Иммунологические и молекулярно-генетические методы в эпидемиологическом надзоре за гепатит с-инфекцией Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМ НАДЗОРЕ ЗА ГЕПАТИТ С-ИНФЕКЦИЕЙ

(АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР)

Ю.В. Михайлова, Т.Н. Быстрова,

ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной»

Быстрова Татьяна Николаевна -e-mail: [email protected]

В обзоре на основании обобщенных данных литературы и собственных исследований представлены сведения о строении вируса, о диагностическом и эпидемиологическом значении специфических молекулярно-генетических и иммунологических маркеров вируса гепатита С, методах их определения. Приведены фундаментальные методологические данные о возможностях, которые дает использование молекулярно-генетических методов исследования по сравнению с рутинной диагностикой инфекции, основанной на применении ИФА. Особое внимание уделено нерешенным вопросам лабораторной диагностики гепатита С. Обзор предназначен для специалистов Роспотребнадзора, врачей клинической лабораторной диагностики, эпидемиологов, вирусологов, инфекционистов, студентов медицинских и биологических вузов.

Ключевые слова: вирус гепатита С, маркеры гепатита С, иммунологические и

молекулярно-генетические методы диагностики.

Data on a virus structure, on diagnostic and epidemiological value of specific molecular and genetic and immunological markers of a virus of hepatitis C, methods of their definition are presented in the review on the basis of the generalized data of literature and own researches. Fundamental methodological data on opportunities which use of molecular and genetic methods of research in comparison with routine diagnostics of the infection based on application of IFA gives are provided. The special attention is paid to unresolved questions of laboratory diagnostics of hepatitis C. The review is intended for specialists of Rospotrebnadzor, clinical laboratory diagnosticians, epidemiologists, virologists, infectiologists, students of medical and biological schools.

Key words: hepatitis C virus, hepatitis C markers, immunological and molecular and genetic methods of diagnostics.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время парентеральные вирусные гепатиты занимают одно из ведущих мест в инфекционной патологии человека как в целом по миру, так и в РФ. По оценкам экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), только гепатитом С (ГС) ежегодно в мире инфицируются 3-4 миллиона человек и более 350 тысяч умирают от болезней печени, связанных с этой инфекцией. Только хронической формой инфекции страдают около 150 миллионов человек, подвергая своё здоровье высокому риску развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]. Кроме того, ряд отечественных и зарубежных исследователей связывают с ХГС множественные внепеченочные проявления, что позволяет рассматривать данную инфекцию как системное заболевание [3, 8, 9, 10].

В настоящее время в практике отечественного здравоохранения, как и в мире, алгоритм лабораторного исследования включает первичное тестирование сывороток крови на суммарные антитела к антигенам вируса ГС (анти-ВГС), которые не удается обнаружить в период «серологического окна», где ГС-инфекцию можно зафиксировать только по наличию РНК-вируса. Внедрение

молекулярно-генетических методов исследования показало высокую генетическую гетерогенность ВГС [11, 12, 13, 14]. Положение о значительной генетической вариабельности РНК ВГС легло в основу теорий, объясняющих длительную персистенцию вируса и уход от иммунного ответа, частую хронизацию заболевания, трудности в терапии и создании эффективных вакцинных препаратов [2, 11, 12, 15, 16]. Известно, что различные генотипы вируса неодинаково влияют на особенности течения болезни, эффективность лечения и, возможно, на исход заболевания [17, 18, 16, 19, 20].

Значительная изменчивость генетической структуры вируса и многофакторность развития эпидемического процесса инфекции препятствуют созданию системы специфической профилактики и эффективному лечению хронических форм инфекции. При этом у подавляющего большинства больных заболевание протекает скрыто (латентно) и, как правило, остается недиагностированным [4, 21, 22, 23]. В этом случае из-за отсутствия своевременного лечения больные не только подвергают серьезному риску свое здоровье (у них может развиться цирроз печени, гепатоцеллюлярная карцинома), но и становятся источниками инфекции для других лиц. В такой ситуации

на первое место выходит совершенствование методов лабораторной диагностики ГС с целью раннего выявления инфекции, в частности максимально полное обнаружение ее скрытопротекающего компонента [24, 25, 26, 27, 28, 29]. Помимо безусловного клинического значения определение молекулярно-генетических маркеров ВГС представляется перспективным для решения задач эпидемиологического надзора за этой инфекцией. Все вышеизложенное определяет повышенное внимание к этой инфекции, актуальность и необходимость ее дальнейшего изучения.

1. ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА ГЕПАТИТА С

Начиная с 70-х годов XX века ГС был известен как "вирусный гепатит ни-А ни-В», передающийся парентерально (термин предложен С. Файнстоуном в 1974 г.). Открытие ВГС стало возможным в 1988 г. с применением новых молекулярно-биологических методов исследования, что позволило М. Houghton клонировать и секвени-ровать геном вируса для разработки диагностических препаратов. В 1989 г. К. Чу с коллегами установили, что возбудителем является РНК-содержащий вирус, который обозначили как «вирус гепатита С» [1, 30, 31].

ВГС был классифицирован как единственный вид рода Hepacivirus семейства Flaviviridae [1, 18, 30, 32]. Это небольшой сферический вирус диаметром 30-40 нм, покрытый оболочкой. Геном представлен однонитевой линейной молекулой РНК позитивной полярности (длиной около 9600 нуклеотидов). Одна открытая рамка считывания

кодирует полипротеин длиной 3008-3037 аминокислотных оснований, который процессируется комбинацией вирусных и клеточных протеиназ [32, 33, 34]. В геноме выделяют две зоны: первая расположена у 5'-области РНК и кодирует 3 структурных протеина (С/Соге, Е1 и Е2), вторая - у 3'-области и кодирует неструктурные (функциональные) белки (рис. 1).

На 5'- и 3'-концах генома вируса находятся нетрансли-руемые регионы (5'- и 3'-NTR). 5'NTR участвует в инициации трансляции благодаря наличию внутреннего рибосо-мального сайта (IRES). Наличие в 3'NTR-регионе РНК различных изолятов вируса высококонсервативного участка рассматривается как перспектива для разработки эффективных лекарственных препаратов [32, 34, 35].

С-белок на своей поверхности несет высококонсервативные В-клеточные эпитопы, которые используются при создании диагностикумов для выявления анти-ВГС [32, 34, 36, 37]. Участок Е2 содержит «гипервариабельный регион», увеличенная частота мутаций в котором играет ключевую роль в ускользании вируса от первичного иммунного ответа, мешая созданию эффективных вакцин против ВГС [31, 32, 35, 38, 39]. Было установлено наличие первого гипервариабельного региона у всех генотипов вируса, в то время как второй идентифицирован только у генотипа 1b, что может обуславливать более выраженную резистентность к интерферонотерапии у лиц, инфицированных данным субтипом ВГС [34, 40].

| SPP У SP (j NS2-3 pro JJ NS3 pro/4A

p v w и ода

5'NTR

E1

E2

NIS2

N33

NS4 AI В

NS5

_A_B_

I

ion

capsld envelope channel

serine- \ NS3-protease \ cofactor

replication

3'NTR

cysteine- NTPase/ protease h el i case

RdRp

Viral assembly

JJ

host factors

RNA replication

РИС. 1.

Организация генома вируса гепатита С (Suzuki T. et aL, 2007): SSP - посттрансляционное расщепление сигнальной пептидазой (SP), RdRp - РНК-зависимая РНК-полимераза.

Для неструктурных белков приняты обозначения NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B (NS от англ. Nonstructural). Они необходимы для репликации вируса и выполняют функции различных ферментов (протеазы, хеликазы, РНК-зависимой РНК-полимеразы) [32, 34, 35, 41, 42, 43]. Особый интерес представляет высоковариабельный участок региона NS5A, определяющий чувствительность к интерферону [32, 34, 35]. В работах I. Okura et al. (2004) и Е. Herrmann et al. (2004) установлено важное значение этого участка генома в формировании механизмов ус-тойчивости клеток к действию интерферона [44, 45]. К развитию лекарственной устойчивости при комбинированной терапии ведет и появление мутации V851 (замена валина на изолейцин в регионе NS5B) [46].

До сих пор не выяснена функциональная роль белков ВГС в формировании хронического ГС (ХГС), а также не выявлены маркеры инфекции, ассоциированные с активностью и стадией ХГС. Выяснение структуры и свойств вирусных белков необходимо как для решения теоретических проблем (локализация антигенных и иммуногенных детерминант, определение протективных эпитопов - анти-ВГС не обладают полноценными про-тективными свойствами в отношении вируса вследствие его высокой генетической вариабельности), так и задач практической медицины - создания профилактических средств, терапевтических препаратов и диагностических тест-систем [3, 47]. На основе изучения функциональной роли вирусных белков, кодированных неструктурной зоной РНК ВГС, в настоящее время разработаны новые лечебные препараты (ингибиторы протеазы, полимера-зы), которые способны блокировать репликативную активность вируса.

Сравнительный анализ гомологии нуклеотидных последовательностей РНК изолятов ВГС, полученных в различных регионах мира и даже в процессе заболевания от одного и того же пациента, выявил самую высокую генетическую гетерогенность генома этого вируса среди других возбудителей вирусных гепатитов [13, 18, 34, 48]. Современная классификация (Simmonds P. et al., 1998) включает 6 генотипов и более 100 субтипов (обозначаются латинскими буквами в порядке их открытия: 1а, 1b, 2а, 2b, 2с, 3а и т. д.) и множество квазивидов вируса [18, 34, 49].

Высокая изменчивость РНК ВГС определяется, с одной стороны, появлением точечных мутаций, вставок и деле-ций, возникающих при репликации вируса, с другой стороны, рекомбинациями между изолятами. Исследования, касающиеся формирования новых генетических вариантов вируса, единичны как в РФ, так и в мире. На сегодняшний день описано несколько случаев подобной рекомбинации между разными генотипами

ВГС: наиболее известны 1а/1Ь и 2к/1Ь, последняя из которых зафиксирована в России [12, 13, 14, 50]. Выявленные рекомбинанты - результат естественной эволюции ВГС. Они жизнеспособны и могут оказывать влияние на проведение интерферонотерапии. В связи с чем адекватная оценка возможности формирования устойчивого вирусологического ответа (УВО) должна основываться на типиро-вании ни одной, а сразу нескольких областей генома ВГС.

2. ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ГЕПАТИТА С

Поскольку ГС-инфекция чаще всего протекает бессимптомно, своевременная диагностика ее значительно затруднена. Антигены вируса изучены недостаточно, они циркулируют и накапливаются в организме больных в низких (не детектируемых) концентрациях (могут быть обнаружены только в ткани печени). Поэтому лабораторная диагностика ГС в первую очередь основывается на обнаружении в образцах сывороток или плазмы крови человека специфических анти-ВГС, относящихся к иммуноглобулинам классов G и М 1дМ) (рис. 2).

Ahth-HCV-IEG

%

/1//Х V /1// л \ Ч \

и г/ г \ ч. \

Ос граи '¿> Латентная ° % Фаза

фа in Л 1 О | фаш 2 п I реактивации

РИС. 2.

Динамика антителообразования и появления РНК при гепатите С (Ястребова О.Н., 2006).

Раньше всего, через 1-3 недели после инфицирования, до повышения уровня сывороточных трансаминаз, в сыворотке крови больных выявляется РНК вируса, которая является первым маркером при остром ГС (ОГС). В начале заболевания она может выявляться изолированно без других маркеров инфекции. В латентную фазу ХГС, при которой происходит длительное персистирование вируса без ярко выраженных клинических проявлений, регистрируется низкая вирусная нагрузка в отличие от фазы реактивации инфекционного процесса, когда она определяется в сыворотке крови в высокой концентрации [31, 51, 52].

Сероконверсия в острой стадии заболевания возникает на 1-2 месяца позже появления признаков цитолиза гепа-тоцитов (повышения активности трансаминаз). Лишь

через 1,5 месяца от начала заболевания в крови больных начинают определяться антитела IgM к оболочечным белкам (чаще к Е2) и ядерному (core) антигену ВГС с нарастанием их титра в динамике [1, 22, 31, 52, 53, 54]. Считалось, что из-за раннего появления и относительно короткого времени жизни детекция анти-ВГС IgM позволяет диагностировать острую инфекцию. Сегодня известно, что они могут выявляться и при ХГС. В случае выздоровления анти-ВГС IgM обычно исчезают в течение первых двух месяцев [52, 53]. Затем через 3-4 недели выявляются core IgG. Известно, что среди антител к неструктурным белкам вируса на самых ранних этапах инфекции выявляются анти-ВГС-№3, они считаются критерием острой фазы и в высоких титрах свидетельствуют о значительной вирусной нагрузке. Резкое снижение титров IgG к core- и NS3-белкам является благоприятным прогностическим признаком и свидетельствует о вероятной самоэлиминации вируса. Анти-ВГС-№4 и NS5, как правило, появляются позднее. Антитела к №4-антигену могут отсутствовать в острую фазу болезни и свидетельствуют о длительности инфекционного процесса, коррелируя со степенью поражения печени и считаются косвенным маркером вирусной репликации [52, 53]. Постоянные величины титра анти-ВГС core, NS4, а также раннее появление анти-№5 и длительная (более 2 мес.) циркуляция антител класса IgM к ВГС рассматриваются как признаки перехода заболевания в хроническую стадию [31, 51, 52]. В фазе реконвалесцен-ции раньше всех исчезают анти-ВГС-№4 и NS5, в то время, как core-антитела могут сохраняться пожизненно у трети больных и свидетельствовать об инфекции, перенесенной в прошлом [52, 53, 55]. Имеются данные об изменении спектра антител под действием эффективной интерферонотерапии, когда уже через год обнаруживаются только core- и/или №3-антитела [3, 55]. В ряде работ присутствие только одного из NS4,5 уже рассматривается как неблагоприятный прогностический признак при проведении интерферонотерапии [53, 55]. 2.1. Иммуноферментный анализ Скрининговые тесты для обнаружения анти-ВГС IgG Основным методом, применяемым для детекции анти-ВГС, стал твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) [49]. История создания ИФА-диагностикумов для обнаружения анти-ВГС насчитывает четыре поколения [49, 53, 55] (таблица). В 1989 г. (под руководством Q.-L. Choo, фирма Chiron Corporation) на основе иммуно-реактивного олигопептида С100-3 была создана первая тест-система для выявления антител к одному из неструктурных белков вируса NS4 [53, 54]. В диагностические препараты 2-го поколения были введены дополнительные пептиды (С22-3 Core; С200 NS3 и NS4; С33с NS3), что позволило увеличить чувствительность, специфичность и,

главное, выявляемость анти-ВГС. Так, с помощью диагно-стикумов первого и второго поколений позитивный результат регистрировали на 10-й и 16-й неделях заболевания. В диагностических препаратах 3-го поколения дополнительно стал использоваться пептид, кодированный NS5 регионом РНК, что позволило выявлять анти-ВГС со 2-3-й недели заболевания. Пептиды, применяемые в диагностических препаратах 3-го поколения, были получены при помощи рекомбинантной технологии. Внедрение диагностикумов этого поколения в службу переливания крови позволило резко сократить число случаев пост-трансфузионного ГС. В дальнейшем появились диагно-стикумы, обозначавшиеся как препараты 4-го поколения. По своим характеристикам, по сравнению с диагностику-мами 3-го поколения, эти препараты не несли значительных изменений, за исключением одновременного использования двух видов пептидов: рекомбинантных и синтетических белков, кодируемых core-, NS3-, NS4-, NS5-регионами генома вируса. Современные диагностикумы обладают достаточно высокой чувствительностью, специфичностью и простотой использования [49, 31, 52, 56].

