроцеллюлозных мембран в виде поперечных линий сорбировали очищенные рекомбинантные полипептиды - аналоги антигенов gp41, gp120, р24, Pol, NEF ВИЧ-1, gp41 ВИЧ-1(0), gp38 ВИЧ-2. В качестве контрольного антигена специфичности реакции использовали ß-галактозидазу E. coli, в качестве контрольного антигена правильности проведения реакции - IgG козы против IgG человека, в качестве положительного контрольного образца - сыворотку крови человека, содержащую антитела к ВИЧ-1, в качестве отрицательного контрольного образца - сыворотку крови человека, не содержащую антител к ВИЧ-1, ВИЧ-2 и антигена р24 ВИЧ. Анализируемые образцы сывороток крови человека в разведении 1:50 в Трис-солевом буфере с добавлением лизата бактерий E. coli инкубировали с иммуносорбентом в течение 2 часов при комнатной температуре. Связывание антител с рекомбинантными белками выявляли с помощью конъюгированных с перок-сидазой хрена моноклональных антител к IgG человека (фирма Сорбент-Сервис, Россия, Кат. № CH1). Все остальные манипуляции проводили по схеме Вестерн-блоттинга.
Вирусы. Клетки линии МТ-4 культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров и 100 мкг/мл гентамицина. Жизнеспособность клеток определяли подсчетом количества живых и погибших клеток после их окрашивания 0,1% раствором трипанового синего. Доза заражения вирусом составила 0,001 ТЦИД50/кл. Применялось 2 схемы инфицирования клеток в присутствии препаратов антител: препарат + вирус, контакт 30 мин + клетки (схема № 1) и препарат + клетки, контакт 30 мин + вирус (схема № 2).
Реакция непрямой иммунофлюоресценции. Реакцию непрямой иммунофлюоресценции для определения клеток, экспрессирующих антигены ВИЧ-1, проводили по стандартной методике [16], с использованием набора моноклональных антител к антигенам ВИЧ-1 (ГУ НИИ иммунологии МЗ РФ), которые в комплексе с фрагментами овечьих антител к IG мыши, конъюгированными с ФИТЦ, давали специфическое свечение.
Реакция нейтрализации. Реакцию проводили по стандартной методике, утвержденной ВОЗ [17]. Результаты опыта оценивали на 5 - 6-е сутки после инфицирования клеток вирусом. Нейтрализующую активность антител оценивали по степени защиты клеток от цитодеструктивного действия вируса и по процентному содержанию клеток, экспрессирующих антигены ВИЧ. Степень защиты клеток от ци-
тодеструктивного действия вируса определяли по формуле:
А - В
% защиты =- х 100, где
К - В
А - число жизнеспособных клеток в опыте;
В - то же в инфицированной культуре (контроль
вируса);
К - то же в неинфицированной культуре (контроль клеток).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программ «OriginPro 8», «Exœl».
результаты и обсуждение
Анализ антигенной специфичности
рекомбинантного белка NEF методами ИФА и Вестерн-блоттинга. Первичный анализ антигенной активности рекомбинантного полипептида NEF, содержащего слитный с ß-галактозидазой E. coli фрагмент (K4 - P122) белка р27/р25 (M1 - D123) ВИЧ-1 [5], проводили с использованием аттестованных в подтверждающих тестах образцов сывороток крови ВИЧ-инфицированных людей. Отобрано 3 образца, взаимодействующих с рекомбинантным полипептидом NEF в иммуноферментном анализе. Методом иммуноблоттинга показано взаимодействие рекомбинантного антигена с этими образцами на нитроцеллюлозной мембране с иммобилизованными белками лизата телец включений
из биомассы штамма-продуцента рекомбинатного белка NEF. Окрашивание происходило в зоне соответствующей молекулярной массы и отсутствовало в лизате клеток E. coli, трансформированных векторной плазмидой без вставки вирусоспецифи-ческой последовательности ДНК; окрашивание в области, соответствующей рекомбинантному белку, в реакциях с сыворотками здоровых людей отсутствовало (рис. 1).
