CC BY
12СОСТОЯНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО И КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА У ЖИВОТНЫХ ОПУХОЛЕНОСИГЕЛЕй...
УДК 616-006:612.57]-092.9:612.017.1
СОСТОЯНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО И КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА У ЖИВОТНЫХ ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕй ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ОБЩЕЙ ГИПЕРТЕРМИИ (43,5°С)
Ефремов А.В., Тулеутаев М.Е., Кривошапкин И.А., Самсонова Е.Н., Сафронов И.Д., Узакова А. О.
ФГБОУ ВО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава РФ, г.
Новосибирск, Россия, Международная высшая школа медицины УНПК МУК, Бишкек, Кыргызстан
Резюме: В работе изучены показатели гуморального и клеточного иммунитета у крыс Вистар с кар-циносаркомой Walker 256 при развитии опухолевого процесса и действии общей гипертермии (43,5°С). Полученные данные свидетельствуют, что действие общей гипертермии на организм экспериментальных животных с карциносаркомой Walker 256 сопровождается разнонаправленными изменениями параметров иммунной системы как в сторону их понижения, так и повышения в различные сроки постгипертермическо-го периода. Это может являться следствием активации эндогенных регуляторных систем, определяющих иммунную реактивность организма.
Ключевые слова: карциносаркома Walker 256, гуморальный и клеточный иммунитет, общая гипертермия.
Жалпы гипертермиянын (43,5°с) таасиринен кийин шишиги бар жаныбарлардагы гуморалдык
жана клеткалык иммунитеттин абалы
Ефремов А.В., Тулеутаев М.Е., Кривошапкин И.А., Самсонова Е.Н., Сафронов И.Д., Узакова А. О.
Корутунду: Илимий иште жалпы гипертермиянын (43,5°С) таасиринде жана шишик процесси-нин eсYYCYндeгY Walker 256 карциносаркомасы менен болгон Вистар келемиштериндеги гуморалдык кeрсeткYчтeрY жана клеткалык иммунитети изилденген. Алынган маалыматтар жалпы гипертермиянын (43,5°С) таасири Walker 256 карциносаркомасы менен болгон эксперименталдык жаныбарлардын орга-низмине гипертермиялык мезгилден кийин ар кандай мeeнeттe, иммундук системанын параметрлеринин тeмeндee тарабын карай, ошондой эле жогорулоо тарабын карай ар тараптуу eзгeрYYлeр менен коштолорун мYнeздeйт. Бул организмдин иммундук реактивдYYЛYГYн аныктоочу эндогендик регулятордук системанын натыйжасы болуп саналышы мYмкYн.
Негизги сездер: Walker 256 карциносаркомасы, гуморалдык жана клеткалык иммунитет, жалпы гипертермия.
State humoral and cellular immunity animals tumor after exposure to whole body hyperthermia (43,5°C)
Efremov AV Tuleutayev ME, Krivoshapkin IA, Samsonova EN, Safronov ID, Uzakova AO
Summary: The paper studied indicators of humoral and cellular immunity in Wistar rats with carcinosarcoma Walker 256 in the development of tumor and effect of general hyperthermia (43,5 ° C). The findings suggest that the effect of total body hyperthermia on experimental animals with carcinosarcoma Walker 256 accompanied by opposite changes of parameters of the immune system in both the downward and increase in different periods posthyperthermal period. This may be the result of activation of endogenous regulatory systems that determine the immune reactivity of the organism.
Key words: carcinosarcoma Walker 256, humoral and cellular immunity, total hyperthermia.
Проблема иммунологической реактивности организмов при опухолевом росте остаётся одной из важнейших научных проблем в современной медицине. Вопрос о том, почему на фоне достаточной иммунологической реактивности возникают и растут опухолевые клетки, резко отличающиеся по своим морфологическим и функциональным параметрам, способные не только подавлять, но и стимулировать иммунологические свойства организма, является не только центральным вопросом патологической физиологии, но и онкологии, иммунологии и генетики.