ТАБЛИЦА.

Диагностические препараты для выявления антител к вирусу гепатита С (Ястребова О.Н., 2006)

Поколение Применяемые пептиды, зоны РНК ВГС, в которых они кодированы Обнаружение анти-ВГС, % Время первого выявления анти-ВГС от начала желтухи

Первое 5-1-1 NS3 С100-3 NS4 70-80 % 30-90 дней

Второе С22-3 Core С200 NS3 и NS4 СЗЗс NS3 С 100-3 NS4 92-95 % 20-25 дней

Третье С22-3 Core С200 NS3 и NS4 СЗЗс NS3 Пептид NS5 97% 7-10 дней

Кроме того, существует ряд экспресс-тестов (например, «ВГС-экспресс», ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск; «Signal HCV Flow through», ЗАО «БиоХимМак», г. Москва; «ИммуноХром-анти-ВГС-экспресс», «ПБМ Технологии», г. Москва), предназначенные для быстрого (в течение 10 минут) выявления анти-ВГС в крови, сыворотке или плазме. Принцип работы основан на варианте иммунного твердофазного дот-анализа с использованием антигенов ВГС (core, NS3, NS4, NS5). Они просты в применении, не требуют специального оборудования, дают возможность проведения единичного анализа, но обладают более низкой чувствительностью и характеризуются большим количеством ложноотрицательных результатов [52, 53]. Поэтому они не нашли широкого применения в лабораторной практике, но могут использоваться для экстренной детекции анти-ВГС.

Одной из наиболее важных проблем при проведении ИФА на наличие анти-ВГС является получение ложно-отрицательных результатов, причины которых могут быть разными. Это во многом связано с тем, что наборы реагентов из-за высокой антигенной изменчивости вируса не всегда способны улавливать измененные паратопы антител, циркулирующих в крови инфицированного человека [3, 24, 27, 57]. Также у пациентов возможно наличие как острой инфекции в период «серологического окна», так и хронической - с отсутствием специфического антитело-образования, как правило, на фоне иммуносупрессии у лиц с ВИЧ-инфекцией, после гемодиализа и трансплантации органов, у новорожденных с перинатальной инфекцией и т. д. [28, 40, 58, 59, 60, 61]. Так, при развитии ОГС в условиях постоянно повышающейся концентрации антигена в результате репродукции вируса происходит активное снижение концентрации специфических антител за счет их включения в состав иммунных комплексов. Кроме того, гуморальный иммунитет подавляется в результате синтеза набора цитокинов, стимулирующих клеточное звено иммунной системы [62]. Так, наблюдается длительное «серологическое окно» от 3 до 6 месяцев, на протяжении которого тест является отрицательным, до тех пор, пока количество антител не достигнет детектируемого уровня [23, 42, 57, 63]. В этот период инфицированные лица являются потенциальными источниками ГС. Современная система обеспечения безопасности донорской крови, ее препаратов и донорских органов на наличие ВГС включает первичное тестирование на анти-ВГС и только позитивные образцы исследуются на наличие РНК [63]. В такой ситуации актуальным является вопрос о повышении чувствительности используемых методов, направленных на сокращение «серологического окна».

Одно из решений данной проблемы предложено фирмой SMART Biotech (Израиль). Разработанная ими технология «СМАРТтюб™ HIV&HCV» позволяет выявлять подавляющее большинство инфицированных в инкубационном периоде. Принцип методики заключается в предварительной обработке свежесобранной цельной крови человека для максимальной активации, дифференциации и пролиферации лимфоцитов с целью стимуляции выработки специфических антител к ВГС in vivo. Полученный после инкубации при 37-38°С (СО2 5%) в течение 3-5 суток образец плазмы крови используют для тестирования доступными наборами реагентов для ИФА на наличие анти-ВГС. Проведенные лабораторные исследования показывают высокую эффективность выявления антител независимо от локализации вируса, тест может быть положителен на всем протяжении инфекции [62]. СМАРТ-тюб™ HIV&HCV достаточно дорогостоящий, но не требует специального оборудования, что позволяет

использовать его в рутинной лабораторной практике в сложных случаях диагностики.

Как известно, чувствительность и специфичность скри-нинговых тестов во многом зависит от используемых компонентов: антигенов или антител. Постоянно ведутся исследования по разработке более эффективной подложки для коммерческих тест-систем, максимально учитывающей высокую изменчивость вируса. Так, И.С. Астраханцевой с соавт. (2012 г.) отмечено, что в ряде случаев сероконверсия анти-ВГС способна приводить к значительным изменениям в структуре популяции квазивидов вируса [64]. Селективный отбор жизнеспособных мутантов ведет не только к ускользанию вируса от иммунного ответа организма, но и к формированию антител с измененными паратопами, которые не будут улавливаться в диагностических тестах. Поэтому вопрос о способности различных иммуноферментных тест-систем определять анти-ВГС у пациентов с различными генотипами вируса требует пристального внимания. Поскольку все коммерческие тесты используют в качестве антигенов рекомбинантные белки или синтетические пептиды, созданные на основе полипротеиновой последовательности ВГС 1-го генотипа. Имеются данные, что антигены, полученные из NS3 области ВГС 1-го генотипа, в 5 раз более эффективно узнают антитела в сыворотках крови больных, инфицированных вирусом ВГС 1-го генотипа, чем в клиническом материале от больных, инфицированных вирусом 2-го или 3-го генотипов [65].

С другой стороны, важной становится проблема регистрации ложнопозитивных результатов, доля которых может составлять 10-20%. Причины различны: неспецифическое взаимодействие компонентов реакции, перекрестные реакции с другими вирусными антигенами, неправильная пробоподготовка и другие факторы [41, 91]. Для разграничения образцов, истинно содержащих анти-ВГС, разработаны подтверждающие (supplemental) тесты, что является обязательным условием получения достоверного результата [31, 32, 57].

Подтверждающие тесты

В настоящее время приказом Минздравсоцразвития России «О применении в практике здравоохранения ИФА тест-систем для выявления поверхностного антигена ВГВ (HBsAg) и антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в сыворотке крови человека» № 322 от 21.10.2002 г. с января 2004 г. запрещены к применению диагностические тест-системы для подтверждения анти-ВГС, содержащие неполный спектр структурных и неструктурных белков вируса [66]. Для подтверждения положительных результатов применяют тест-системы типа «Спектр» или иммуноблоты на основе раздельного выявления антител к структурным и неструктурным антигенам вируса:

1. определение антител к ВГС в сыворотке и плазме крови к отдельно сорбированным рекомбинантным антигенам ВГС методом ИФА (core, NS3, NS4, NS5) («ABBOTT HCV EIA SUPPLEMENT ASSAY»; «Бест Анти-ВГС-спектр» ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск;);

2. метод иммуноблотинга («МОНОЛИЗА ВГС Аг-Ат Ультра» ООО «БИО-РАД Лаборатории», США; «ИННО-ЛИА ВГС усовершенствованный» ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС», г. Москва; «Лайн-Блот ВГС» ЗАО «ЭКОлаб», г. Электрогорск; «ВГС-блот БЕСТ» ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск; «Иммуноблот HCV IgG» ЗАО «БиоХимМак», г. Москва; «recomBlot HCV IgG 2.0» Mikrogen, Германия; «Иммуноблот HCV IgG» «Ortho Clinical Diagnostic», США; «ДЕСИСКАН ВГС ПЛЮС Дополнительный тест-блот» ООО «Био-Рад», Франция).

Тест-системы типа «Спектр» предполагают исследование сыворотки крови в четырёх лунках планшета, в каждую из которых нанесен только один рекомбинантный или синтетический вирусный пептид. Взаимодействие анти-ВГС с адсорбированными антигенами определяется с помощью меченных ферментом антител против IgG человека [22, 49, 53]. Иммуноблоты, в случае ГС, представляют собой нитроцеллюлозные полоски, где в виде отдельных полос адсорбированы рекомбинантные белки и/или синтетические пептиды (core 1,2; NS3, NS4, NS5; иногда Е2- пептид), соответствующие определенным антигенным детерминантам ВГС [31, 52]. Использование в качестве подтверждающего теста иммуноблота позволяет снять часть ложноположительных результатов, однако требует больших финансовых и временных затрат. В данных тестах все важные патоген-специфические антигены представлены на одной тест-полоске/стрипе, следовательно, возможно профильное определение соответствующих антител в одном анализе. При этом лабораторные исследования показывают, что некоторые наборы для иммуноблота по чувствительности уступают ИФА-диагностикумам, т. е. дают ложноотрицательные результаты. Кроме того, тест-системы типа «Спектр» обладают автоматизированной детекцией результатов опыта в отличие от иммуноблота, когда субъективность визуальной оценки полученных данных определяет возможность получения ложноположительных образцов [52, 54, 57].

Высокая стоимость иммуноблота и значительный расход клинического материала (сыворотки или плазмы крови человека) в ИФА-диагностикумах типа «Спектр» требуют создания нового класса диагностических препаратов. Один из вариантов теста, совмещающего скринин-говый и подтверждающий анализ в одном формате с использованием минимального объема биологического материала, предложен сотрудниками ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Принцип работы экспериментального

иммуночипа построен на непрямом методе выявления специфических антител к ВГС с помощью флуоресцентной детекции. Помимо рекомбинантных антигенов core, NS3, NS4, NS5, иммобилизованных на стекле (микроскопном слайде) в двух повторах в виде индивидуальных спотов, в состав иммуносорбента включены внутренние контроли. При трактовке полученных данных также возможно получение сомнительных результатов. Сравнительное исследование показало более высокую чувствительность и специфичность по спектру выявляемых антител в экспериментальном иммуночипе по сравнению с ИФА-подтверждающими тест-системами, при этом требуется всего лишь 35 мкл биологического материала [56].

В целом, подтверждающие тесты обладают более высокой чувствительностью и специфичностью. При интерпретации результатов ИФА определяется коэффициент позитивности, величина которого отражает наличие и количество специфических антител [22]. Результаты проведенных исследований могут трактоваться как: «позитивный», «негативный» и «неопределенный» (понятие озвучено на Российском консенсусе по вирусному гепатиту С, 2000). Так, согласно критериям, внесенным в инструкции к некоторым тест-системам (например ЗАО «Вектор-Бест»), изолированное выявление антител к одному из неструктурных белков вируса не дает точного ответа о позитивности сыворотки. Другие отечественные производители положительным считают результат при выявлении антител даже к одному антигену вируса (например, НПО «Диагностические системы»). В основном изолировано регистрируются анти-ВГС IgG к NS4 и NS3 белкам вируса, что в ряде случаев может быть обусловлено неспецифическим реагированием рекомбинантных антигенов и синтетических пептидов, входящих в состав диагностикумов, с белками сыворотки крови обследованного [22, 53, 67]. В качестве подтверждающего метода можно использовать обратную транскрипцию-полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) с целью выявления РНК вируса. При этом ряд исследователей отмечают, что в сыворотках крови с изолированными антителами к неструктурным белкам вируса РНК, как правило, выявляется крайне редко [15, 67]. В настоящее время надежных критериев, гарантирующих положительный или отрицательный результат, по данным ИФА и иммуноблота нет. В качестве дополнительных критериев позитивности некоторые исследователи рассматривают косвенные показатели:

• высокий сигнал в ИФА (величина КП ^3),

• повышенный уровень АлАТ,

• наличие в крови РНК ВГС.

Вероятность того, что неопределенный результат ИФА может быть вследствие неспецифического связывания, возрастает, если при наблюдении в динамике:

• значения КП при определении анти-ВГС не увеличиваются,

• антитела к другим белкам ВГС не появляются,

• результат ПЦР на РНК ВГС отрицательный,

• определяется нормальный уровень АлАТ и АсАТ,

• клинические признаки ГС отсутствуют [27].

