CC BY
53
УДК 616.381-002-003.236-092.9:616.155.1-003.826 Кубанский научный медицинский вестник № 3-4 (117-118) 2010
ЛИТЕРАТУРА
1. Аполихина И. А. Папилломавирусная инфекция гениталий у женщин. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2002. - 32 с.
2. Бебнева Т. Н., Прилепская В. Н. Папилломавирусная инфекция и патология шейки матки // Гинекология. - 2005. - Т. 3. № 3. - С. 77-81.
3. Дубенский В. В., Кузнецов В. П., Беляев Д. Л., Слюсарь Н. Н. Эффективность иммунокоррекции цитокинами при лечении папил-ломавирусной инфекции // ЖМЭИ. - 2008. - № 5. - С. 54-58.
4. Киселев В. И. Папилломавирусная инфекция. - М., 2003. -36 с.
5. Козлова В. И., Пухнер А. Ф. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий: Руководство для врачей. - СПб: «Ольга», 2008. - 168 с.
6. Краснопольский В. И., Радзинский В. Е., Буянова С. Н, Ма-нухин И. Б., Кондриков Н. И. Патология влагалища и шейки матки // М.: Медицина, 2007. - С. 128-35.
7. Кубанов А. А. Содержание интерферона, фактора некроза опухоли, интерлейкинов-4 и -12 в цервикальном секрете у пациенток с папилломавирусной инфекцией // Vestn Dermatol Venerol. -2008. - С. 36-39.
8. Патология шейки матки и генитальные инфекции / Под ред. проф. В. Н. Прилепской. - М.: «МЕДпресс-информ», 2008. - 383 с.
9. Роговская С. И. Папилломавирусная инфекция у женщин и патология шейки матки (руководство практикующего врача) // М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 144 с.
10. Bontkes H., de Gruijl T., Bijl A., Verheijen R, Meijer C, Scheper R., Stern P. Human papillomavirus type 16 E2-specific T-helper lymphocyte responses in patients with cervical intraepithelial neoplasia // J Gen Virol. - 2006 Sep. - № 80 (Pt 9). - Р. 2453-2459.
11. Bubenik J., Mikyskova R., Vonka V., Mendoza L. Interleukin-2 and dendritic cells as adjuvants for surgical therapy of tumours associated with human papillomavirus type 16 // Vaccine. - 2008. -№ 14; 21 (9-10). - Р. 891-896.
12. Castle P., Hildesheim A., Bowman F., Strickler H. Cervical concentrations of interleukin-10 and interleukin-12 do not correlate with plasma levels // J Clin. Immunol. - 2008 Jan. - № 22 (1). - Р. 23-27.
13. Clerici M., Merola M., Ferrario E. Cytokine production patterns in cervical intraepithelial neoplasia: association with human papillomavirus infection // J Natl Cancer Inst. - 2007. - № 89. - Р. 245-250.
14. De Gruijl T. T-cell proliferative responses against human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein are most prominent in cervical intraepithelial neoplasia patients with a persistent viral infection // J. Gen. Virol. - 2006. - № 77. - Р. 2183.
15. Horwitz D., Zheng S., Gray J. The role of the combination of IL-2 and TGF-12, or IL-10 in the generation and function of CD4+ CD25+ and CD8+ regulatory T cell subsets // J. Leukoc. Biol. - 2009. - № 74. -Р. 471-478.
16. Lee B., Follen M., Tortolero-Luna G., Eriksen N. Synthesis of IFN-gamma by CD8+ T cells is preserved in HIV-infected women with HPV-related cervical squamous intraepithelial lesions // Immunology. -2007. - № 76. - Р. 103-109.
17. Scott M., Stites D., Moscicki A. Th1 cytokine patterns in cervical human papillomavirus infection // Clin Diagn Lab Immunol. - 2008. -№ 6 (5). - Р. 751-755.