Антигенную специфичность рекомбинантного полипептида NEF исследовали методом ИФА в сравнении с его коммерческим аналогом - ре-комбинантным полипептидом NEF-Prospec-Tany. Рекомбинантный полипептид сравнения взаимодействовал с IgG коз к пептидам, соответствующим N-концевому (vA-19) и C-концевому (vC-19) участкам вирусного белка p27/p25. ß-галактозидаза E. coli и рекомбинантный белок gp41 ВИЧ-1 не реагировали с антителами к vA-19 и vC-19. В конкурентном ИФА реком-бинантный полипептид NEF полностью подавлял взаимодействие антител к vA-19 и vC-19 с ре-комбинантным полипептидом HIV-1 NEF-Prospec-Tany (рис. 2). Таким образом, в реакциях с коммерческим аналогом показана высокая специфичность взаимодействия рекомбинантного полипептида NEF с антителами к синтетическим пептидам, соответствующим N- и C-концевым фрагментам вирусного антигена.
Исследование вирусологическими методами. Для последующего изучения иммунореактив-
Рисунок 1.
Электрофорез в 10% SDS-полиакриамидном геле (A) и Вестерн-блоттинг с положительными (B) и отрицательными (С) сыворотками
Примечание: 1. лизат телец включений, содержащих, рекомбинантный белок NEF,
2. лизат клеток E. coli PLT90, трансформированных векторной плазмидой pEL5a. Стрелкой отмечено положение -галактозидазы E. coli
Рисунок 2.
Иммуноферментный анализ с рекомбинантными антигенами: взаимодействие антител vA-19 (А) и vC-19 (Б) c рекомбинантным полипептидом NEF-ProSpec-Tany и ß-галактозидазой E. coli; подавление рекомбинантным полипептидом NEF взаимодействия рекомбинантного полипептида NEF-ProSpec-Tany с антителами vA-19 в разведении 1:20 (В) и антителами vC-19 в разведении 1:10 (Г)
ности белка NEF в зараженной ВИЧ-1 культуре клеток получены гипериммунные сыворотки крови кроликов к рекомбинантному белку NEF и ß-галактозидазе Е. coli. Подобраны разведения ли-зата E. œli, при которых кроличья сыворотка к ß-галактозидазе Е. coli не взаимодействует с рекомбинантным антигеном NEF, а кроличья сыворотка к белку NEF не дает положительной реакции с ß-галактозидазой в ИФА и Вестерн-блоттинге. Титры иммунных сывороток, определенные методом ИФА в реакциях с гомологичными антигенами, составили 1:105. Не выявлено взаимодействия сывороток крови неиммунизированных кроликов
с рекомбинантным полипептидом NEF. Из гипериммунных кроличьих сывороток к белку NEF и ß-галактозидазе E.coli хроматографически очищены фракции специфических IgG. Полученные препараты антител взаимодействовали с гомологичными антигенами в ИФА и Вестерн-блоттинге.
Исследование цитотоксического действия препаратов кроличьих антител к рекомбинантному белку NEF и ß-галактозидазе E. coli в различных концентрациях на неинфицированной культуре клеток показало, что данные препараты в разведении 1:10 не обладают токсичностью (табл. 1). Результаты изучения нейтрализующей активности
антител на культуре клеток МТ-4, инфицированной ВИЧ-1, представлены в таблице 2. Подавление инфекционной активности ВИЧ наблюдалось при разведении 1:320 препарата антител к реком-бинантному белку NEF. При этом степень защиты клеток от цитотоксического действия вируса при схемах инфицирования № 1 и № 2 составила 92,3 и 92,5% соответственно. При инфицировании по схеме № 2 антитела к рекомбинантному белку обладали несколько более выраженной вируснейтра-лизующей активностью в более высоких разведениях (1:1280), а при разведениях от 1:10 до 1:40 степень защиты инфицированных клеток, соответствующая жизнеспособности неинфицированных клеток, наблюдалась при инфицировании по схеме № 1 (рис. 3). Снижение защитного эффекта в культуре инфицированных клеток в разведениях 1:640 и 1:1280 проявлялось в виде характерных цитоде-структивных изменений и образовании синцитиев, свидетельствующих об активной репликации ви-
руса (рис. 2). Антитела к ß-галактозидазе E. coli не оказывали подавляющего действия на репликацию вируса. Для изучения методом иммунофлуоресцен-ции взаимодействия антител к рекомбинантному белку NEF с вирусным антигеном была выбрана схема инфицирования № 2, так как при ее использовании наблюдались более выраженные изменения в жизнеспособности клеток в зависимости от разведения антител. При разведении антител 1:640 наличие клеток, экспрессирующих вирусный антиген, обнаруживалось в виде специфического свечения, что подтверждало репликацию вируса. При разведении антител 1:160 уровень свечения был близок к наблюдаемому в неинфицированной культуре клеток, что соответствовало подавлению экспрессии вирусных антигенов в реакции нейтрализации (табл. 3, рис. 4). В присутствии антител к ß-галактозидазе E. coli в инфицированной культуре клеток флуоресценция не превышала уровня фона (рис. 4, Б)
Таблица 1.