Определение антител к ВГС класса IgM

Анти-ВГС IgM служат маркером как острой, так и хронической ГС-инфекции (выявляются в 50-93% и 50-70% случаев соответственно) [53, 57]. В основе диагностических наборов для их обнаружения чаще используется пептид, кодированный core-регионом РНК ВГС («РекомбиБест анти-ВГС-IgM» ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск; «ИФА-АНТИ-Н^-М» НПО «Диагностические системы», г. Н. Новгород). При исследовании анти-ВГС IgM могут быть зарегистрированы лож-нопозитивные результаты при наличие сопутствующих системных заболеваниях соединительной ткани, некоторых опухолей, ревматизма; образования неспецифических антител с паратопами, схожими с анти-ВГС, при беременности [31, 49, 53].

Определение индекса авидности антител к ВГС класса IgG

Одной из главных задач лабораторной диагностики ГС является не только постановка диагноза, но и разграничение стадий заболевания с дальнейшим прогнозом течения болезни посредством выявления серологических маркеров инфицирования. Как и при других острых вирусных гепатитах, серологические маркеры инфицирования ВГС последовательно появляются и исчезают по ходу инфекции и процесса выздоровления. Сейчас наличие анти-ВГС IgM не является достоверным и достаточным признаком для дифференциации первичной и обострения хронической ГС-инфекции, поскольку могут коррелировать лишь с частотой обнаружения РНК вируса. Интерпретация результатов исследований других Ig также вызывает затруднения. Так, не всегда наблюдается и достоверный рост титра специфических антител класса IgG при обострении ХГС. Таким образом, чтобы установить момент инфицирования и разграничить стадии заболевания: первичный процесс, пастинфекцию или реактивацию инфекционного процесса, был предложен тест на определение авидности IgG анти-ВГС [53, 68].

Авидность - это степень прочности связывания антитела с антигеном [32]. Под воздействием антигена ВГС происходит процесс стимуляции и отбора В-лимфоцитов иммунной системы, что приводит к увеличению авидности IgG, низкой после первичного контакта с антигеном и возрастающей в течение последующих месяцев. Высокоавидные антитела остаются в организме длительное время, за счет которых развивается быстрый вторичный иммунный ответ [32, 68].

В настоящее время существует целый ряд ИФА тест-систем для определения индекса авидности анти-ВГС например, «ДС-ИФА-АНТИ-Н^-АВИДНОСТЬ» НПО «Диагностические системы», г. Н. Новгород. Суть метода заключается в образовании иммунных комплексов тестируемых антител с адсорбированными антигенами вируса; после промывания планшета в часть лунок добавляют раствор, удаляющий «ранние» ^ с низкой авидностью; после остановки ферментативной реакции измеряют оптическое поглощение окрашенного раствора с помощью спектрофотометра. Присутствие в исследуемом образце специфических антител с низкой авидностью определяется снижением интенсивности окрашивания по сравнению с лунками без раствора, удаляющего «ранние» ^ [32, 68].

Согласно данным литературы средний индекс авидно-сти (ИА) для острой первичной стадии ГС-инфекции составляет 18,6-33,7% (срок сероконверсии до 65 и более 65 дней соответственно). ИА у лиц с перенесенной инфекцией - до 54% в среднем, что свидетельствует о наличии в сыворотке высокоавидных Образцы сывороток крови от пациентов с хронической инфекцией показывают средний ИА 95% [53, 68, 69]. Но надежным показателем для определения стадии течения инфекции тест назвать нельзя, поскольку авидность специфических антител нарастает очень быстро, в течение 1-3 месяцев, а иногда этот период ограничивается всего несколькими неделями [53, 68]. Поскольку величина ИА для одной и той же стадии заболевания может колебаться в широких пределах, этот вопрос требует дальнейшего изучения. Все вышесказанное не позволяет данному тесту занять прочное место в современной ИФА-диагностике ГС-инфекции.

При этом в ряде исследований показано, что наличие высокоавидных анти-ВГС соге и высокие концентрации анти-ВГС №3, -№4, -№5 у детей 1-го года жизни свидетельствуют о носительстве материнских антител. У здоровых детей концентрация этих антител постепенно снижается до полного исчезновения к возрасту 12 месяцев при сохраняющемся ИА выше 50%, при перинатальной передаче высокоавидные антитела матери в течении первого года постепенно заменяются низкоавидными, с последующим нарастанием ИА [22, 69].

Определение соге-Ад ВГС

Известно, что соге-антиген и антигены, кодированные №3-и №4-зонами РНК ВГС, удается обнаружить менее чем в 5% гепатоцитов [31]. В сыворотке крови непосредственное обнаружение соге-антигена ВГС весьма затруднено малым количеством вирусных частиц в сыворотке больного, не превышающим 105/мл, что чаще бывает ниже предела чувствительности ряда иммунологических тестов. Кроме того, имеются данные о прямой корреляции

между концентрацией РНК ВГС и выявлением соге-Ад ВГС [31, 54]. Данный тест удобен при выявлении ранней стадии ГС-инфекции, до появления вирус-специфических антител. Показано, что соге-антиген определяется через 2-3 дня после обнаружения РНК ВГС и несет высококонсервативные иммунодоминантные эпитопы для большинства известных штаммов [52, 53, 54]. С другой стороны, при наличии вирус-специфических антител в исследуемых пробах приходится вводить процедуру дезагрегации иммунных комплексов. Сейчас эту проблему пытаются решить по-разному. Так, в ЗАО «Эпитек» (г. Новосибирск) из сыворотки крови иммунных животных были получены диагностические антитела к консервативным эпитопам соге-антигена и вариабельным Е2, что позволяет выявлять антигены ВГС без предварительного разрушения иммунных комплексов [54]. На российском рынке в последние годы появилась новая тест-система ООО «Био-Рад» (Франция) «Монолиза ВГС Аг-Ат Ультра», где совместное выявление антиген-антитело позволяет сократить «серологическое окно» на 70% (до 5 дней уступая ПЦР-исследованию) [59, 70]. Сейчас имеются и российские аналоги - «ВГС АГ/АТ-ИФА-БЕСТ» ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск; «ДС-ИФА-Н^-АГАТ» НПО «Диагностические системы», г. Н. Новгород. Все анти-ВГС-позитивные образцы выявляются как положительные в новом тесте. По мнению авторов, эти диа-гностикумы обладают высокой специфичностью, чувствительностью и могут использоваться для скрининга донорской крови [70].

Таким образом, в настоящее время постоянное повышение диагностической чувствительности и специфичности тестов для определения анти-ВГС должно являться одной из основных задач лабораторной диагностики данной инфекции.

2.2. Молекулярно-генетические методы лабораторной диагностики инфекции

Применение рутинного ИФА для индикации серологических маркеров ГС является лишь косвенным методом инфицирования ВГС [24, 53]. Внедрение в лабораторную практику ПЦР предоставило возможность использовать прямой лабораторный метод для обнаружения возбудителя в небольшом количестве легкодоступного биологического материала, позволяя определять РНК ВГС в детектируемых количествах через 1-3 недели после инфицирования [28, 71].

Качественное и количественное определение РНК

Сравнение первичной структуры 5'NTR-области генома различных изолятов ВГС выявило их незначительную изменчивость. Это сделало предпочтительным использование праймеров из данной зоны РНК в диагностических тест-системах [18]. Первый стандартизированный набор

для определения РНК ВГС («Amplicor TM HCV», «Roche Diagnostic Systems», Швейцария), изготовленный в 1993 года, позволял выявлять 100 и более копий/мл. Дальнейшему повышению эффективности методики способствовало введение в диагностические наборы реагентов внутреннего контроля на этапе пробоподготовки [57, 72]. Чувствительность современных диагностикумов составляет 10-50 копий РНК в 1 мл крови, или 50-100 МЕ/ мл) («АмплиСенс HCV-EPh», «АмплиСенс HCV-FRT», «АмплиСенс HCV Монитор», «АмплиСенс HCV Монитор FRT» ООО «ИнтерЛабСервис», г. Москва; «ОТ-ГЕПАТОГЕН-С», «ОТ-ГЕПАТОГЕН-С количественный», ЗАО «НПФ ДНК-Технология», г. Москва; «COBAS AmpliPrep TM», «COBAS Amplicore HCV 2.0», «COBAS Amplicore HCV Monitor 2.0», «Amplicore HCV Monitor 2.0», «Roche», Швейцария) [6, 45].

Большинство коммерческих тест-систем рассчитано на использование для анализа сыворотки и/или плазмы крови. При этом имеются данные, что тестирование образцов сыворотки/плазмы крови не позволяет определить истинный уровень вирусной нагрузки в отличие от использования в качестве биоматериала цельной крови. Использование образцов цельной крови для определения РНК позволяет выявлять более низкий уровень виремии, что имеет особое значение для раннего прогнозирования рецидива ГС-инфекции при проведении интерфероноте-рапии [57, 73].

Как известно, вирусные геномы обычно присутствуют в биологических субстратах в малых количествах и для их выявления, количественной оценки необходима стадия предварительного усиления либо сигнала (разветвленная ДНК), либо мишени (ПЦР). Наиболее широкое применение для обнаружения РНК ВГС получили различные варианты ПЦР.

Основные молекулярно-генетические методы, применяемые для определения РНК ВГС:

1. ОТ-ПЦР (Reverse transcription polymerase chain reaction-RT-PCR) - метод ферментативной наработки количества копий специфических фрагментов комплементарной ДНК (кДНК) с предшествующим этапом обратной транскрипции (впервые успешно применен в 1989 г. рядом исследователей). Используемая в качестве фермента ДНК-зависимая ДНК-полимераза (источник - бактерии Thermophilus termus (Tth-полимераза), или Thermophilus aquaticus (Taq-полимераза)) обладает термостабильностью в присутствии ионов марганца, магния и может быть одновременно использована для синтеза комплементарных одноцепочечных молекул кДНК ВГС и амплификации избранных участков кДНК [74, 75]. Анализ результатов реакции может быть проведен «по конечной точке», как это реализовано в гель-электрофоретической (ЭФ) и

флуоресцентной (FLASH) детекции. Сейчас все более широкое распространение получает метод гибридизаци-онно-флуоресцентной детекции в режиме «реального времени» («Real-Time») [10, 72, 74]. Отличительными чертами последнего являются:

- исключение контаминации на этапе детекции продукта реакции, поскольку регистрация результатов идет в закрытой пробирке непосредственно в момент проведения амплификации (упрощая процедуру проведения анализа);

- визуальное отражение течения процесса дает возможность оценки исходного количества копий кДНК в образце;

- повышение чувствительности теста (100 МЕ/мл для «Real-Time» в сравнении с 103 МЕ/мл при ЭФ), что позволяет выявлять низкокопийные пробы, тем самым снижая долю нетипированных образцов;

- высокая специфичность благодаря применению оли-гонуклеотидных зондов, строго специфичных к амплифи-цируемому фрагменту;

- автоматизированная система регистрации данных практически полностью исключает неверную трактовку результатов [19, 74,75].

С целью повышения чувствительности (в несколько раз) и контроля специфичности диагностических тестов для выявления РНК ВГС ряд исследователей применяют модификацию метода, так называемую «гнездовую» ПЦР (nested PCR). Отличие от «классической» методики заключается в одновременном использовании двух пар прай-меров: внешние (прямой и обратный) для кДНК-матрицы с образованием 1-го ПЦР-продукта; внутренние праймеры (обычно короче по отношению к олигонуклеотидам начальной стадии реакции), которые комплементарно связываются с внутренним участком ампликона первого раунда амплификации с образованием 2-го ПЦР-продукта [13,18]. Для детекции полученных продуктов амплификации используют электрофорез в горизонтальном геле. Применение универсальных праймеров, в отличие от типоспецифических, при постановке ПЦР-амплификации позволит их отжиг на матрице всех вариантов кДНК ВГС независимо от генотипа [38]. Но введение второго раунда амплификации и, как следствие, манипуляции с уже амплифицированным материалом увеличивает риск кросс-контаминации (из пробирки в пробирку), что может привести к получению ложноположительных результатов. Решается эта проблема с помощью постановки ПЦР в одной пробирке за счет разницы температур отжига наружной и внутренней пары праймеров (так называемая «Boost PCR») [12].

2. Лигазная цепная реакция выявления РНК ВГС (Ligase chain reaction - LCR) (1989 г.) - метод амплификации,

основанный на способности фермента ДНК-зависимой ДНК-лигазы сшивать (лигировать) разрывы фосфодиэ-фирной связи в ДНК в присутствии АТФ и ионов Mg2+. Для этого синтезируются два олигонуклеотида/праймера, комплементарные непрерывной последовательности кДНК ВГС: один - к 5'-концу, другой - к З'-концу. После связывания с кДНК праймеры остаются разделены лишь одноцепочечным разрывом и термостабильная лигаза соединяет их в полинуклеотид. Лигирование не происходит при отсутствии целевой последовательности. Кроме того, специфичность реакции обеспечивается тем, что неполное спаривание праймеров с матрицей в пограничной области предотвращает их лигирование. При последующей амплификации полинуклеотид и исходная кДНК служат матрицами для повторных циклов гибридизации, лигирования и диссоциации. Поскольку один праймер метится гаптеном или лигандом, а другой - с репортерной группой, появляется возможность детектировать полученные продукты непосредственно после амплификации, без использования электрофореза или секвенирования ДНК [49]. Чувствительность метода составляет около 100 копий РНК ВГС в 1 мл («Abbott Real Time HCV», «ABBOTT», США) [57].

3. Метод транскрипционно опосредованной амплификации (Transcription-mediated amplification - ТМА) отличается от RT-PCR и LCR тем, что непосредственно ампли-фицируются фрагменты РНК ВГС, а не кДНК («Versant HCV RNA Qualitative Assay (TMA)», «Bayer Diagnostic», США). На начальном этапе реакции на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезируется кДНК. Обратная транскриптаза, обладая также активностью РНКазы Н, разрушает вирусную РНК в гибриде РНК-кДНК. Затем молекула кДНК достраивается до двуцепочечной. С помощью РНК-полимеразы происходит транскрипция РНК с кДНК, что приводит к образованию от 100 до 1000 копий ампликона РНК ВГС в одном цикле реакции. Образовавшиеся РНК-ампликоны специфически взаимодействуют с ДНК-зондами, меченными хемилюминафо-рами, учет результатов реакции осуществляют на люмено-метре. К преимуществам ТМА-метода относятся:

- возможность проведения реакции при более низких температурах (в сравнении с ПЦР);

- образование большего числа ампликонов в одном цикле реакции, что уменьшает время для получения конечного результата (30-40 мин) и повышает чувствительность реакции (50 копий/мл);

- снижение риска контаминации, так как РНК менее устойчива, чем ДНК.