18. Wu T., Kurman R. Analysis of cytokine profiles in patients with human papillomavirus-associated neoplasms // J Natl Cancer Inst. -2007. - № 89. - Р. 185-186.
Поступила 25.02.2010
А. А. БОГАШЕВ, О. А. ТЕРЕЩЕНКО, В. В. ИВАНОВ, А. М. ЛАЙПАНОВ, М. А. ХАСАЕВА, В. Н. ДОЛГОВ, В. Е. РЫКУНОВА, Э. А. ПЕТРОСЯН
СОСТОЯНИЕ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЖЕЛЧНОМ ПЕРИТОНИТЕ
Кафедра оперативной хирургии и топографической анатомии Кубанского государственного медицинского университета,
Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4. E-mail: [email protected]
Работа выполнена на 31 беспородной собаке. При исследовании физико-химических свойств мембран эритроцитов у контрольных животных выделены три фракции эритроцитов по степени осмотического гемолиза: слабоустойчивые, среднеустойчивые и сильноустойчивые. У животных с желчным перитонитом была выявлена высокая степень разрушения «старых» форм эритроцитов по сравнению со «средними» и «молодыми» формами. Проведенные исследования выявили рост сорбционной способности эритроцитов и высокое содержание тиоловых групп в крови при экспериментальном желчном перитоните, что указывает на развитие вторичной интоксикации и дестабилизации барьерной функции мембран эритроцитов.
Ключевые слова: желчный перитонит, эритроцитарная мембрана, осмотическая резистентность.
A. A. BOTASHEV, O. A. TERESHENKO, V. V. IVANOV, A. M. LAIPANOV,
M. A. KHASAEVA, V. N. DOLGOV, V. E. RYKUNOVA, E. A. PETROSYAN
THE STATE OF ERYTHROCYTE MEMBRANES IN CONDITIONS OF EXPERIMENTAL BILIOUS PERITONITIS
Kuban State Medical University, Chair of operative surgery and topographical anatomy,
Russia, 350063, Krasnodar, 4 Sedina st. E-mail: [email protected]
The work was made on 31 mongrel dogs. In exploration of physical and chemical properties of control animals’ erythrocyte membranes in order to osmotic hemolysis three fractions of erythrocytes was marked out: low stable, mid stable and high stable. Animals with bilious peritonitis have high degree of destruction of «old» erythrocytes compared with «middle» and «young» ones. Researches, that was carried out, revealed the growth of sorption capacity of erythrocytes and the high content of thiol groups in blood
in conditions of experimental bilious peritonitis. This is the indication of the development of secondary intoxication and destabilization the barrier function of erythrocyte membranes.
Key words: bilious peritonitis, erythrocyte membrane, osmotic resistance.
Введение
Широкое внедрение малоинвазивных методов в хирургии печени и желчевыводящих путей зачастую сопровождается развитием желчного перитонита (ЖП) [5]. Современные представления о патогенезе эндогенной интоксикации при перитонитах вообще и желчном перитоните в частности основываются на признании ведущей роли в нём мембранодеструктивных процессов [4, 9]. Это обусловлено тем, что спектр модифицирующих факторов при данной патологии значительно расширяется за счет образования в больших количествах медиаторов воспаления, токсических продуктов клеточного распада, микробных экзо- и эндотоксинов и т. п. [3, 15].