Известно, что опухолевый рост является системным патологическим процессом, поражающим весь организм, все звенья его иммуногенетической и нейроэндокринной регуляции. Поэтому проблема стимуляции иммунитета и изучения взаимоотношений в системе «организм-опухоль» важна не только в плане предотвращения потенциального опухолевого роста, но и с точки зрения изучения динамики развития этих процессов, особенно на поздних этапах опухолевого процесса [2]. Взаимоотношение опухоли с иммунной системой организма имеет два аспекта - специфический, ассоциированный
ГОПРОФИЛЬНЫЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ
Кыргызстана^
преимущественно с цитотоксическими лимфоцитами, и неспецифический, определяемый как часть системного взаимодействия опухоли и организма.
Традиционными направлениями медицины в отношении противоопухолевых защитных систем организма является их стимуляция с помощью фармакологических агентов, естественных механизмов и продуктов жизнедеятельности иммунокомпетентных клеток: интерферонов, лимфокинов, направленной лимфоцитарно-клеточной и генной терапии.
Иммуномодулирующие эффекты физических методов воздействия на опухолевые ткани практически не исследованы. В этом смысле наиболее перспективными представляются методы общей гипертермии (ОГ), при которых возможно не только разрушение опухолевой ткани, но и стимуляция системных и локальных механизмов иммунного ответа [5]. В целом можно констатировать, что ОГ остается одним из эффективных модификаторов традиционной противоопухолевой терапии. Но клиническому применению ОГ должно предшествовать ее экспериментальное моделирование с целью более полного и детального изучения санагенетических и патогенетических аспектов влияния высокой температуры на клетки, ткани, органы и организм в целом. В связи с чем, представляется целесообразным провести исследование характера перестройки иммунной системы у животных опухоленосителей при воздействии общей гипертермии.
цель работы - изучить особенности изменения параметров гуморального и клеточного иммунитета у крыс с карциносаркомой Walker 256 после сеанса общей гипертермии (43,5°С).
материал и методы исследования.
Исследования проведены на 90 крысах-самцах линии Вистар массой 180-200 г и возрастом 2,5 мес. Работа с животными выполнялась согласно директивам Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации. Контрольную группу составили 15 интактных крыс, а экспериментальную - 75 животных.
Для экспериментального опухолевого роста использовали перевиваемый штамм карциносаркомы Walker 256, поддерживаемый in vivo в лаборатории физиологической генетики НИИ цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск). Суспензию клеток Walker 256 вводили крысам в мышцу бедра (106 клеток в 0,1 мл 0,9% раствора NaCl).
Способ моделирования искусственной ОГ у мелких лабораторных животных [4] основывался на разогревании крысы в резервуаре универсального водного термостата BWT-U, предназначенного для точного поддержания установленной температуры в диапазоне от 25°С до 100°С. Уровень ОГ, при котором прекращали разогрев животных, определялся ректальной температурой 43,5°С (стадия теплового удара). Время разогревания животного было индивидуальным, не зависело от исходной температуры тела, массы и составляло не более 17 мин. Забор биологического материала для исследования параметров иммунитета выполнялся на 1, 3, 7 и 14-е сутки после ОГ.
Определение параметров гуморального иммунитета (IgA, IgM и IgG) проводилось с использованием тест-систем Bethyl Laboratories, Inc. (USA). Результаты регистрировали на планшетном спектрофотометре Multiskan Spectrum (Finland) в единицах оптической плотности при 450 нм (референс-фильтр 620-650 нм). Концентрацию Ig (мг/мл) в пробах определяли по калибровочным графикам. Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) оценивали методом жидкостной преципитации 4% ПЭГ-600.
Исследование клеточного иммунитета проводилось путем определения моноклональных антител (МАТ) к CD3, CD4, CD8, CD16 и CD20 антигенам (LifeSpan Biosciences и MyBioSource, Inc.) в реакции иммунной флюоресценции с учетом результатов на люминесцентном микроскопе AXIO SCOPE A1 LED (Carl Zeiss, Germany).
Полученный материал был обработан с помощью методов вариационной статистики [3] путем расчета средней арифметической (М), стандартной ошибки среднего (m). Данные в таблицах представлены в виде М ± m. Различия показателей рассчитывали методом разностной статистики по t-тесту для зависимых величин и считали статистически значимыми при р < 0,05.
результаты исследований и обсуждение.
Проведенные исследования гуморального иммунитета показали (табл. 1), в период с 3-х по 7-е сутки постгипертермического периода наблюдается значимое повышение уровней ЦИК в кров у крыс с карциносаркомой Walker 256 (соответственно на 27,9% и 21,8%), по сравнению с данными контрольных животных (р < 0,05). В остальные сроки наблюдения изучаемый параметр гуморального звена иммунитета не отличался от аналогичного показателя в группе контроля.