В ряде сравнительных исследований по детекции РНК ВГС при помощи ТМА и других методов продемонстрирован высокий уровень совпадения результатов [49]. В то же время, по данным С. Sarrazin (2002) применение ТМА

позволило обнаружить РНК ВГС в 36% образцов, для которых был получен отрицательный результат с использованием RT-PCR. В последствии такие «ТМА-позитивные» пациенты рассматривались как лица, не ответившие на комбинированную терапию, с низким уровнем вирусной нагрузки [121].

4. Метод гибридизации (образования двухцепочечных структур за счет взаимодействия комплементарных нукле-отидов). Метод основан на соединении меченых гибри-дизационных зондов (генноинженерные или синтетические молекулярные структуры, содержащие в себе нукле-отидные последовательности, комплементарные избранным участкам РНК) с искомой последовательностью РНК, зафиксированной на нитроцеллюлозной мембране. Учет результатов осуществляют по интенсивности сигнала, поступающего от метки в составе образовавшегося комплекса [31]. Некоторые исследователи считают, что одностадийная ПЦР с последующей гибридизацией с олигону-клеотидными зондами (меченными радио- или флуоресцентной меткой) по чувствительности не уступает двуста-дийной ПЦР с внутренней парой праймеров и предпочтительна при клинической диагностике инфекций, т. к. способствует снижению риска контаминации [49].

5. Сочетание принципов гибридизации и амплификации лежит в основе метода гибридизации с использованием разветвленных зондов (Branched DNA assay- bDNA) («Versant HCV RNA 3.0 (bDNA)», «Bayer Diagnostic», США). В отличие от ПЦР, в данном тесте осуществляется амплификация не молекул кДНК ВГС, а сигнала. Реакция проводится в 96 луночных планшетах, на которых адсорбируются олигонуклеотиды/ фрагменты РНК ВГС из 5'-NTR зоны и œre-региона, куда добавляется сывороточная РНК. Синтетическая молекула разветвленной ДНК связывается с подложкой, затем происходит её гибридизация с пробой, меченной щелочной фосфатазой с усилителем. За счет этого достигается резкое увеличение полученного сигнала (хеми-, флуоролюминесценции). Метод позволяет определять 2500 копий РНК ВГС в 1 мл [49, 75, 76].

Для ГС этот метод прежде всего нашел свое применение для определения РНК непосредственно в гепатоцитах - в тестах in situ hybridization. Кроме того, гибридизация позволяет выявлять репликативные цепи РНК ВГС. Доказано, что плюс-цепь не может служить критерием активной репликации при отсутствии минус-цепи - вирус находится в нере-пликативной стадии. При сопоставлении наличия плюс- и минус-цепей РНК ВГС в тканях печени, периферических мононуклеарах и сыворотке крови было установлено, что минус-цепь выявляется только в присутствии плюс-цепи, обратная зависимость отсутствует [49, 71].

Первоначально концентрацию РНК пытались охарактеризовать порядковыми величинами, например "+","++" и

т. д., визуально отражающими интенсивность полос, полученных при электрофорезе продуктов амплификации, или же методом конечных разведений, т. е. по наличию позитивного результата в конечной точке титрования. Трудности стандартизации всех этапов ПЦР и субъективность оценки полученных результатов способствовали дальнейшему развитию методики [49]. Один из вариантов, названный авторами полуколичественным, основан на использовании классической ПЦР с элекрофоретиче-ским выявлением продукта реакции и возможностью оценки вирусной нагрузки. На первом этапе для оценки концентрации вирусов применялся метод десятикратных серийных разведений кДНК ВГС [77]. В настоящее время международным стандартом ВОЗ 96/790 для количественного определения вирусного генома является образец плазмы крови в лиофилизированном виде, содержащий РНК ВГС 1-го генотипа в концентрации 105 МЕ/мл [16]. Результаты исследования выражают в количественных единицах: количество копий РНК, содержащихся в 1 мл, в абсолютном или логарифметическом выражении (log 10). Специальные коэффициенты позволяют переводить полученные показатели концентрации в МЕ. Для определения концентрации РНК применяют практически все варианты ПЦР. Наиболее широкое распространение получил количественный вариант метода ОТ-ПЦР в режиме «реального времени». Чувствительность применяемых коммерческих диагностикумов позволяет выявлять РНК вируса в концентрации 50 копий в мл, что особенно важно для прогнозирования эффективности избранной противовирусной терапии [16, 19].

Генотипирование изолятов вируса гепатита С

В настоящее время для гено/субтипирования РНК ВГС разработано несколько методов, основанных на использовании ПЦР:

1. Наиболее широкое распространение получила ПЦР с тип-специфическими (генотип- и субтип-специфически-ми) праймерами с использованием ЭФ, «FLASH» и «RealTime» детекции («АмплиСенс HCV-генотип», «АмплиСенс HCV-генотип FEP» «АмплиСенс HCV-генотип FRT», «АмплиСенс HCV 1/2/3 FL» ООО «ИнтерЛабСервис», г. Москва; «ГЕНОТИП-С» ЗАО «НПФ ДНК-Технология», г. Москва). Для амплификации выбирается наиболее вариабельный участок генома вируса, при этом выбранные праймеры отжигаются на разных участках выбранного региона в зависимости от генотипа.

2. Гибридизация ПЦР-продуктов с тип-специфическими олигонуклеотидами/ зондами («Versant HCV Genotyping Assay», «Bayer Diagnostic», США)

3. Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции ПЦР-продуктов (PCR-RFLP) (Thiers V. et al., 1997). Метод основан на рестрикции амплифицированного фрагмента

(чаще полученного с использованием гнездовой ПЦР) из 5'-NTR-области генома ВГС с помощью трех мелкощепя-щих эндонуклеаз/рестриктаз - BstN1, BstU1 и Sau3a, которые распознают уникальные комбинации нуклеотидов. Рестрицированные ПЦР-продукты разделяют в 3%-ом высокоразрешающем агарозном геле, который позволяет идентифицировать весьма короткие фрагменты: до 50-250 пар нуклеотидов. Использование маркера молекулярных масс и сравнительный анализ полученных элек-трофореграмм амплифицированных фрагментов, обработанных рестриктазами, позволяет сделать заключение о гено/субтипах ВГС [12, 13, 14, 18]. Сравнение результатов генотипирования методом ПЦР-RFLP с данными секвени-рования продемонстрировало высокий уровень совпадения - до 95% [49].

4. Определение нуклеотидных последовательностей участков генома методом секвенирования ПЦР-продуктов (от англ. sequence - последовательность) («TRUGENE HCV 5, NC Genotyping Kit», Bayer Diagnostic, США). Перед постановкой реакции ПЦР-продукты очищают, для чего можно использовать различные коммерческие наборы реагентов очистки фрагментов ПЦР («GFX PCR DNA and Gel Band purification kit», Amersham Pharmacia Biotech; «Axy Prep PCR Cleanup Kit Nucleic Acid purification kit», ООО «ИнтерЛабСервис», г. Москва) [18]. Принцип метода заключается в ферментативном синтезе олиго(поли) дезоксирибонуклеотидов с помощью ДНК-полимераз на основе матричного полинуклеотида. Можно секвениро-вать весь геном вируса (в несколько раундов с перекрыванием концов регионов и последующим их склеиванием), но чаще метод используется для отдельных участков, представляющих интерес. Синтез начинается (олигону-клеотид-затравка остается постоянным 5'-концевым фрагментом) и останавливается на одном из четырех мономерных звеньев (A, G, C, T), повторяясь 4 раза. Реакцию секвенирования проводят, используя один из праймеров, работавших в ПЦР. В более современном варианте дезок-синуклеотиды метят четырьмя разными флуоресцентными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке. В случае «минус-системы» присутствуют только три нукле-отида. Определение длины каждой копии фракционированием в полиакриламидном геле позволяет установить положение данного мономерного звена в цепи исследуемого полинуклеотида (луч лазера в определенном месте геля возбуждает флуоресценцию красителей и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель). Гель-электрофорез и чтение гелей проводят на автоматическом секвенаторе (ABI PRISM 377 или 310, Applied Biosystems). Сиквенсы ДНК читают, собирают и обрабатывают с помощью пакетов специализированных программ (LASERGENE, DNA STAR Inc., Madison, WI) с

дальнейшим построением филограмм. Так, множественное выравнивание полученных нуклеотидных последовательностей с данными по изучаемой области из GenBank может выполняться с помощью программы Clustal X [13, 18].

Секвенируемый участок генома должен быть достаточно вариабельным, чтобы обеспечить возможность диф-ференцировки различных изолятов одного и того же варианта гено/субтипа, а также иметь достаточно большое количество доступных нуклеотидных последовательностей изучаемой области (сиквенсы всех субтипов) в международной библиотеке данных EMBL (GenBank) [18]. Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей фрагментов генома ВГС с использованием данных GenBank позволило заключить, что оптимальным для подбора праймеров и зондов, специфичных к циркулирующим на территории РФ генотипам 1, 2 и 3, является 5'-NTR-rare и NS5B-область генома вируса (длиной около 670 п.о.) [19]. Сравнение первичной структуры 5'-NTR области генома различных изолятов ВГС выявило их незначительную изменчивость (между генотипами гомология нуклеотидов составляет 92-98%, а внутри генотипа -98-99%). Кроме того, первые 30 нуклеотидов core-региона являются высоко консервативными для всех генотипов ВГС (этот сегмент содержит IRES) [41].

Установление принадлежности выделенного штамма к определенному кластеру может помочь в выявлении завозных случаев ВГС, когда обнаруживается нехарактерный для данного региона изолят.

Определение полиморфизма гена интерлейкина - 28В

В России, как и за рубежом, получены аналогичные данные о влиянии полиморфизма гена интерлейкина 28В (ИЛ-28В) у пациентов с ХГС, инфицированных генотипом 1, на результаты лечения стандартным интерфероном/ рибавирином. Ген ИЛ-28В, кодирующий интерферон лямбда 3-го типа, расположен на 19-й хромосоме. Высоким предсказательным значением в отношении достижения УВО обладает однонуклеотидный полиморфизм аллелей С (цитозин) - замена цитозина на тимин (C>T) в позиции rs12979860, или полиморфизм аллелей Т (тимин) - замена тимина на гуанин (T>G) в позиции rs8099917 (обозначение в базе данных dbSNP центра биотехнологической информации США (National Center for Biotechnological Information, NCBI)). Генотип СС приблизительно в 2 раза чаще встречается у пациентов со спонтанным клиренсом ВГС при остром гепатите в сравнении с теми, у которых инфекция приобрела хроническое течение. Среди пациентов ХГС с генотипом 1 европеоидной расы, леченных пегилированным интерфероном/рибави-рином и имеющих генотипы СС, СТ и ТТ, устойчивый вирусологический ответ достигается в 69%, 33% и 27%

соответственно [78, 79]. В настоящее время в РФ зарегистрированы коммерческие тест-системы для определения полиморфизма гена ИЛ-28В, основанные на ПЦР с гибри-дизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» («АмплиСенс Геноскрин-^-28В^» ООО «ИнтерЛабСервис», г. Москва, «ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА» ЗАО «НПФ ДНК-Технология», г. Москва) и позволяющие дифференцировать гомо- и гетерозиготное состояние по каждой из исследуемых аллелей. Результат анализа в гене ИЛ-28В полезен в отборе пациентов для назначения двойной схемы противовирусной терапии с включением пегилированного интерферона/рибавирина или тройной схемы с включением одного из ингибиторов протеазы. Это дает основание рассматривать в случае необходимости (ограниченный экономический ресурс и показания для незамедлительного начала терапии) возможность проведения лечения стандартным интерферо-ном/рибавирином пациентов молодого возраста с 1 генотипом ВГС при условии выявления генотипа СС (полиморфизм rs12979860) гена ИЛ-28В человека.

3. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ В ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМ НАДЗОРЕ ЗА ГЕПАТИТ С-ИНФЕКЦИЕЙ

В условиях отсутствия специфической профилактики ГС-инфекции основной комплекс противоэпидемических мероприятий в первую очередь направлен на первые два звена эпидемического процесса и включает мероприятия, направленные на источник инфекции и разрыв механизма передачи. Изучение особенностей эпидемического процесса ГС определяется в первую очередь возможностями использования специфических методов диагностики инфекции в рутинной лабораторной практике. Их рациональное применение в эпидемиологической практике возможно только при четком понимании информативности определения специфических маркеров инфекции.

В настоящее время лабораторная диагностика ГС основана на выявлении специфических анти-ВГС IgG в сыворотке крови и проводится диагностическими препаратами для ИФА отечественных или зарубежных производителей четвертого поколения, которые разрешены Минздравсоцразвития России к продаже и применению на территории РФ [15, 57, 80]. В эпидемиологической практике этот серологический маркер используется для оценки этиологической структуры острых вирусных гепатитов и распространенности манифестного, латентного компонентов инфекции на конкретной территории. Так, с момента введения официальной регистрация ГС в России (1994 г.) удельный вес ГС в структуре острых вирусных гепатитов вырос с 2,3% в 1994 г. до 17,5-18,6% в 2010-2011 гг. [1, 81]. Анализ многолетней динамики заболеваемости различными формами ГС на отдельных территориях, и в

целом по РФ, показывает неблагоприятную тенденцию к росту хронической формы инфекции на фоне снижения заболеваемости ОГС [5, 20, 82]. Такая динамика, несомненно, является следствием улучшения диагностики хронической формы гепатита, а также отчасти отражает истинное увеличение активности эпидемического процесса ГС [1, 31]. Кроме того, до недавнего времени в статистической отчетности учитывалось понятие «носительство» ВГС, о котором судили по обнаружению анти-ВГС, при этом антитела появляются в организме инфицированного человека в ответ на проникновение возбудителя и являются лишь косвенным маркером инфекции. С 2009 г. «носи-тельство» ВГС не входит в число официально регистрируемых форм ГС.