Физико-химические свойства биологических мембран зависят от состава ее основных компонентов - липидов и белков [6]. Нарушения липидного обмена могут лежать в основе развития деструктивных процессов в мембранах. Повреждая клеточные мембраны, продукты ПОЛ могут играть важную роль в механизмах клеточного повреждения, где создаются условия для развития процессов пероксидации и эффекторной вторичной интоксикации [1, 11, 12]. Окисленные мембранные липиды легче атакуются фосфолипазами, что способствует их удалению из мембран и изменению качественного и количественного состава фосфолипидов. Исходя из того, что на мембранах эритроцитов сорбируются главным образом катионные гидрофобные продукты незавершенного протеолиза, а также вещества ароматической и нуклеотидной природы анаболического пула веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ), возникает интерес изучения условий для образования дополнительных каналов проницаемости (кластеров), приводящих к изменению клеточного гомеостаза с последующим их разрушением. В таких случаях может возникнуть ситуация, когда потребности организма в переносе токсинов не будут совпадать с возможностями транспортных систем организма, что привлекает внимание широкого круга исследователей к проблеме регуляторной роли ПОЛ в реализации структуры и функции клеточных мембран, которые тесно взаимосвязаны между собой.
Цель исследования - изучить степень повреждающего эффекта свободнорадикальных процессов на мембраны эритроцитов при экспериментальном желчном перитоните.
Методика исследований
Работа выполнена на 31 беспородной собаке, весом 15±2 кг, которые содержались в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических помещений» (вивариев), утвержденными МЗ СССР 06.07.73 и приказом МЗ СССР от 10.03.66 г. № 163. Эксперименты проведены в соответствии со статьей XI Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964), «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ
от 19.06.2003 г. № 267). Все животные были разделены на 2 группы: в I, контрольную группу для определения лабораторных показателей нормы было включено 31 животное, из которых 5 были забиты для проведения гистологических исследований; во II, опытную группу вошли 26 животных с моделью 24-часового желчного перитонита [10]. Определение сорбционной способности эритроцитов (ССЭ) проводили по методике [13], а осмотической проницаемости мембран эритроцитов - по методике Дейчи [14]. Изучение концентрации общих ти-оловых групп (SH-групп) в крови выполняли по методике [2]. Экспериментальные исследования проводились до и после создания модели 24-часового желчного перитонита. Результаты исследований обработаны с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Exel» и «Statistica 6,0» для Windows «StatSoft. In с». Данные представлены в виде среднего арифметического значения и стандартной ошибки среднего М+m, а при непараметрическом характере распределения величин -в виде медианы с указанием 25-го и 75-го квартилей [медиана (25-75-й квартили)]. Для всех проведенных анализов различия считались достоверными при двустороннем уровне значимости р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Одной из моделей для изучения свободнорадикального повреждения клеточных мембран является исследование физико-химических свойств мембран эритроцитов (осмотического гемолиза) хлоридом натрия (NaCl), которое позволяет оценить как усредненные, так и групповые характеристики популяции эритроцитов. Так, исследование осмотического гемолиза эритроцитов в контрольной группе животных позволило выделить три фракции эритроцитов с различной степенью осмотической проницаемости: слабоустойчивые, когда гемолиз эритроцитов наступал после воздействия 0,10-0,30%-ного раствора NaCl, среднеустойчивые - с гемолизом после обработки 0,30-0,45%-ным раствором NaCl и сильноустойчивые - с гемолизом после обработки 0,45-0,60%-ным раствором NaCl (рис. 1).
Полученные результаты, указывающие на различную степень осмотической проницаемости мембран эритроцитов, во-первых, объясняются разнообразием «возрастных» форм эритроцитов, во-вторых, свидетельствуют о неоднородности повреждающего действия продуктов естественного метаболизма. Причина подобных эффектов может быть связана с физиологическим «старением» эритроцита, когда снижается энергетический потенциал клетки, меняется поверхностный заряд, появляются дефекты на поверхности мембраны, и тем самым изменяется её осмотическая проницаемость.