Исследование цитотоксичности антител к рекомбинантному антигену NEF и антител к ß-галактозидазе E. coli на неинфицированной культуре клеток МТ-4
разведение антител Количество жизнеспособных клеток Мт-4, %
Антитела к рекомбинантному белку NEF Антитела к ß-галактозидазе Контроль клеток (без добавления антител)
1: 10 100,0 100,0 100,0
1: 20 100,0 100,0 100,0
1: 40 99,8 99,7 100,0
1: 80 100,0 100,0 99,7
1: 160 99,7 100,0 100,0
Примечание: представлены результаты 3-х независимых опытов; в каждом опыте среднее значение бралось по 3-м лункам; s 0,05 Таблица 2.
Исследование вируснейтрализующей активности антител к рекомбинантному антигену NEF на инфицированной ВИЧ-1 культуре клеток МТ-4
разведение антител защита клеток, %
схема № 1 «препарат + вирус, контакт 30 мин + клетки» схема № 2 «препарат + клетки, контакт 30 мин + вирус»
1: 10 95,6 89
1: 20 95,9 80
1: 40 100 100
1: 80 82,7 75,7
1: 160 82,7 100
1: 320 82,3 92,5
1: 640 75,4 77,1
1: 1280 68,1 77,9
Контроль клеток* 99,0
Контроль вируса** 46,5
Примечание: *контроль клеток - неинфицированная культура клеток МТ-4;
**контроль вируса - инфицированная ВИЧ-1 культура клеток МТ-4 без добавления антител.
Представлены результаты 3-х независимых опытов; в каждом опыте среднее значение бралось по 3-м лункам; р < 0,05.
Рисунок 3.
Ракция нейтрализации с антителами к рекомбинантному белку NEF:
A) - неинфицированная культура клеток; Б) - культура клеток, инфицированная ВИЧ-1 без добавления антител;
B) - культура клеток, инфицированная по схеме № 2 (разведение антител 1:640); Г) - культура клеток, инфицированная по схеме № 2 (разведение антител 1:40)
Таблица 3.
Процентное содержание клеток, экспрессирующих антиген ВИЧ-1, при обработке антителами к белку NEF
Разведение Количество клеток, экспрессирующих антиген (схема № 2), %
1:10 0
1:20 0
1:40 0
1:80 0
1:160 0
1:320 30
1:640 75
1:1280 100
Контроль клеток* 0
Контроль вируса** 100
Примечание: *контроль клеток - неинфицированная культура клеток МТ-4;
**контроль вируса - инфицированная ВИЧ-1 культура клеток МТ-4 без добавления антител.
Рисунок 4.
Реакция непрямой иммунофлуоресценции с антителами к рекомбинантному антигену NEF на культуре клеток МТ-4: А) не инфицированной ВИЧ-1, разведение антител к белку NEF 1:10; Б) инфицированной ВИЧ-1, разведение антител к ß-галактозидазе E. coli 1:10; В) инфицированной ВИЧ-1, разведение антител к белку NEF 1:640.
Таким образом, с помощью вирусологических методов показано взаимодействие антител, полученных к рекомбинантному антигену NEF, с вирусным антигеном. В научной литературе имеется много данных по исследованию вируснейтрализующих свойств антител, выделенных из сывороток крови животных, иммунизированных оболочечными белками ВИЧ-1 [18]. Есть также данные о комплемент-опосредованном цитотоксическом действии на клетки, зараженные ВИЧ-1, мышиных антител к синтетическому пептиду, соответствующему фрагменту Y81 - D123 белка р27/р25 ВИЧ-1 [19]. Показанное в данной работе в целом более эффективное подавление репликации вируса при заражении по схеме № 1 («препарат + вирус, контакт 30 мин + клетки») позволяет предположить, что предварительный контакт антител с вирусом облегчает их проникновение в клетку.