При оценке содержания IgA в сыворотке крови у животных с карциносаркомой Walker 256, подвергшихся сеансу ОГ было обнаружено, что на 7-е сутки постгипертермического периода данный показатель снизился на 22,5%, а на 14-е сутки на 24,5% относительно контрольных значений (р < 0,05).
В изменении содержания IgM отмечалась разнонаправленная динамика: на 1-е сутки постгипертермического периода отмечалось снижение уровня иммуноглобулина в крови на 25,7%, на 3-и сутки уровень данного показателя, наоборот, повысился на 17% (р < 0,05). В остальные дни (7-14-е сутки) наблюдения достоверных различий между экспериментальной группой и контролем отмечено не было (р > 0,05).
состояние гуморального и клеточного иммунитета у животных опухоленосителей ...
Таблица 1 - Динамика параметров гуморального иммунитета у животных с карциносаркомой Walker 256 после воздействия общей гипертермии (M ± m).
Животные с карциносаркомой Walker 256 после
Показатели Контроль общей гипертермии (сутки)
1-е сутки 3-и сутки 7-е сутки 14-е сутки
ЦИК, усл. ед. 21,8±1,79 22,04±1,88 27,89±2,319* 26,56±2,07* 20,22±1,68
IgA, мг/мл 0,49±0,031 0,42±0,029 0,48±0,034 0,38±0,031* 0,37±0,028*
IgM, мг/мл 0,78±0,062 0,58±0,044* 0,91±0,051* 0,88±0,062 0,73±0,071
IgG, мг/мл 5,2±0,39 4,13±0,32* 6,48±0,51* 7,04±0,53* 4,88±0,39
Примечание: * - обозначены величины, достоверно отличающиеся от контроля
Таблица 2 - Динамика параметров клеточного иммунитета у животных с карциносаркомой Walker 256
после воздействия общей гипертермии (M ± m).
Животные с карциносаркомой Walker 256 после общей
Показатели Контроль гипертермии (сутки)
1-е сутки 3-и сутки 7-е сутки 14-е сутки
Лимфоциты (109/л) 2,6 ± 0,18 2,0 ± 0,23* 3,9 ± 0,28* 2,4 ± 0,21 2,5 ± 0,20
CD3+лимфоциты, % 59,9 ± 2,61 53,3 ± 3,03* 63,9 ± 3,51 57,3 ± 3,33 51,4 ± 2,54*
CD4+лимфоциты,% 31,7 ± 2,72 28,5 ± 2,13 35,0 ± 2,43* 31,2 ± 2,06 26,5 ± 1,95*
CD8+лимфоциты,% 18,4 ± 1,44 16,3 ± 1,32 17,4 ± 1,25 18,6 ± 1,61 17,6 ± 1,23
CD4/CD8 1,7 ± 0,17 1,7 ± 0,08 2,0 ± 0,18* 1,7 ± 0,11 1,6 ± 0,14
CD16+лимфоциты,% 9,1 ± 1,03 10,5 ± 0,93 12,0 ± 1,21* 10,1 ± 0,87 8,2 ± 0,77
CD20+лимфоциты,% 14,0 ± 1,36 12,1 ± 0,91 16,5 ± 1,77 14,8 ± 1,57 11,5 ± 0,88*
Примечание: * - обозначены величины, достоверно отличающиеся от контроля
Сходная тенденция наблюдалась и для IgG, когда его содержание в крови крыс с карциносаркомой Walker 256, подвергшихся воздействию ОГ, в 1-е сутки уменьшалось на 20,6%, а на 3-и и 7-е сутки увеличилось, по сравнению с данными контрольной группы на 24,6% и 35,4% соответственно (р < 0,05). К окончанию эксперимента (14-е сутки) изучаемый показатель вернулся к контрольным значениям.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что после ОГ (43,5°С) на фоне снижения в крови уровней IgM, IgG на 1-е сутки, а IgA на 7-14-е сутки, у животных опухоленосителей отмечается увеличение содержания ЦИК и IgM, IgG на 3-7-е сутки постгипертермического периода, что может являться ответной реакцией на гипертермию со стороны регуляторных систем организма, определяющих его иммунную реактивность.