Исследования осмотической проницаемости эритроцитов у животных с желчным перитонитом на фоне эндогенной интоксикации указывают на уменьшение среднего количества пиков поглощения красителя на спектрограммах, определяемых по индивидуальным кривым осмотического гемолиза эритроцитов: с 3,3 в контроле до 2,9 в опыте, что говорит в пользу тенденции «выравнивания» возрастных различий
Кубанский научный медицинский вестник № 3-4 (117-118) 2010
Кубанский научный медицинский вестник № 3-4 (117-118) 2010
эритроцитов за счет более молодых форм. Полученные результаты подтверждаются данными о более высокой интенсивности разрушения «старых» форм эритроцитов по сравнению со «средними» и «молодыми» формами эритроцитов у животных с 24-часовым желчным перитонитом (рис. 1). На фоне разрушения эритроцитарных мембран «старых» форм эритроцитов появляются клетки с высокой осмотической резистентностью мембраны. Об этом говорит сдвиг максимума осмотической проницаемости эритроцитарных мембран при желчном перитоните в каждой возрастной группе эритроцитов в сторону уменьшения концентраций ЫаС!. Подобная направленность изменений подтверждается ростом скорости гемолиза с 6,22/0,1% ЫаС! у контрольных животных до 7,55/0,1% ЫаС! у животных с желчным перитонитом и уменьшением концентрации 50%-го гемолиза с 0,40%-ного ЫаС! у контрольных
и, во-вторых, запуском адаптационно-компенсаторного механизма стимуляции эритропоэза красного костного мозга с выходом в сосудистое русло «молодых» форм эритроцитов, более устойчивых к гемолизу.
Общеизвестно, что перитонит сопровождается развитием синдрома эндогенной интоксикации с повышением ВНСММ, сорбированных на гликокаликсе эритроцитов [7, 8]. Интенсификация ПОЛ изменяет фосфолипидный состав мембран, липид-липидные и белок-липидные соотношения. Нарастающая интоксикация приводит к образованию избыточного количества АФК, под действием которого происходит токсиче-ское и окислительное повреждение эритроцитов, что становится причиной структурно-функциональных изменений мембран эритроцитов и увеличения диффузии некоторых элементов в клетку по дополнительно образовавшимся каналам проницаемости - кластерам. На основании этого естест-
Рис. 1. Дифференциальные кривые осмотического гемолиза эритроцитов у контрольных животных и животных с желчным перитонитом
животных до 0,36%-ного у животных с желчным перитонитом. С одной стороны, разрушение менее резистентных «старых» форм эритроцитов можно объяснить тем, что процессы свободнорадикального окисления изменяют фосфолипидное окружение в фермент-ион-транспортной АТФ-азе эритроцитарных мембран и, как следствие, его активность. Изменение активности ион-транспортных АТФ-аз приводит к сдвигам в концентрационном градиенте Ыа+, К+, Са2+ между внеклеточной средой и эритроцитом. Указанные сдвиги понижают устойчивость эритроцитарных мембран и повышают их проницаемость, что свидетельствует о значительных структурных изменениях в эритроцитарных мембранах. С другой стороны, не исключены адаптационно-компенсаторный механизм запуска эритропоэза в красном костном мозге и выход в кровь «молодых» форм эритроцитов, что направлено на усиление доставки к клеткам кислорода и снижение гипоксических проявлений.
Таким образом, разрушение менее резистентных «старых» форм эритроцитов при желчном перитоните, во-первых, можно объяснить процессами свободнорадикального окисления и изменениями активности ион-транспортных АТФ-аз эритроцитарных мембран, приводящих к повышению их осмотической проницаемости,
венно предположить, что проницаемость мембран эритроцитов и сорбционная способность эритроцитов могут служить основными, обобщающими критериями при определении тяжести эндогенной интоксикации. Превышение потребности организма в транспорте токсинов и возможностей эритроцитарных транспортных систем может стать серьезным основанием для развития поли-органной недостаточности.
Эти предположения находят подтверждение при экспериментальном желчном перитоните, когда наблюдалось повышение ССЭ до 23,4% (18,4-25,9%) против 18% (16-19,2%) в контрольной группе (р<0,05) (рис. 2), что может стать одним из факторов развития вторичной интоксикации.