Следует принимать во внимание, что в действительности распространенность инфекции в 4-6 раз превышает число официально регистрируемых случаев ГС [1, 31]. Для оценки истинной распространенности ГС-инфекции на каждой конкретной территории проводят скрининг на наличие анти-ВГС среди различных контингентов населения. Многочисленные исследования показывают неодинаковую распространенность анти-ВГС у отдельных контингентов обследованных. На территории РФ частота обнаружения маркеров ГС среди доноров крови в среднем составляет 1,47-5,1% [11, 21, 79, 81]. В последние годы самые высокие проценты находок анти-ВГС установлены в Дальневосточном, Сибирском и Приволжском округах [81]. Среди лиц, употребляющих наркотики внутривенно, частота обнаружения анти-ВГС колеблется от 73,9 до 92,7% [11, 83]. Группой высокого риска инфицирования являются лица, получившие переливание крови/ ее компонентов или трансплантацию органов до 1994 года [57, 79]. У медицинских работников анти-ВГС выявляются в 2,4-9,5% [11, 21, 81, 83]. По данным разных авторов среди пациентов гемодиализа встречаемость антител колеблется от 13,7 до 43,9% [22, 81, 84]. Сходным образом за рубежом рекомендуется тестирование на наличие ВГС лиц с необъяснимым повышением уровня активности амино-трансфераз и пациентов с ВИЧ-инфекцией (что обусловлено общими путями передачи этих вирусов) [57]. В свою очередь обследование контактных ГС лиц в очагах позволяет выявить нераспознанные случаи заболевания, которые могут рассматриваться как потенциальные источники ГС.

Среди беременных частота обнаружения анти-ВГС составляет 2,5-4,5%. Антитела у детей первого года жизни, рожденных от ВГС-позитивных матерей, обнаруживаются до 100% случаев. К настоящему времени в ряде работ показано, что у таких детей обязательно выявляются материнские анти-ВГС класса IgG, которые свободно проходят через плацентарный барьер и не могут служить основанием для постановки диагноза ГС [21, 22]. В связи с

этим особое значение для факта установления вертикальной передачи инфекции от инфицированных ВГС матерей приобретает метод ОТ-ПЦР для определения РНК вируса.

Кроме того, на основании обнаружения анти-ВГС отбраковывают инфицированный материал в службе крови.

При этом определение антител является лишь косвенным методом для обнаружения ВГС. Одним из моментов, которые затрудняют использование определения антител в практике, являются неодинаковые результаты ИФА с использованием коммерческих тест-систем разных производителей. Пробы, одинаково положительно реагирующие по отдельным неструктурным белкам вируса, интерпретируются по-разному. Сравнительное исследование с использованием коммерческих тест-систем отечественных и зарубежных производителей на панели сывороток крови доноров и лиц из групп риска инфицирования по ГС показывает, что число несовпадающих результатов составляет 2,7-13,4%. В первую очередь регистрация несовпадающих результатов ИФА связана с использованием производителями диагностикумов собственных антигенов оригинальной конструкции в качестве иммуно-сорбента [22, 53, 83]. Лица с неопределенными результатами не учитываются при проведении эпидемиологического надзора за ГС и требуют длительного диспансерного наблюдения два и более месяца [22, 67]. В некоторых случаях удается провести динамическое наблюдение изменения спектра выявляемых анти-ВГС, что позволяет подтвердить или опровергнуть наличие маркеров ГС (в случае исчезновения отдельных неструктурных белков вируса). В то же время, по данным литературы лица с неопределенными результатами составляют до 1/3 серо-позитивных лиц.

Кроме того, имеются данные о неспособности ИФА-тест-систем одинаково эффективно определять анти-ВГС у пациентов с различными генотипами [65].

С другой стороны, необходимо четкое понимание значения выявляемых антител к белкам, кодируемым различными зонами РНК ВГС при различных формах ГС-инфекции. Однозначного мнения по поводу диагностической роли каждого из структурных и неструктурных белков вируса в настоящее время нет. В ряде литературных источниках имеются противоречивые данные о возможности использования для дифференциальной диагностики острых и хронических форм инфекции раздельного выявления антител класса 1дС к структурным и неструктурным белкам вируса, а также определения ИА анти-ВГС 1дС [52, 53, 55, 83]. Вопрос о диагностическом значении последнего остаётся открытым, учитывая неизвестность точных сроков появления высокоавидных антител. Не оправдало себя и предположение об использовании анти-ВГС 1дМ в качестве маркера ОГС, посколь-

ку они могут выявляться и при хроническом течении заболевания.

Что касается диагностической значимости постановки теста «Аг-Ат», то разными авторами представлены противоречивые результаты, что требует проведения дополнительных исследований. Кроме того, получение позитивного результата в данном тесте требует дальнейшей расшифровки с отдельной постановкой на анти-ВГС, что существенно увеличивает материальные и временные затраты. Тест может использоваться для скрининга донорской крови.

Все вышеперечисленные недостатки и трудности в интерпретации полученных результатов определения маркеров ГС методом ИФА свидетельствуют о необходимости внедрения в лабораторную диагностику данной инфекции и других более чувствительных и специфичных тестов, в частности молекулярно-генетических методов, позволяющих использовать прямой лабораторный метод для непосредственного обнаружения генома возбудителя. Определение РНК вируса до настоящего времени остается «золотым стандартом» диагностики ГС, позволяя объективно изучать качественные и количественные параметры эпидемического процесса инфекции.

Встречаемость РНК среди различных контингентов населения значительно различается. Так, наибольший процент выявления отмечен у лиц с наркологической зависимостью - 75,4-77,5% [3, 11, 83]. По данным разных авторов высокая частота обнаружения РНК установлена среди «условного здорового населения» (33-48%) [11, 83]. Именно эта группа свидетельствует о значительной широте распространения скрытых источников ГС на популяци-онном уровне. Кроме того, выявление РНК ВГС в детектируемых количествах в плазме крови больных через 1-3 недели после инфицирования (до циркуляции антигена и задолго до сероконверсии) придает этому маркеру большое значение для обнаружения ГС-инфекции в максимально ранние сроки после заражения. Проведение ПЦР-обследования среди анти-ВГС-негативных лиц группы повышенного риска инфицирования позволяет своевременно выявлять потенциальные источники инфекции, по данным литературы частота обнаружения РНК у них колеблется от 0,5 до 1,2% [77, 82]. В связи с чем целесообразно и необходимо тестировать на наличие РНК ВГС плазму крови пациентов с клиническими признаками гепатита с целью ранней постановки диагноза ГС. У больных ХГС наличие РНК вируса свидетельствует о фазе реактивации латентно протекающего процесса.

Начиная с 2004 года, в зарубежной литературе появились публикации о существовании новой формы скрытой ГС-инфекции, которая была установлена у больных гепатитом неясной этиологии с повышенным уровнем

сывороточных печеночных трансаминаз, у пациентов с индуцированным интерферонотерапией выздоровлением [25, 85, 86]. Характерной особенностью этой формы инфекции является недетектируемый уровень РНК в сыворотке крови пациентов общепринятыми ПЦР-тест-системами при обнаружении репликативных цепей генома вируса в ткани печени [25, 86]. В связи с тем, что проведение биопсии печени является инвазивным и не всегда доступным методом индикации вируса, перспективным является выявление РНК ВГС в мононуклеарах перефери-ческой крови. В последние годы появились сведения о том, что внепеченочный резервуар инфекции может служить источником реактивации болезни, например, при снижении виремии в сыворотке крови на фоне проведенного лечения. Вопрос о роли лимфоцитов в развитии ГС-инфекции остается нерешенным. Основным доказательством репликации вируса в мононуклеарах периферической крови служит обнаружение минус-цепи РНК и накопление вирусных белков в цитоплазме [3, 71, 86]. Результаты выявления РНК ВГС в мононуклеарах периферической крови больных ГС, полученные разными исследователями, варьируют в широких пределах. Так, по данным одних авторов РНК ВГС в мононуклеарах периферической крови встречается у 24% больных, по данным других - у всех обследованных [3, 71]. Помимо этого, пролиферация инфицированных лимфоцитов может инициировать репликацию ВГС, находящегося в этих клетках в латентной стадии [30, 34]. Таким образом, отрицательный результат на РНК вируса в сыворотке/плазме крови не означает отсутствия этого маркера в клетках. Поэтому большую диагностическую ценность приобретает определение РНК в мононуклеарах периферической крови методом ПЦР.

Определение РНК является необходимым элементом лабораторной диагностики у новорожденных для подтверждения факта заражения ГС вследствие вертикальной передачи вируса. Так, наличие генома ВГС у детей через два месяца после рождения свидетельствует о перинатальном заражении [21, 22].

Большое значение в клинической практике и для целей эпидемиологического надзора имеет определение генотипа ВГС. Тем не менее, о распространенности различных генотипов/субтипов ВГС в отдельных регионах России и мира до сих пор имеется ограниченное количество сообщений. Совокупные данные о географическом распространении вариантов ВГС, представленные в международной базе данных нуклеотидных последовательностей генома вируса Национальной лаборатории Лос-Аламоса (Los Alamos National Laboratory), отражают крайне неравномерное распределение генотипов вируса по территории земного шара. Известно, что генотипы 1, 2 и 3 распро-

странены повсеместно, при этом тот или иной их субтип доминирует в разных географических зонах [11, 16, 77, 88]. На территории РФ (по данным ФБУН ЦНИИЭ) циркулируют 1, 2, 3 и 4 генотипы ВГС. Четвертый генотип выявляется крайне редко (единичные случаи, считаются завозными из стран Северной Африки) [16]. В большинстве регионов России эпидемиологическая ситуация полностью определяется субтипами 1Ь и 3а, на долю которых приходится более 85% от всех регистрируемых генотипов. При этом, в Санкт-Петербурге, Вологодской, Новосибирской областях отмечено явное доминирование 1Ь (более 53,263,6%) [5, 11, 21, 38]. В Центральной европейской и Южной частях России (Московская, Нижегородская, Владимирская, Свердловской и Ростовской области) 1Ь и 3а превалируют в равной доле (42,9-54,3% и 40,1-49,5% соответственно) [2, 77, 82, 89, 90]. Значительно реже выявляются субтипы 2 генотипа, 1а и различные варианты микст-генотипов: 8,2%, 3,6% и 1,7% соответственно. Так, генотип 1а довольно широко распространен в Центральном, Северо-Западном регионах РФ, значительно реже в Восточной Сибири, Центрально-Черноземном районе, на Урале. В то время как циркуляция 2к и 2с установлена только в Санкт-Петербурге и Москве. 4-й генотип составляет менее 0,05% всех генотипированных проб. Установлены различия в структуре генотипов ВГС среди этнических групп и некоренного населения на отдельных территориях [91]. Наряду с этим отмечена циркуляция изо-лятов ВГС, которые не удается типировать [13, 18, 19]. В последние годы появились данные о формировании новых генетических вариантов вируса за счет рекомбинации между геномами разных субтипов, влияние которых на течение инфекционного процесса неизвестно. Так и в случае создания кандидатной вакцины, возможность ее применения и эффективность также будут определяться степенью изученности популяционной структуры ВГС, а именно, знанием превалирующих генотипов [11]. Трудности создания эффективной вакцины связаны и с тем, что не до конца исследованы механизмы иммунной защиты и пока отсутствует полностью пригодная для исследований экспериментальная модель инфекции на животных [49].

Определение генотипа вируса имеет значение для доказательства перинатальной передачи вируса, а также для расшифровки групповых случаев и вспышек ГС с целью выявления источников инфицирования и путей передачи инфекции [22, 79]. Так, имеются данные о взаимосвязи отдельных генотипов ВГС с определенными путями его передачи. Считается, что субтип 3а коррелирует с внутривенным потреблением наркотических средств; 1Ь часто связывают с заражением через медицинские манипуляции, гемотрансфузии и гемодиализ; 2 генотип значительно

распространен среди лиц, инфицированных половым путем; 1а чаще выявляется у лиц с неустановленным путем передачи [11, 13, 92]. С учетом приведенных данных изучение региональных особенностей генотипического разнообразия ВГС в РФ является особенно актуальным для понимания тенденций распространения данной инфекции на каждой конкретной территории.

Помимо знаний о частоте выявления отдельных генотипов в различных регионах РФ, не менее важным являются динамические исследования генотипического разнообразия ВГС в пределах одной территории. В настоящее время большинство авторов ограничиваются изучением структуры геновариантов вируса, циркулирующего на конкретной территории на момент проведения работы, в то время как сравнительные данные по генотипическому разнообразию ВГС за достаточно длинный период исследования единичны [11, 83, 92]. При этом динамические исследования особенностей генотипической структуры ВГС, с учетом полного спектра маркеров инфекции, являются необходимыми не только для отслеживания изменений в структуре путей передачи, но и выявления закономерностей распределения вируса в популяции с целью прогнозирования эволюционных изменений эпидемиологической ситуации в целом. Так, в результате динамических наблюдений во многих регионах РФ отмечены изменения, произошедшие в структуре генотипов ВГС в последнее десятилетие, в сторону уменьшения удельного веса генотипа 1Ь и роста доли 3а [11, 83, 90]. Это подтверждает предположение о том, что в настоящее время основными источниками инфекции при ВГС стали инъекционные наркоманы, большинство из которых относятся к возрастной группе до 30 лет и инфицированы субтипом 3а [11, 13, 82].