Высокая специфичность взаимодействия антител, выделенных из гипериммунных сывороток
к рекомбинантному антигену, с клетками культуры, инфицированной ВИЧ-1, подчеркивает подобие антигенных детерминант рекомбинантного антигена NEF и натурального вирусного белка p27/p25. По-видимому, ответственные за это взаимодействие эпитопы являются конформационно стабильными и представлены линейной структурой как в составе вирусного белка, так и в составе его рекомбинантного аналога, так как методы выделения рекомбинантных белков, накапливающихся в составе телец-включений в биомассах штаммов-продуцентов E. coli, включают обработку денатурирующими агентами. Подавление цитопатического действия вируса и экспрессии вирусных антигенов в присутствии антител к белку NEF позволяет также предположить, что в составе исследуемого реком-бинантного антигена воспроизведены консервативные домены, ответственные за участие белка р27/р25 в репликации вируса.
Тестирование клинических образцов. Оценку диагностической значимости рекомбинантного антигена NEF при выявлении IgG к ВИЧ-1 проводили методами линейного иммуноанализа и ИФА с использованием сывороток 316 пациентов с лабора-торно подтвержденной ВИЧ-инфекцией. IgG к белку NEF методом ИФА с последующим подтверждением методом линейного иммуноанализа были обнаружены в 95 (30%) исследованных образцах ВИЧ-инфицированных пациентов. Частота обнаружения антител к различным комбинациям рекомбинант-ных белков Env, Gag, Pol ВИЧ-1, Env ВИЧ-1 группы 0, Env ВИЧ-2 в NEF-позитивных образцах сывороток составила от 1,0 до 90,5% (табл. 4). Все образцы, выявляемые как позитивные по отношению к рекомбинантному антигену NEF, содержали антитела к рекомбинантным антигенам gp41 и gp120 ВИЧ-1 (рис. 5), то есть по современным критериям являлись ВИЧ-позитивными [1].
В качестве группы сравнения исследовали сыворотки крови 65 больных кишечными патологиями без ВИЧ-инфекции. Кроме того, в качестве отрицательных образцов использовали сыворотки стандартной панели ГИСК (ОСО 42028-214-02П), не содержащие антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и антигену р24 ВИЧ-1, и сыворотки крови 32 здоровых доноров. Не выявлено антител к рекомбинантному антигену NEF в образцах стандартной панели и в сыворотках крови пациентов из групп сравнения.
Поскольку исследуемый полипептид является гибридным белком, содержащим в своем составе ß-галактозидазу E. coli, изучено взаимодействие NEF-позитивных и NEF-негативных сывороток с ß-галактозидазой. В ИФА с ß-галактозидазой значения оптической плотности не превышали порогового значения, а в линейном иммуноанализе отсутствовало окрашивание в области соответствующей полосы (рис. 5).
Таблица 4.
Частота обнаружения антител к индивидуальным антигенам ВИЧ в NEF-позитивных образцах сывороток крови (п = 95)
наименование антигенов Количество позитивных реакций
Абс. %
gp120, gp41, p24, Pol ВИЧ-1 86 90,5
gp120, gp41, p24, Pol ВИЧ-1, Env ВИЧ-1 группы 0 42 44,2
gp120, gp41, p24, Pol ВИЧ-1, Env ВИЧ-1 группы 0, gp38 ВИЧ-2 7 7,4
gp120, gp41, p24 ВИЧ-1, Env ВИЧ-1 группы 0 3 3,2
gp120, gp41, p24 ВИЧ-1 3 3,2
gp120, gp41, p24, Pol ВИЧ-1, gp38 ВИЧ-2 2 2,1
gp120, gp41, Pol ВИЧ-1 2 2,1
gp120, gp41, Pol, ВИЧ-1, Env ВИЧ-1 группы 0 1 1,0
Рисунок 5.