Анализ состояния клеточного иммунитета показал (табл. 2), что общее содержание лимфоцитов в крови у крыс с карциносаркомой Walker 256 в 1-е сутки постгипертермического периода достоверно уменьшилось на 22,1%, по сравнению с контролем, но на 3-и сутки, наоборот, увеличилось, и было выше результатов контроля в 1,5 раза (р < 0,05). На 7-е и 14-е сутки постгипертермического периода величина изучаемого параметра уже не отличалась от показателей животных из контрольной группы.
При оценке уровня CD3+ лимфоцитов в крови у животных с карциносаркомой Walker 256, подвергшихся ОГ было обнаружено, что на 1-и сутки постгипертермического периода данный показатель снизился на 15% (р < 0,05), а на 3-и и 7-е сутки вернулся к контрольным значениям. К 14-м суткам содержание CD3+ лимфоцитов крови вновь значимо уменьшилось в 1,2 раза, по сравнению с контролем (р < 0,05).
В изменении содержания CD4+ лимфоцитов отмечалась разнонаправленная динамика: на 3-и сутки данный показатель повысился на 17%, на 14-е сутки снизился (р < 0,05). В остальные дни постгипертермического периода достоверных различий между экспериментальной группой и контролем отмечено не было (р > 0,05). Сходная тенденция наблюдалась и для CD8+ лимфоцитов, когда их содержание в крови не превышало контрольные данные в течение всего эксперимента.
Рассчитанный дополнительно показатель иммунорегуляторного индекса (CD4/CD8) свидетельствовал, что у животных опухоленосителей после сеанса ОГ его величина возрастает на 3-и сутки постгипертермического периода (р < 0,05). Аналогичная закономерность наблюдалась и для содержания CD16+ лимфоцитов в крови в группе животных с карциносаркомой Walker 256, подвергшихся воздействию ОГ, только на 3-и сутки постгипертермического периода отмечалось повышение изучаемого показателя на 30,7% (р < 0,05). В остальные дни данный показатель не отличался от контроля.
При анализе уровня CD20+ лимфоцитов в крови у животных с карциносаркомой Walker 256 после ОГ было установлено их достоверное снижение на 18% только на 14-е сутки наблюдения (р < 0,05).
ГОПРОФИЛЬНЫЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ
Кыргызстана^
Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что особенности иммуномодулирующего действия гипертермии (43,5°С) на животных опухоленосителей заключается в следующем: эффект ОГ проявляется лимфопенией в раннем постгипертермическом периоде (1-е сутки), с последующим ростом количества лимфоцитов (3-и сутки) и снижением к концу эксперимента. На уровне субпопуляционного состава лимфоцитов, на фоне временного повышения CD4+, CD^+лимфоцитов и баланса CD4+/CD8+ лимфоцитов (на 3-и сутки), отмечается снижение содержания иммунных клеток (CD3+, CD4+, CD20+) на 14-е сутки постгипертермического периода, что может являться ответной реакцией на гипертермию со стороны регуляторных систем, определяющих иммунную реактивность организма.
Обсуждая полученные результаты, можно предположить, что в процессе опухолевого роста, при угнетении или отсутствии киллерного эффекта (CD8+)Т-лимфоцитов деструкция трансформированных злокачественных клеток может осуществляться за счет цитотоксичности, опосредованной гуморальными антителами [1]. Хотя роль гуморального звена в противоопухолевой защите организма не до конца ясна. Считается, что противоопухолевые антитела (IgG, IgM) в одних случаях оказывают защитное действие, в других - способствуют прогрессии злокачественных опухолей [7, 10]. Опухолеспецифические антитела связываются с антигенами опухолевых клеток, однако фонового уровня комплемента часто недостаточно для развития антителозависимого лизиса опухолевых клеток. Этому, в частности, может способствовать высокая экспрессия на опухолевых клетках молекул, препятствующих цитолитическому действию комплемента. Считается, что опсонизация опухолевых клеток антителами в определенных случаях приводит к блокаде опухолевых антигенов и недоступности их для рецепторов (CD8+)Т-лим-фоцитов. Другой механизм защиты опухоли связан со сбрасыванием опухолевыми клетками со своей поверхности комплексов антиген-антитело [2]. Поэтому, наблюдаемое в нашем исследовании увеличение уровней ЦИК, IgM и IgG в крови после ОГ (43,5°С) может являться отражением иммуномодулирующего эффекта гипертермии, направленного на индукцию секреции опухолеспецифических антител к антигенам карциносаркомы Walker 256 с целью сдерживания прогрессии опухолевого процесса. Кроме того, можно предположить, что иммунологические сдвиги при гипертермии зависят, прежде всего, от температурного режима ОГ. Так, показано, что в режиме ОГ (41,8°С) происходит апоптоз различных субпопуляций лимфоцитов [6]. После ОГ (42,3°С) в эксперименте на 8 день снижался уровень CD8+ и CD5+ лимфоцитов, а CD4+ лимфоцитов не изменялся [8]. В тоже время после ОГ (42,3°С) отмечалась выраженная лимфопения. Причем в пределах популяции T-клеток CD8+ лимфоциты более чувствительны к гипертермии, чем CD4+лимфоциты [9]. Следовательно, применяемая в нашей работе ОГ (43,5°С), способна оказывать иммуномодулирующий эффект на состояние клеточного иммунитета у животных.