Важное значение имеет оптимизация тактики лечения больных ГС, что в условиях отсутствия специфической профилактики направлено на снижение количества существующих источников инфекции в обществе. Основой для определения тактики и контроля результатов лечения, в частности, отслеживания резистентных штаммов вирусов, согласно международным «консенсус-конференциям» в 2002 (США), 2004 (Канада) и 2010 гг. (Австрия) служит качественное выявление РНК с определением вирусной нагрузки и генотипа ВГС [16, 60, 80, 89, 90, 93, 94]. Так, отрицательный результат выявления РНК в сыворотке/ плазме крови на 4-й и 12-й неделе лечения является критерием раннего вирусологического ответа на терапию [16]. По данным Национального института здоровья США пациенты, инфицированные 1-ым генотипом ВГС, значительно хуже отвечают на противовирусное лечение препаратами интерферонов, чем со 2-ым и 3-им генотипами [48, 80]. Поэтому, с одной стороны, ведутся исследования по увеличению эффективности проводимой терапии

путем включения в схему лечения ГС прямых противовирусных препаратов (специфические ингибиторы протеаз и полимеразы, NS5A ингибиторы) [106, 109, 111]. В настоящее время закончены исследования III фазы по изучению эффективности и безопасности тройной терапии с включением ингибиторов протеазы телапревира и боцепреви-ра, позволяющих вдвое сократить ее длительность (до 3-6 мес.) и увеличить частоту формирования устойчивого вирусологического ответа. Однако применение ингибиторов протеаз ведет к усилению побочных действий лекарств и, как следствие, увеличению доли отказов от проводимой терапии ранее запланированных сроков [57, 79, 98, 100, 101, 102, 103]. С другой стороны, исследования направлены на поиск предикторов формирования УВО, что позволит значительно сократить длительность терапии и снизить экономические затраты на лечение, делая его доступным большему количеству нуждающихся пациентов. Так, например, выявление генотипа СС гена ИЛ-28В значительно увеличивает вероятность достижения УВО у пациентов с 1-ым генотипом вируса при условии низкой вирусной нагрузки и отсутствия сопутствующих заболеваний/состояний, определяющих снижение эффективности противовирусной терапии (ожирение, инсулинорези-стентность, стеатоз, фиброз печени 3-ей или 4-ой стадии) [78, 79]. Это служит основанием для включения данного генетического теста в план обследования больных перед подбором оптимальной схемы лечения.

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что применение молекулярно-генетических методов исследования является более информативным и, в ряде случаев, обязательным по сравнению с ИФА, позволяя:

• установить факт инфицирования ВГС на ранних стадиях развития заболевания, при латентной инфекции (среди анти-ВГС-негативных лиц) и подтвердить перинатальную передачу вируса;

• расшифровать эпидемическую ситуацию: установить источник и возможные пути передачи инфекции для предотвращения дальнейшего распространения ГС;

• установить распространенность отдельных генотипов ВГС, их доминирующих субтипов, микст-вариантов и рекомбинантов генотипов вируса на каждой конкретной территории;

• подобрать оптимальные схемы лечения и мониторинга эффективности проводимой терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, к настоящему времени накоплены обширные знания о структурной и молекулярной организации ВГС, его генетическом разнообразии; разработаны иммунологические и молекулярно-генетические методы обнаружения специфических маркеров инфекции в клиническом материале; установлены показания к применению

противовирусной терапии и созданы препараты нового поколения (ингибиторы протеазы), позволяющие сократить длительность и увеличить эффективность лечения.

Несмотря на успехи, достигнутые в изучении проблемы ГС, значительная вариабельность вирусного генома и существующие алгоритмы лабораторной диагностики в ряде случаев препятствуют своевременной постановке диагноза, что ведет к распространению скрытых источников инфекции в обществе. Преодолению трудностей, возникающих на различных этапах обнаружения специфических маркеров ГС-инфекции (в частности ее скрытопроте-кающего компонента), в настоящее время способствуют: использование в рутинной лабораторной практике новых методических разработок, таких как «СМАРТтюб™ HIV&HCV»; углубленное исследование клинического материала от лиц с «сомнительными» результатами по анти-ВГС с применением тестирования на «АГ/АТ» и РНК ВГС в динамике; обязательное включение молекулярно-генетических исследований в алгоритм обследования серопозитивных и, особенно, анти-ВГС-негативных лиц из групп повышенного риска; определение генома вируса в мононуклеарах периферической крови для обнаружения скрытого варианта ГС-инфекции у пациентов с повышенным уровнем сывороточных печеночных трансаминаз (при отсутствии клинических признаков гепатита и с отрицательными результатами на анти-ВГС и РНК в плазме крови). Кроме того, использование молекулярно-генети-ческих методов типирования изолятов вируса уже сегодня позволяет выявлять закономерности распределения вируса в популяции для прогнозирования эволюционных изменений эпидемиологической ситуации в целом. В первую очередь это направлено на планирование региональной стратегии для предотвращения дальнейшего распространения ГС-инфекции.

ЛИТЕРАТУРА

1. Быстрова Т. Н., Ефимов Е. И., Арзяева А. Н. Парентеральные вирусные гепатиты: этиология, эпидемиология, диагностика, профилактика / Учебное пособие для студентов медицинских ВУЗов. Н.Новгород: НГМА, 2010. 180 с.

Bystrova T. N., Efimov E. I., Arzjaeva A N. Parenteral'nye virusnye gepatity: jetiologija, jepidemiologija, diagnostika, profilaktika / Uchebnoe posobie dlja studentovmedicinskih VUZov. N.Novgorod: NGMA, 2010. 180 s.

2. Заботина Е.Е. Эпидемиологические и молекулярно-генетические аспекты гепатитов B и C: автореф. дисс. ... канд. мед. наук. М., 2011. 25 с.

Zabotina E.E. Jepidemiologicheskie i molekuljarno-geneticheskie aspekty gepatitov B i S: avtoref. diss.... kand. med. nauk. M., 2011. 25 s.

3. Масалова О. В. Вирусный гепатит С: новые подходы к изучению патогенеза и разработка средств диагностики и профилактики: автореф. дисс. ... док. биол. наук. М., 2011. 31 с.

Masalova O. V. Virusnyj gepatit S: novye podhody k izucheniju patogeneza i razrabotkasredstvdiagnostikiiprofilaktiki:avtoref. diss.... dok. biol. nauk. M., 2011.31 s.

4. Савиных М. В. Клиническая оценка процессов перекисного окисления липидов и иммунологических реакций у больных микст-гепатитом В+C: автореф. дисс. ... канд. мед. наук. М., 2006., 24 с.

Savinyh M. V. Klinicheskaja ocenka processov perekisnogo okislenija lipidov i immunologicheskih reakcij u bol'nyh mikst-gepatitom В+S: avtoref. diss. ... kand. med. nauk. M., 2006., 24 s.

5. Чахарьян В. В. Особенности эпидемиологии и оценка путей передачи возбудителей вирусных гепатитов В и С в современный период: автореф. дисс.... канд. мед. наук. М., 2009. 22 с.

Chaharjan V. V. Osobennosti jepidemiologii i ocenka putej peredachi vozbuditelej virusnyh gepatitov В i S v sovremennyj period: avtoref.diss.... kand. med. nauk. M., 2009. 22 s.

6. Albeldawi M., Ruiz-Rodriguez E. et al. Hepatitis C virus: Prevention, screening, and interpretation of assays. Cleve Clin J Med. 2010. Vol. 77(9). P. 616-626.

7. Hepatitis C. Fact sheet. 2012. Vol. 164. (http://www.who.int/mediacentre/ factsheets/fs164/en)

8. Bowen D G., Walker C. M. Adaptive immune responses in acute and chronic hepatitis C virus infection. Nature. 2005. Vol. 436. P. 946-952.

9. Heller T, Rehermann B. Acute hepatitis C: a multifaceted disease. Semin Liver Dis. 2005. Vol. 25. P. 7-17.

10. Walker N. J. A Technique whose time has come. Sciense. 2002. Vol. 296. P. 19.

11. Шустов А. В. Генотипическое разнообразие изолятов и молекулярная вариабельность вируса гепатита С у Населения Новосибирской области: автореф. дисс....канд. биол. наук. Кольцово, 2003. 22 с.

Shustov A. V. Genotipicheskoe raznoobrazie izoljatov i molekuljarnaja variabel'nost' virusa gepatita S u Naselenija Novosibirskoj oblasti: avtoref. diss..kand. biol. nauk. Kol'covo, 2003. 22 s.

12. Colina R., Casane D, Vasquez S. et al. Evidence of intratypic recombination in natural populations of hepatitisC virus. Gen. Virol. 2004. Vol. 85(1). P. 31-37.

13. Kalinina O., Norder H., Mukomolov S. et al. A natural intergenotypes recombinant of hepatitis C virus identified in St. Peterburg. Virol. 2002. Vol. 76(8). P. 4934-4043.

14. Kurbanov F., Tanaka Y., Chub E. et al. Molecular epidemiology and interferon susceptibility of the natural recombinant of hepatitis C virus strain RF1_2k/1b. Infect. Dis. 2008. Vol. 198. P. 1448-1456.

15. Гепатит С (Диагностика, эпидемиология, лечение, профилактика) (Российский консенсус), Москва, 26-27 сентября 2000 г. Вирусные гепатиты: Достижения и перспективы. 2000. № 3(10). С. 3-92.

Gepatit S (Diagnostika, jepidemiologija, lechenie, profilaktika) (Rossijskij konsensus), Moskva, 26-27 sentjabrja 2000 g. Virusnye gepatity: Dostizhenija i perspektivy. 2000. № 3(10). S. 3-92.

16. Чуланов В. П., Шипулин Г. А. Роль молекулярных методов диагностики в оптимизации алгоритмов лечения вирусного гепатита С. Лабораторная медицина. 2006. № 8. С. 1-10.

Chulanov V. P., Shipulin G. A. Rol' molekuljarnyh metodov diagnostiki v optimizacii algoritmov lechenija virusnogo gepatita S. Laboratornaja medicina. 2006. № 8. S. 1-10.

17. Краснова Л. И. Характеристика фиброза печени в зависимости от продолжительности хронического гепатита С (ХГС) и величины вирусной нагрузки // Сборник трудов II Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. М. 2010. С. 158-159.

Krasnova L. I. Harakteristika fibroza pecheni vzavisimosti ot prodolzhitel'nosti hronicheskogo gepatita S (HGS) i velichiny virusnoj nagruzki//Sbornik trudov II Ezhegodnogo Vserossijskogo Kongressa po infekcionnym boleznjam. M. 2010. S. 158-159.

18. Мукомолов С. Л., Калинина О. В. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов. Мир вирусных гепатитов. 2003. № 12. С. 5-13.

Mukomolov S. L., Kalinina O. V. Molekuljarnaja jepidemiologija virusnyh gepatitov. Mir virusnyh gepatitov. 2003. № 12. S. 5-13.

19. Орлов С. Т., Неверов А. Д., Михайловская Г. В. и др. Разработка и апробация тест-системы «АмплиСенс HCV-генотип FRT» на клиническом материале и контрольных панелях QCMD // Сборник трудов 6-ой всероссийской НПК с международ. участием «Молекулярная диагностика-2007». М. 2007. Т.1. С. 320-323.

Orlov S. T., Neverov A. D., Mihajlovskaja G. V. i dr. Razrabotka i aprobacija test-sistemy «AmpliSens HCV-genotip FRT» na klinicheskom materiale i kontrol'nyh paneljah QCMD // Sbornik trudov 6-oj vserossijskoj NPK s mezhdunarod. uchastiem «Molekuljarnaja diagnostika-2007». M. 2007. T.1. S. 320-323.

20. Шляхтенко Л.И., Мукомолов С.Л., Сулягина Л Г. и др. Пути совершенствования эпидемиологической диагностики вирусных гепатитов В и С. Мир вирусных гепатитов. 2006. № 1. С. 2-10.

Shljahtenko L. I., MukomolovS. L., Suljagina L. G. idr. Putisovershenstvovanija jepidemiologicheskoj diagnostiki virusnyh gepatitov В i S. Mir virusnyh gepatitov. 2006. № 1. S. 2-10.

21. Ершова О.В. Современные проявления эпидемического процесса гепатита С, активность естественных путей передачи и совершенствование профилактики этой инфекции: автореф. дисс....док. мед. наук. М., 2006. 22 с.

Ershova O.V. Sovremennye projavlenija jepidemicheskogo processa gepatita S, aktivnost' estestvennyh putej peredachi i sovershenstvovanie profilaktiki jetojinfekcii: avtoref.diss.. ..dok. med. nauk. M, 2006. 22 s.

22. Сенягина Н.Е. Клинические особенности, критерии диагностики и профилактика вирусного гепатита С у детей при вертикальной передаче инфекции: автореф. дисс. ... канд. мед. наук. Н.Новгород, 2011. 26 с.

Senjagina N.E. Klinicheskie osobennosti, kriterii diagnostiki i profilaktika virusnogo gepatita S u detejpri vertikal'nojperedache infekcii: avtoref. diss.... kand. med. nauk. N.Novgorod, 2011. 26s.

23. Филатов Ф.П. Инфекционная безопасность переливания крови // Сборник трудов 6-ой всероссийской НПК с международ. участием «Молекулярная диагностика-2007». М. 2007. Т. 3. С.239-245.

Filatov F.P. Infekcionnaja bezopasnost' perelivanija krovi // Sbornik trudov 6-oj vserossijskoj NPK s mezhdunarod. uchastiem «Molekuljarnaja diagnostika-2007». M. 2007. T. 3. S.239-245.

24. Волова Л.Ю., Грезина Л.А. Изучение связи между серологическим профилем при вирусном гепатите В, С и проявлением репликативной активности возбудителя // Сборник трудов V Всерос. НПК «Генодиагностика инфекционных болезней». М. 2004. Т.1. С. 240-243.