Линейный иммуноанализ с положительными (А) и отрицательными (Б) сыворотками
Иммобилизованные антигены:
gp41 ВИЧ-1 gp120 ВИЧ-1 p24 ВИЧ-1 gp41 ВИЧ-1 (0)
gp38 ВИЧ-2
NEF ВИЧ-1
Pol ВИЧ-1
B-gal
Контроль реакции
А)
B)
По мнению ряда авторов, присутствие антител к белку р27/р25 является потенциальным прогностическим маркером развития ВИЧ-инфекции [20, 21]. Разная частота обнаружения антител к определенным комбинациям рекомбинантных аналогов белков ВИЧ возможно связана с особенностями формирования гуморального иммунитета к индивидуальным антигенам ВИЧ на определенной стадии развития заболевания.
Так как полипептид, содержащий антигенные детерминанты белка р27/р25, является одним из компонентов некоторых разрабатываемых вакцин против ВИЧ-инфекции [22], определение специфических антител к данному белку может найти применение не только для диагностики и оценки иммунного статуса при ВИЧ-инфекции, но и для изучения эффективности вакцинации.
выводы
1. В работе экспериментально обоснована возможность применения рекомбинантного поли-
пептида NEF для детекции антител к белку р25/ р27 ВИЧ-1.
2. Учитывая низкое содержание данного антигена в препаратах нативного вируса, использование его рекомбинантного аналога является перспективным при создании диагностических тест-систем, при отборе и анализе различных биоматериалов (гипериммунных сывороток, моноклональных антител и т.д.), а также в решении исследовательских и прикладных задач.
3. Целесообразным представляется использование рекомбинантного антигена NEF для изуче-ниия формирования гуморального иммунного ответа на отдельные антигены ВИЧ с целью прогнозирования развития ВИЧ-инфекции.
4. Определение специфических антител к белку NEF может найти применение при изучении эффективности вакцинации и закономерностей формирования поствакцинального иммунитета. ш
литература
1. Методическое письмо № 4174-РХ от 04.08.2006 г. Проведение лабораторного обследования на ВИЧ-инфекцию (в том числе исследование иммунитета и вирусной нагрузки при ВИЧ-инфекции): 1 - 19.
2. Kim S.Y., Byrn R., Groopman J., Baltimore D. Temporal aspects of DNA and RNA synthesis during human immunodeficiency virus infection: Evidence for differential gene expression. J. Virol. 1989. 63: 3708 - 3713.
3. Pandori M.W., Fitch N.J., Craig H.M. Richman D.D., Spina C.A., Guatelli J.C.. Producer-cell modification of human immunodeficiency virus type 1: Nef is a virion protein. J. Virol. 1996. 70: 4283 - 4290.
4. Wieland U., K hn J.E., Jassoy C., R bsamen-Waigmann H., Wolber V., Braun R. Antibodies to recombinant HIV-1 NEF, tat, and nef proteins in human sera Medical Microbiology and Immunology. 1990. 179. 1: 1 - 11.
5. O>Neil C., Lee D., Clewley G., Johnson M.A., Emery V.C. Prevalence of anti-NEF antibodies in HIV-1 infected individuals assessed using recombinant baculovirus expressed NEF protein. J. Med. Virol. 1997: 139 - 44.
6. Frahma N., Lindea C., Brander C. Identi cation of HIV-Derived, HLA Class I Restricted CTL Epitopes: Insights into TCR Repertoire, CTL Escape and Viral Fitness. HIV Molecular Immunology. 2006: 3 - 28.
7. Алаторцева Г.И., Нестеренко Л.Н., Волынская Е.А., Амиантова И.И., Кабаргина В.Ю., Жукина М.В. и др. Получение рекомбинантного полипептида, содержащего антигенные детерминанты белка nef ВИЧ-1 и его применение для диагностики ВИЧ-инфекции методом линейного иммуноблоттинга. Труды XI Международного конгресса «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии». Российский аллергологиче-ский журнал. 2011. 4 (1): 12 - 14.
8. Алаторцев В.Е., Алаторцева Г.И. Патент РФ. 1992. № 2043409 на изобретение «Штамм бактерий Escherichia coli, используемый для получения рекомбинантных белков».
9. Алаторцев В.Е., Алаторцева Г.И. Патент РФ.1992. № 2071501 на изобретение «Вектор pEL5a, предназначенный для экспрессии чужеродной ДНК».
10. Новое в клонировании ДНК. Методы. Ред. Гловер Д., Москва, 1989: 122 - 128.