Другим маркером осмотической резистентности эритроцитов является изучение у животных с желчным перитонитом общего количества тиоловых (БН-) групп в крови.
Так, при развитии желчного перитонита отмечался рост суммарного содержания тиоловых групп в крови до 1119 (1089-1188) мкмоль/л против 650 (547-694) мкмоль/л у контрольных животных (р<0,05) (рис. 3), что подтверждает структурно-функциональную дестабилизацию барьерной функции эритроцитарных мембран.
32
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
К
□ МесНап I I 25%-75% Т~ Мт-Мах
Рис. 2. Сорбционная способность эритроцитов у контрольных животных и животных с желчным перитонитом. К - контроль. О - опыт
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
к
□ МесНап I I 25%-75% Т~ М!п-Мах
Рис. 3. Содержание тиоловых групп в крови контрольных животных и животных с желчным перитонитом.
К - контроль. О - опыт
Таким образом, перекисное окисление липидов инициирует целый ряд физико-химических изменений в мембранах эритроцитов при экспериментальном желчном перитоните, а его интенсификация в крайнем своем проявлении ведет к возникновению зон повышенной ионной проницаемости и нарушению барьерной функции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972. - 252 с.
2. Веревкина И. В., Точилкина А. И., Попова Н. А. // Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С. 223-231.
3. Гостищев В. К., Сажин В. П., Авдоненко А. Л. Перитонит. -М., 1992.
4. Доманский А. В., Лапшина Е. А, Заводник И. Б. Окислительные процессы, индуцируемые органической гидроперекисью в эритроцитах человека: хемилюминесцентные исследования // Биохимия. - 2005. - № 7. - С. 922-931.
5. Журавлев В. Н., Касумьян С. А, Буянов А. Л., Шнепе-лев С. Е. Травма печени // Анналы хирургической гепатологии. -1998. - № 3. - С. 190.
6. Кармен Н. Б., Милютина Н. П., Орлов А. А. Структурнофункциональное состояние мембран эритроцитов и его коррекция перфтораном // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2005. - № 5. - С. 517-519.
7. Лужников Е. А. Современные принципы детоксикационной терапии острых отравлений // Анестезиология и реаниматология. -1998. - № 6. - С. 4-6.
8. Малахова М. Я. Эндогенная интоксикация как отражение компенсаторной перестройки обменных процессов в организме // Эфферентная терапия. - 2000. - № 4. - С. 3-14.
9. Оболенский С. В., Малахова М. Я., Беляков Н. А. // 4-й Всесоюзный съезд анестезиологов и реаниматологов. Тезисы докладов. - М., 1989. - С. 44.
10. Петросян Э. А., Сергиенко В. И., Каде А. Х., Петровский А. Н. и др. Способ моделирования желчного перитонита. Патент РФ № 2175784 от 10.11.2001. Бюл. 2001, № 31.
11. Ройтман Е. В., Дементьева И. И., Азизова О. А, Никитина Н. А. и др. Изменение реологических свойств крови и осмотической резистентности эритроцитов при активации свободнорадикальных процессов // Гемостаз и реология. - 2000. - № 1. -С. 15-17.
12. Стародубцева М. Н., Кузнецова Т. Г., Черенкевич С. Н. Механические свойства мембран эритроцитов человека при действии пероксинитрита // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - № 2. - С. 227-230.
13. Тогайбаев А. А, Кургузкин А. В., Рикун И. В. Способ диагностики эндогенной интоксикации // Лабораторное дело. - 1988. -№ 9. - С. 22-24.
14. Тодоров Й. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. - София: «Медицина и физкультура». - 1968. -1064 с.
15. Шуркалин Б. К., Кригер А. Г., Горский В. А., Владимиров В. Г. Гнойный перитонит. - М., 1993. - С. 12-16.
Поступила 11.03.2010
Кубанский научный медицинский вестник № 3-4 (117-118) 2010