Volova L.Ju., Grezina L.A. Izuchenie svjazi mezhdu serologicheskim profilem pri virusnom gepatite V, S i projavleniem replikativnoj aktivnosti vozbuditelja // Sbornik trudov V Vseros. NPK «Genodiagnostika infekcionnyh boleznej». M. 2004. T.1. S. 240-243.

25. Евплова И.А. Современное состояние проблемы вирусного гепатита С: успехи в изучении и нерешенные вопросы // Вестник Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского. Серия Биология. 2012. Вып. 2(3). С.46-50.

Evplova I.A. Sovremennoe sostojanie problemy virusnogo gepatita S: uspehi v izuchenii i nereshennye voprosy // Vestnik Nizhegorodskogo gosudarstvennogo universiteta im. N. I. Lobachevskogo. Serija Biologija. 2012. Vyp. 2(3). S.46-50.

26. Иванова Т.Г., Яковчук Е.М., Высоцкий В.С. и др. Проблемы вирусных гепатитов в современный период // Сборник трудов Всерос. НПК «Современные проблемы эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций». СПб. 2009. С. 215.

Ivanova T.G., Jakovchuk E.M., Vysockij V.S. i dr. Problemy virusnyh gepatitov v sovremennyj period // Sbornik trudov Vseros. NPK «Sovremennye problemy jepidemiologii. Perspektivnye sredstva i metody laboratornoj diagnostiki i profilaktiki aktual'nyh infekcij». SPb. 2009. S. 215.

27. Москалев А.В., Астапенко П.В. Латентные формы вирусных гепатитов В и С. Оптимизация диагностики. Вектор-Бест. 2009. С. 7-11.

Moskalev A.V., Astapenko P.V. Latentnye formy virusnyh gepatitov V i S. Optimizacija diagnostiki. Vektor-Best. 2009. S. 7-11.

28. Рудой А.С., Москалев А.В., Астапенко П.В. Особенности иммунопатоге-неза и диагностики латентных форм вирусных гепатитов В и С. Медицинская иммунология. 2009. № 4-5. С. 394.

RudojA.., MoskalevA.V., Astapenko P.V. Osobennosti immunopatogeneza i diagnostiki latentnyh form virusnyh gepatitov В i S. Medicinskaja immunologija. 2009. № 4-5. S. 394.

29. Шуратов И.Х., Джумагалиева А.Б., Утегенова Э.С. и др. Изучение эпидемиологических параметров гепатита С в условиях г. Алматы // Сборник трудов НПК с международ. участием «Болезни печени в клинической практике». Харьков. 2009. С. 194-195.

Shuratov I.H., Dzhumagalieva A.B., Utegenova Je.S. i dr. Izuchenie jepidemiologicheskih parametrov gepatita S v uslovijah g.Almaty // Sbornik trudov NPK s mezhdunarod. uchastiem «Bolezni pecheni v klinicheskoj praktike». Har'kov. 2009. S. 194-195.

30. Мамедов М.К., Михайлов М.И. К истории открытия и изучения вируса гепатита С. Мир вирусных гепатитов. 2010. № 2. С. 5-8.

Mamedov M. K., Mihajlov M. I. K istorii otkrytija i izuchenija virusa gepatita S. Mir virusnyh gepatitov. 2010. № 2. S. 5-8.

31. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2003. 384 с.

Shahgil'djan I.V., Mihajlov M.I., Onishhenko G.G. Parenteral'nye virusnye gepatity (jepidemiologija, diagnostika, profilaktika). M.: GOU VUNMC MZ RF, 2003.384 s.

32. Новикова Н.А., Новиков В.В., Добротина Н.А. и др. Вирусология. Н. Новгород: ННГУ, 2002. С. 182-204.

Novikova N.A., Novikov V.V., Dobrotina N.A i dr. Virusologija. N.Novgorod: NNGU, 2002. S. 182-204.

33. Dubuisson J. Hepaitis C virus proteins. Gastroenterol. 2007. Vol. 5. P. 2406-2415.

34. Suzuki T., Aizaki H., Murakami K. et al. Molecular biology of hepatitis C virus. Gastroenterol. 2007. Vol. 42. P. 411-423.

35. Moradpour D., Penin F., Rice C. Replication of hepatitis C virus. Microbiol. 2007. Vol. 5. P. 453-463.

36. Kunkel M., Watowich SJ. Biophysical characterization of hepatitis C virus core protein: implications for interactions within the virus and host. FEBS Lett. 2004. Vol. 557(1-3). P. 174-180.

37. Wang Q., Feng Z., Nie Q. et al. DC-SING:bilding receptors for hepatitis C virus. Clin. Med. 2004. Vol. 117(9). P. 1395-1400.

38. Kalinina O., Norder H., Vetrov T. et al. Shift in predominating subtype of HCV from 1b to 3a in St. Petersburg mediated by increase in injecting drug use. Med. Virol. 2001. Vol. 65(3). P. 517-524.

39. Irshad M., Dhar I. Hepatitis C virus core protein: an update on its molecular biology, cellular functions and clinical implications. Med Princ. Pract. 2006. Vol. 15(6). P. 405-416.

40. Brun P., Boninsegna S., Palu G. Innate immune system responses differ during recent and chronic hepatitis C virus infection. Hepatology. 2010. Vol. 52(1). P. 671.

41. Thelu M., Drouet E., Hilleret M. et al. Lack of clinical significance of variability in the internal ribosome entry site of hepatitis C virus. Med. Virol. 2004. Vol. 72(3). P. 396-405.

42. Siavoshian S., Abraham J. D., Thumann C., Kieny M. P, et al. Hepatitis C virus core, NS3, NS5A, NS5B proteins induce apoptosis in mature dendritic cells. Med Virol. 2005. Vol. 75. P. 402-411.

43. Tang H., Grise H. Cellular and molecular biology of HCV infection and hepatitis. Clin Sci (Lond). 2009. Vol. 117(2). Р. 49-65.

44. Herrmann E., Sarrazin C. Hepatitis C virus- virus kinetics and resistance mechanisms. Gastroenterol. 2004. Vol. 42(5). P. 387-396.

45. Okura I., Horiike N., Michitaka K. et al. Effect of mutation in the hepatitis C virus nonstructural 5B region on HCV replication. Gastroenterol. 2004. Vol. 39(5). P. 449-454.

46. Balan V., Pivert A., Dumbrava V. Resistance mutation in hepatitis C virus NS5B polymerase gene in patients with chronic hepatitis C virus infection genotype 1b treated with pegylated IFN and ribavirin. Hepatology. 2010. Vol. 52(1). P. 296.

47. Lavillette D., Tarr A., Voisset C. et al. Characterization of host-range and cell entry properties of the major genotypes and subtypes of hepatitis C virus. Hepatology. 2005. Vol. 41(2). P. 265-274.

48. Pockros P.J. New Direct_acting Antivirals in the Development for Hepatitis C Virus Infection. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 2010. Vol. 3(3). P. 191-202.

49. Михайлов М.И. Лабораторная диагностика гепатита С. Вирусные гепатиты: Достижения и перспективы. 2001. № 2 (12). С. 8-18.

Mihajlov M.I. Laboratornaja diagnostika gepatita S. Virusnye gepatity: Dostizhenija i perspektivy. 2001. № 2 (12). S. 8-18.

50. Legrand-Abravanel F., Claudinon J., Nicot F. et al. New natural intergenotypic (2/5) recombinant of hepatitis C virus. Virol. 2007. Vol. 81(8). P. 4357-4362.

51. Саттарова М.И. Хронический вирусный гепатит С (некоторые аспекты пато-, морфогенеза, диагностики и клинического течения): автореф. дисс. ... канд. мед. наук. Душанбе, 2007. 23 с.

Sattarova M.I. Hronicheskij virusnyj gepatit S (nekotorye aspekty pato-, morfogeneza, diagnostiki i klinicheskogo techenija): avtoref. diss. ... kand. med. nauk. Dushanbe, 2007. 23 s.

52. Ястребова О.Н. Гепатит С. / Информационно-методическое пособие. Новосибирск: ЗАО «Вектор-Бест», 2006. 44 с.

Jastrebova O.N. Gepatit S/ Informacionno-metodicheskoe posobie. Novosibirsk: ZAO «Vektor-Best», 2006.44 s.

53. Рогозина Н.В., Мукомолова А.Л., Горячева Л.Г и др. Клинико-лабораторная характеристика острого вирусного гепатита С у детей. Педиатрия. 2004. № 6. С. 25-29.

Rogozina N.V., Mukomolova A.L., Gorjacheva L.Gidr. Kliniko-laboratornaja harakteristika ostrogo virusnogo gepatita S u detej. Pediatrija. 2004. № 6. S. 25-29.

54. Рыжиков А.Е. Разработка метода иммуноферментного анализа для диагностики вирусного гепатита С, основанного на выявлении вирусных антигенов core и Е2 в сыворотке крови. Мир вирусных гепатитов. 2009. № 3. С. 21-22.

Ryzhikov A.E. Razrabotka metoda immunofermentnogo analiza dlja diagnostiki virusnogo gepatita S, osnovannogo na vyjavlenii virusnyh antigenov core i E2 v syvorotke krovi. Mir virusnyh gepatitov. 2009. № 3. S. 21-22.

55. Демчило А.П., Воропаев Е.В., Мицура В.М. Диагностическое значение спектра антител к различным белкам вируса гепатита С. Сборник трудов НПК с международ. участием «Болезни печени в клинической практике». Харьков. 2007. С. 66-67.

Demchilo A.P., Voropaev E.V., Micura V.M. Diagnosticheskoe znachenie spektra antitel k razlichnym belkam virusa gepatita S. Sbornik trudov NPK s mezhdunarod. uchastiem «Bolezni pecheni v klinicheskoj praktike». Har'kov. 2007. S. 66-67.

56. Чеканова Т.А., Маркелов М.Л., Сперанская А.С. и др. Иммуночип для серологической диагностики вирусного гепатита С. Сборник трудов 6-ой всероссийской НПК с международ. участием «Молекулярная диагностика-2007». М. 2007. Т. 1. С. 68-72.

Chekanova T.A., Markelov M.L., Speranskaja A.S. i dr. Immunochip dlja serologicheskoj diagnostiki virusnogo gepatita S. Sbornik trudov 6-oj vserossijskoj NPK s mezhdunarod. uchastiem «Molekuljarnaja diagnostika-2007». M. 2007. T. 1. S. 68-72.

57. EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatitis C virus infection. Hepatology. 2011. Vol. 55. Р. 245-264.

58. Казаченко М.Г., Карпов И.А. Особенности течения, диагностики и терапии HCV-инфекции у больных, находящихся на хроническом гемодиализе. Мир вирусных гепатитов. 2011. № 1. С. 4-11.

Kazachenko M.G., Karpov I.A. Osobennosti techenija, diagnostiki i terapii HCV-infekcii u bol'nyh, nahodjashhihsja na hronicheskom gemodialize. Mir virusnyh gepatitov. 2011. № 1. S. 4-11.

59. Туманова О.Ю., Ястребова О.Н. Набор реагентов «ВГС АГ/АТ-ИФА-БЕСТ» для совместного определения соге антигена и антител к вирусу гепатита С. Новости «Вектор-Бест». 2010. № 4(58). С. 45.

Tumanova O.Ju., Jastrebova O.N. Nabor reagentov «VGS AG/AT-IFA-BEST» dlja sovmestnogo opredelenija sore antigena i antitel k virusu gepatita S. Novosti «Vektor-Best». 2010. № 4(58). S. 45.

60. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: Management of hepatitis C: 2002 June 10-12//Hepatology. 2002. Vol. 1. Р.3-20.

61. StraderD B., Wright T., Thomas D L. et al. Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C. Hepatology. 2004. Vol. 39. Р. 1147-1171.

62. Гараев М.М., Богдан С.А. и др. «СМАРТ-тюб™ HIV&HCV» - новая вспомогательная технология для выявления антител к ВИЧ и ВГС в стадии «серологического окна» / Методические рекомендации. М. 2008. 12 с.

Garaev M.M., Bogdan S.A. i dr. «SMART-tjub™ HIV&HCV» - novaja vspomogatel'naja tehnologija dlja vyjavlenija antitel k VICh i VGS v stadii «serologicheskogo okna» / Metodicheskie rekomendacii. M. 2008. 12 s.

63. Туполева Т.А., Богословская Е.В. и др. Использование ПЦР для детекции ВГВ и ВГС на станции переливания крови // Сборник трудов 6-ой всероссийской НПК с международ. участием «Молекулярная диагностика-2007». М. 2007. Т. 1. С. 230-238.

Tupoleva T.A., Bogoslovskaja E.V. i dr. Ispol'zovanie PCR dlja detekcii VGB i VGS na stancii perelivanija krovi // Sbornik trudov 6-oj vserossijskoj NPK s

mezhdunarod. uchastiem «Molekuljarnaja diagnostika-2007». M. 2007. T. 1. S. 230-238.

64. Астраханцева И.В., Кампо Д., Новиков В В. и др. Влияние сероконвер-сии на изменения в участке HVR1 белка E2 вируса гепатита С. Вестник нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского. Серия Биология. 2012. Вып. 2(3). С. 14-19.

Astrahanceva I.V., Kampo D., Novikov V.V. i dr. Vlijanie serokonversii na izmenenija vuchastke HVR1 belka E2 virusa gepatita S. Vestniknizhegorodskogo gosudarstvennogo universiteta im. N. I. Lobachevskogo. Serija Biologija. 2012. Vyp. 2(3). S. 14-19.

65. Кудрявцева Е.Н., Заботина Е.Е., Корабельникова М.И. и др. Структура генотипов вируса гепатита С у пациентов с ХГС и сравнительная оценка диагностических возможностей иммуноферментных тест-систем // Сборник трудов 7-ой всероссийской НПК с международ. участием «Молекулярная диагностика-2010». М. 2007. Т.1. С. 239-242.