11. Sameh Magdeldin and Annette Moser. Affinity Cromatography: Principles and Applications, Affinity Chromatography. Ed.: S. Magdeldin. In Tech. 2012: 70 - 75.
12. Virca G.D., Travis J., Hall P.K., Roberts R.C. Purification of -2-Macroglobulin by Chromatography on Cibacron Blue Sepharose. Analytical Biochemistry. 1978. 8: 274 - 276.
13. Rattana Wongchuphan, Beng Ti Tey, Wen Siang Tan, Senthil Kumar Subramanian, Farah Saleena Taip, Tau Chuan Ling. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochemistry 2011. 46: 101 - 107.
14. Практическая химия белка. А. Дарбре, ред. Пер. с англ. Москва. 1989: 1 - 621.
15. Towbin H., Staehlin T., Gordon Y. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Proce-dure and some applications. Proc. nat. Acad. Sci. USA. 1979; 76: 4350 - 4359.
16. Носик М.Н., Рыжов К.А., Киселева И.А., Кравченко А.В., Покровский В.В. Биологические свойства штаммов вируса иммунодефицита человека, выделенных от ВИЧ-инфицированных лиц на территории России за 2009-2010 гг. ЗНиСО. 2011; 4 (217): 31 - 34.
17. End point neutralization assay. WHO Guidelines for Standart HIV Isolation Procedures 1994, 1998 update.
18. McCoy L.E., Weiss R.A. Neutralizing antibodies to HIV-1 induced by immunization. J. Exp. Med. 2013; 210 (2): 209 - 223.
19. Pleguezuelos O., Stoloff G.A., Caparr s-Wanderley W. Synthetic immunotherapy induces HIV virus specific Th1 cytotoxic response and death of an HIV-1 infected human cell line through classic complement activation. Virology Journal. 2013; 10: 107 - 120.
20. Chen Y.M., Lin R.H., Lee C.M., Fu C.Y., Chen S.C., Syu W.J. Decreasing levels of anti-Nef antibody correlate with increasing HIV type 1 viral loads and AIDS disease progression. AIDS Res. Hum Retroviruses. 1999; 15 (1): 43 - 50.
21. Duri K., M ller F., Gumbo F.Z., Kurewa N.E., Rusakaniko S., Chirenje M.Z. et al. Human immunodeficiency virus (HIV) types Western blot (WB) band profiles as potential surrogate markers of HIV disease progression and predictors of vertical transmission in a cohort of infected but antiretroviral therapy na ve pregnant women in Harare, Zimbabwe. BMC Infect. Dis. 2011; 11: 7.
22. Opendra Narayan, Zhenqian Liu. HIV DNA vaccine сomposition and methods of use. Patent USA. 2011. № 8,003,113 B2.
References
1. Methodological letter No. 4174-PX dated 04.08.2006. Laboratory testing for HIV infection (including the study of immunity and viral load in HIV infection): 1 - 19 (in Russia).
2. Kim S.Y., Byrn R., Groopman J., Baltimore D. Temporal aspects of DNA and RNA synthesis during human immunodeficiency virus infection: Evidence for differential gene expression. J. Virol. 1989. 63: 3708 - 3713.
3. Pandori M.W., Fitch N.J., Craig H.M. Richman D.D., Spina C.A., Guatelli J.C.. Producer-cell modification of human immunodeficiency virus type 1: Nef is a virion protein. J. Virol. 1996. 70: 4283 - 4290.
4. Wieland U., K hn J.E., Jassoy C., R bsamen-Waigmann H., Wolber V., Braun R. Antibodies to recombinant HIV-1 NEF, tat, and nef proteins in human sera Medical Microbiology and Immunology. 1990. 179. 1: 1 - 11.
5. O'Neil C., Lee D., Clewley G., Johnson M.A., Emery V.C. Prevalence of anti-NEF antibodies in HIV-1 infected individuals assessed using recombinant baculovirus expressed NEF protein. J. Med. Virol. 1997: 139 - 44.
6. Frahma N., Lindea C., Brander C. Identi cation of HIV-Derived, HLA Class I Restricted CTL Epitopes: Insights into TCR Repertoire, CTL Escape and Viral Fitness. HIV Molecular Immunology. 2006: 3 - 28.