список использованных источников
1. Агеенко А. Гордиенко С. П. Иммунитет и терапия экспериментальных опухолей. — Кишинев: Штиинца, 1982. — 310 с
2. Барышников А.Ю. Взаимоотношение опухоли и иммунной системы организма//Практическая онкология • Т. 4, № 3 - 2003 127-130
3. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М., 1999. - 275 с.
4. Ефремов А.В. Патент 2165105 Российская Федерация. Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных /Ефремов А. В., Пахомова Ю. В., ПахомовЕ. А., Ибрагимов Р. Ш., Шорина Г.Н.// опубл. 12.10.2001
5. Chen S.C., Evans S.S. Thermal regulation of lymphocyte trafficking: Hot spots of the immune response // Int J Hyperthermia.-2005.- vol.21(8).-P. 723-729
6. Dieing A., Ahler O., Kerner T., Wust O., FelixR., Loffel J., Riess H., Hildebrandt B. Whole body hyperthermia induces apoptosis in subpopulation of blood lymphocytes // Immunobiology. - 2003. - Vol. 207 (4). - P. 265-273
7. Habal N1, Gupta RK, BilchikAJ, Yee R, Leopoldo Z, Ye W, Elashoff RM, Morton DL.; ancerVax, an allogeneic tumor cell vaccine, induces specific humoral and cellular immune responses in advanced colon cancer.//Ann Surg Oncol. 2001 Jun;8(5):389-401
8. Kearns R.J., Ringler S., Krakowka S. Talmann R., Sites J., Oglesbee M.G. The effects of extracorporal whole body hyperthermia on the functional and phenotypic features of canine peripheral blood mononuclear cells (PBMC) // Clin. Exp. Immunol.- 1999. - Vol. 116 (1). - P.188-192
9. Oglesbee M.J., Diehl K, Krawford E, Kearns R.J, Krakowka S. Whole body hyperthermia: effects upon canine immune and hemostatic functions // Vet Im munol Immunopathol. - 1999. -Vol. 69 (2 4). - P.185-199
10. Ravindranath MH, Kelley M C, Jones R C, Amiri A A, Bauer P M, Morton D L. Ratio of IgG:IgM antibodies to sialyl Lewis(x) and GM3 correlates with tumor growth after immunization with melanoma-cell vaccine with different adjuvants in mice //International journal of cancer. Journal international du cancer 1998. 75 (1): 117-24
сведения об авторах
Ефремов Анатолий васильевич - член-корр. РАМН, д.м.н., профессор, зав. кафедрой патологической физиологии и кли-нической патофизиологии ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52. E-mail: AVE [email protected].
состояние гуморального и клеточного иммунитета у животных опухоленосителей .
Тулеутаев Мухтар Есенжанович - кандидат медицинских наук, докторант кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52..
Кривошапкин Иван Алексеевич - аспирант кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52. E-mail: [email protected].
Самсонова Елена Николаевна - д.м.н., профессор кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52. E-mail: е[email protected].
Сафронов Игорь Дмитриевич - д.м.н., профессор кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52.
Узакова Аида Орозалиевна - доктор философии(PhD), ассистент кафедры педиатрии, акушерства и гинекологии Международной высшей школы медицины