Kudrjavceva E.N., Zabotina E.E., Korabel'nikova M.I. i dr. Struktura genotipov virusa gepatita S u pacientov s HGS i sravnitel'naja ocenka diagnosticheskih vozmozhnostej immunofermentnyh test-sistem // Sbornik trudov 7-oj vserossijskoj NPK s mezhdunarod. uchastiem «Molekuljarnaja diagnostika-2010». M. 2007. T.1. S. 239-242.

66. О применении в практике здравоохранения иммуноферментных тест-систем для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В(HBsAg) и антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в сыворотке крови человека / Приказ Минздравсоцразвития России от 21.10.2002 №322.

O primenenii v praktike zdravoohranenija immunofermentnyh test-sistem dlja vyjavlenija poverhnostnogo antigena virusa gepatita B (HBsAg) i antitel k virusu gepatita S (anti-VGS) v syvorotke krovi cheloveka / Prikaz Minzdravsocrazvitija Rossii ot 21.10.2002 №322.

67. Евплова И.А., Быстрова Т.Н., Ефимов Е.И., Сенягина Н.Е. Сравнительная сероэпидемиологическая характеристика больных хроническим гепатитом С и лиц с «неопределённым» результатом на антитела к вирусу гепатита С. Вестник Рос. Военно-медиц. Акад. 2008. № 2(22). С. 434-435.

Evplova I.A., Bystrova T.N., Efimov E.I., Senjagina N.E. Sravnitel'naja serojepidemiologicheskaja harakteristika bol'nyh hronicheskim gepatitom S i lic s «neopredeljonnym» rezul'tatom na antitela k virusu gepatita S. Vestnik Ros. Voenno-medic. Akad. 2008. № 2(22). S. 434-435.

68. Klimashevskaya S., Obriadina A., Ulanova T. et al. Distinguishing acute from chronic and resolved hepatitis C virus (HCV) infections by measurement of anti--HCV immunoglobulin G avidity index. Clinical Microbiology. 2007. Vol. 45. № 10. P. 3400-3403.

69. Bochkova G., Fomina S., Shabalina Т. et al. The value of anti-HCV IgG avidity index and anti-HCV IgG profile for distinguishing of acute and chronic hepatitis C virus infection / 19-th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses. Venice, Italy. 2012. P. 264.

70. Hmaied F., Ben Mamou M., Arrouji Z. et al. Use of combined detection of hepatitis C virus core antigen and antibodies to reduce the serological windowphase. Pathol. Biol. 2006. Vol. 55(2). P. 121-126.

71. Лакина Е.И., Масалова О.В., Абдулмеджидова А.А., Кущ А.А. Вирусная нагрузка и тяжесть заболевания гепатитом С: есть ли связь? Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. 2001. № 3(13). С. 16-32.

Lakina E.I., Masalova O.V., Abdulmedzhidova A.A., Kushh A.A. Virusnaja nagruzka i tjazhest' zabolevanija gepatitom S: est' li svjaz?/Virusnye gepatity: dostizhenija i perspektivy. 2001. № 3(13). S. 16-32.

72. Лаптинов И. А. ПЦР-диагностика без электрофореза. Лабораторная диагностика России / Мир медицины: Ежегодный справ. М. 2004-2005. С. 162-163.

Laptinov I. A. PCR-diagnostika bezjelektroforeza. Laboratornaja diagnostika Rossii/Mir mediciny: Ezhegodnyj sprav. M. 2004-2005. S. 162-163.

73. Watkins-Riedel T., Ferenci P., Steindl-Munda P. et al. Early prediction of hepatitis C virus (HCV)infection relapse in nonresponders to primary interferon therapy by means of HCV RNA whole-blood analysis. Clin. Infect. Dis. 2004. Vol. 39(12). P. 1754-1760.

74. ПЦР в режиме реального времени / под. ред. Д.В. Ребрикова. М.: БИНОМ, 2009. 215 с.

PCR v rezhime real'nogo vremeni / Pod. red. D.V. Rebrikova. M.: BINOM, 2009. 215 s.

75. Sarrazin C. Highly sensitive hepatitis C virus RNA detection methods: molecular backgrounds and clinical significance. Clin. Virol. 2002. Vol. 25(3). P. 23-29.

76. Podzorski R.P. Molecular testing in the diagnosis and management of hepatitis C virus infection. Arch Pathol Lab Med. 2002. Vol. 126(3). P. 285-290.

77. Мазепа В.Н. Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобакторной, негонококковых урогенетальных инфекций и вирусных гепатитов: автореф. дисс. ... докт. биол. наук. М., 2010. 65 с.

Mazepa V.N. Optimizacija ikompleksnoe ispol'zovaniepolimeraznojcepnoj reakcii v diagnostike aktual'nyh zabolevanij na modeli ostryh kishechnyh, helikobaktornoj, negonokokkovyh urogenetal'nyh infekcij i virusnyh gepatitov: avtoref. diss.... dokr. biol. nauk. M., 2010. 65s.

78. Симанкова Т.В., Гармаш И.В., Аришева О.С. и др. Полиморфизм гена ИЛ-28В как предиктор ответа на противовирусную терапию хронического гепатита С. Клиническая фармакология и терапия. 2012. № 1. С. 17-22.

Simankova T.V., Garmash I.V., Arisheva O.S. i dr. Polimorfizm gena IL-28Vkak prediktor otveta na protivovirusnuju terapiju hronicheskogo gepatita S. Klinicheskaja farmakologija i terapija. 2012. № 1. S. 17-22.

79. Ющук Н.Д., Ивашкин В.Т., Жданов К.В. и др. Рекомендации по диагностике и лечению взрослых больных гепатитом С. М. 2013. 64 с.

Jushhuk N.D., Ivashkin V.T., Zhdanov K.V. i dr. Rekomendaciipo diagnostike i lecheniju vzroslyh bol'nyh gepatitom S. M. 2013. 64 s.

80. Sherman K. et al. Response-guided telaprevir combination treatment for hepatitis C virus infection. N Engl J Med. 2011. Vol. 365. P. 1014-1024.

81. Вирусные гепатиты в Российской Федерации / Аналитический обзор. 2011. № 8. С. 86-92.

Virusnye gepatity v Rossijskoj Federacii / Analiticheskij obzor. 2011. № 8. S. 86-92.

82. Быстрова Т.Н., Михайлова Ю.В. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса гепатита С, циркулирующих на территории с умеренной активностью эпидемического процесса. Инфекционные болезни. 2011. Т. 9. № 2. С. 28-31.

Bystrova T.N., Mihajlova Ju.V. Molekuljarno-geneticheskaja harakteristika izoljatov virusa gepatita S, cirkulirujushhih na territorii s umerennoj aktivnostju jepidemicheskogo processa. Infekcionnye bolezni. 2011. T. 9. № 2. S. 28-31.

83. Быстрова Т.Н., Михайлова Ю.В. Генотипическая структура и уровень вирусной нагрузки у больных с различными вариантами гепатит С-инфекции. Вестник нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского. Серия Биология. 2012. Вып. 2(3). С. 30-36.

Bystrova T.N., Mihajlova Ju.V. Genotipicheskaja struktura i uroven' virusnoj nagruzki u bol'nyh s razlichnymi variantami gepatit S-infekcii. Vestnik nizhegorodskogo gosudarstvennogo universiteta im. N. I. Lobachevskogo. Serija Biologija. 2012. Vyp. 2(3). S. 30-36.

84. Ильченко Л.Ю., Осканова Р.С., Сторожаков Г.И. Вирус гепатита С и особенности течения ВГС-инфекции у онкогематологических больных. Мир вирусных гепатитов. 2010. № 2. С. 9-14.

Il'chenko L. u., Oskanova R.S., Storozhakov G.I. Virus gepatita S i osobennosti techenija VGS-infekcii u onkogematologicheskih bol'nyh. Mir virusnyh gepatitov. 2010. № 2. S. 9-14.

85. Castillo I., Pardo M., Bartolome J. Occult hepatitis C virus infection in patients in whom the etiology of persistently abnormal results of liver-function tests is unknown. Infect. Dis. 2004. Vol. 189. P. 7-14.

86. Parm T. N. Q., Coffin C. S., Michalak T. Occult hepatitis C virus infection: what does it mean? Liver International. 2010. Vol. 30. №4. Р. 502-511.

87. Вишневская Т.В., Масалова О.В., Альховский С.В. и др.Выявление маркеров репликации вируса гепатита С в мононуклеарных клетках периферической крови больных хроническим гепатитом С. Медицинская иммунология. 2008. Т. 10. № 4-5. С. 397-404.

Vishnevskaja T.V., Masalova O.V., Al'hovskij S.V. i dr.Vyjavlenie markerov replikacii virusa gepatita S v mononuklearnyh kletkah perifericheskoj krovi bol'nyh hronicheskim gepatitom S. Medicinskaja immunologija. 2008. T. 10. № 4-5. S. 397-404.

88. Los Alamos National Laboratory (http://hcv.lanl.gov/content/hcv-db/ HTML)

89. Маркин Н.В., Цема Н.И. и др. Распределение субтипов вируса гепатита С в Ростовской области // Сборник трудов V Всерос. НПК «Генодиагностика инфекционных болезней». М. 2004. Т. 1. С. 249-250.

Markin N.V., Cema N.I. i dr. Raspredelenie subtipov virusa gepatita S v Rostovskoj oblasti // Sbornik trudov V Vseros. NPK «Genodiagnostika infekcionnyh boleznej». M. 2004. T. 1. S. 249-250.

90. Цыганко Е.В., Ковалев С.Ю. Распределение генотипов вируса гепатита С в г.Екатеринбурге: динамика эпидемического процесса // Сборник трудов 6-ой всероссийской НПК с международ. участием «Молекулярная диагности-ка-2007». М. 2007. Т. 1. С. 279-283.

Cyganko E.V., Kovalev S.Ju. Raspredelenie genotipov virusa gepatita S v g. Ekaterinburge: dinamika jepidemicheskogo processa // Sbornik trudov 6-oj vserossijskoj NPK s mezhdunarod. uchastiem «Molekuljarnaja diagnostika-2007». M. 2007. T. 1. S. 279-283.

91. Зотова А.В. Парентеральные вирусные гепатиты в Южной Якутии: автореф. дисс. ... канд. мед. наук. М. 2010. 30 с.

Zotova A.V. Parenteral'nye virusnye gepatity v Juzhnoj Jakutii: avtoref. diss. ... kand. med. nauk. M. 2010.30s.

92. Мартынюк Г.А., Хоронжевская-Муляр И.С., Шахгильдян И.В. и др. Распространенность генотипов вируса гепатита С в Ровенской области Северозападной части Украины // Сборник трудов V Всерос. НПК «Генодиагностика инфекционных болезней». М. 2004. Т. 1. С. 251-253.

Martynjuk G.A., Horonzhevskaja-Muljar I.S., Shahgil'djan I.V. i dr. Rasprostranennost' genotipov virusa gepatita S v Rovenskoj oblasti Severo-zapadnoj chasti Ukrainy // Sbornik trudov V Vseros. NPK «Genodiagnostika infekcionnyh boleznej». M. 2004. T. 1. S. 251-253.

93. Кожанова Т.В. Лекарственная устойчивость вируса гепатита С(по материалам 45-го Международного конгресса ЕАSL, 14-18 апреля 2010 г.). Мир вирусных гепатитов. 2010. № 2. С. 32-35.

Kozhanova T. V. Lekarstvennaja ustojchivost' virusa gepatita S(po materialam 45-go Mezhdunarodnogo kongressa EASL, 14-18 aprelja 2010 g.). Mir virusnyh gepatitov. 2010. № 2. S. 32-35.

94. Von Wanger M., Huber M., Berg T. et al. Peginterferon alfa-2a(40 kd) and ribavirin for 16 or 24 weeks in patients with genotype 2 or 3 chronic hepatitis C. Gastroenterol. 2005. Vol. 129. P. 522-527.

95. Lamatte D., Anderson P., Bailey M. et al. An NS3 protease inhibitor with antiviral effects in humans infected with hepatitis C virus. Nature. 2003. Vol. 426(6963). P. 186-189.

96. Lemon S., Yi M., Li K. «Strong reasons make strong actions»- The antiviral efficacy of NS3/4A protease inhibitors. Hepatology. 2005. Vol. 41(3). P. 671-674.

97. Middleton T., He Y, Beyer J. Resistance profile of ABT-333 and relationship to viral load decrease in patients treated in combination with peginterferon and ribavirin for 28 days. Hepatology. 2010. Vol. 52(1). P. 296.

98. Игнатова Т.М. Телапревир в лечении больных хроническим гепатитом С: вопросы безопасности. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатоло-гии, колопроктологии. 2012. Т. 22. № 4. С. 47-57.

Ignatova T. M. Telaprevir v lechenii bol'nyh hronicheskim gepatitom S: voprosy bezopasnosti. Rossijskij zhurnal gastrojenterologii, gepatologii, koloproktologii. 2012. T. 22. № 4. S. 47-57.

99. Ghany M. G., Strader D. B, Thomas D. L. et al. Diagnosis, Management, and Treatment of Hepatitis C: An Update. Hepatology. 2009. Vol. 49. № 4. Р. 40.

100. Jacobson IM., McHutchinson J., Dusheiko G. et al. Telaprevir for previously untreated chronic Hepatitis C Virus Infection. N Engl J Med. 2011. Vol. 364(25). P. 2405-2416.

101. Sarrazin C., Christophe Hezode Ch., Zeuzem S. et al. Antiviral strategies in hepatitis C virus infection. Hepatology. 2012. Р. 88-100.

102. Sherman M., Bain V., Villeneuve J. et al. Management of chronic viral hepatitis: a Canadian consensus conference 2004. Gastroenterol. 2004. Vol. 18. P. 715-728.

103. Zeuzem S. et al. Telaprevir for Retreatment of HCV Infection. N Engl J. Med. 2011. Vol. 364. P. 2417-2428.