7. Alatortseva G.I., Nesterenko L.N., Volynskaya E.A., Amiantova I.I., Kabargina V.Y., Zukina M.V., Dotsenko V.V., Kudryavtseva E.N., Chartchenko O.S., Goltsov V.A., Zverev V.V. Production of recombinant polypeptide containing antigenic determinants of HIV-1 nef protein and its application for diagnosis of HIV infection by the line blot. Proceedings of the XI international Congress on modern problems of allergology, immunology and immunopharmacology. Russian Allergology J. 2011. 1 (4): 12 - 14 (in Russia).
8. Alatortsev V.E., Alatortseva G.I. Strain of bacterium Escherichia coli used for ecombinant proteins preparing. Patent RF, № 2043409; 1995 (in Russian).
9. Alatortsev V.E., Alatortseva G.I. Vector pel5a designated for foreign DNA expression. Patent RF, № 2071501; 1992 (in Russian).
10. News in DNA cloning. A practical approach. Ed. Glover D.M. Moscow, 1989: 122 - 128 (in Russian).
11. Sameh Magdeldin and Annette Moser. Affinity Cromatography: Principles and Applications, Affinity Chromatography. Ed.: S. Magdeldin. In Tech. 2012: 70 - 75.
12. Virca G.D., Travis J., Hall PK., Roberts R.C. Purification of -2-Macroglobulin by Chromatography on Cibacron Blue Sepharose. Analytical Biochemistry. 1978. 8: 274 - 276.
13. Rattana Wongchuphan, Beng Ti Tey, Wen Siang Tan, Senthil Kumar Subramanian, Farah Saleena Taip, Tau Chuan Ling. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochemistry 2011. 46: 101 - 107.
14. Practical Protein Chemistry. A Handbook. Ed.: A. Darbre. Moscow, 1989: 1 - 621 (in Russian).
15. Towbin H., Staehlin T., Gordon Y. Proc. nat. Acad. Sci. USA. 1979; 76: 4350 - 4359.
16. Nosik M.N., Ryzhov K.A., Kiseleva I.A., Kravtchenko A.V., Pokrovsky V.V. Biological properties of Human Immunodeficiency Virus strains isolated from HIV-infected individuals living in the territory of Russia over period of 2009-2010 year. ZniSO. 2011; 4 (217): 31 - 34 (in Russia).
17. End point neutralization assay. WHO Guidelines for Standart HIV Isolation Procedures 1994, 1998 update.
18. McCoy L.E., Weiss R.A. Neutralizing antibodies to HIV-1 induced by immunization. J. Exp. Med. 2013; 210 (2): 209 - 223.
19. Pleguezuelos O., Stoloff G.A., Caparr s-Wanderley W. Synthetic immunotherapy induces HIV virus specific Th1 cytotoxic response and death of an HIV-1 infected human cell line through classic complement activation. Virology Journal. 2013; 10: 107 - 120.
20. Chen Y.M., Lin R.H., Lee C.M., Fu C.Y., Chen S.C., Syu W.J. Decreasing levels of anti-Nef antibody correlate with increasing HIV type 1 viral loads and AIDS disease progression. AIDS Res. Hum Retroviruses. 1999; 15 (1): 43 - 50.
21. Duri K., Miller F., Gumbo F.Z., Kurewa N.E., Rusakaniko S., Chirenje M.Z. et al. Human immunodeficiency virus (HIV) types Western blot (WB) band profiles as potential surrogate markers of HIV disease progression and predictors of vertical transmission in a cohort of infected but antiretroviral therapy na ve pregnant women in Harare, Zimbabwe. BMC Infect. Dis. 2011; 11: 7.
22. Opendra Narayan, Zhenqian Liu. HIV DNA vaccine composition and methods of use. Patent USA. 2011. № 8,003,113 B2.
ERRATA
На странице 46 № 2 (87) журнала рисунок 3 «Филогенетические взаимоотношения штаммов Коксаки А6, выделенных в г. Райчихинске Амурской области в 2013 году» должен выглядеть следующим образом:
На странице 93 № 2 (87) журналан в Резюме на английском языке искажена фамилия автора Ку-рильщикова, должно быть КигП^сМко^ Редакция приносит глубокие извинения за допущенные ошибки.
