CC BY
46
ОЦЕНКА РОЛИ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ НАРУШЕНИЯ МЕТАБОЛИЗМА У КРЫС С КАРЦИНОСАРКОМОЙ WALKER-256 ПОД ВЛИЯНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ТЕРАПИИ
Е. В. Овсянко, Ю. В. Пахомова,
К. К. Дмитриева, А. В. Игнатова
ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет
Росздрава» (г. Новосибирск)
В статье рассматривается содержание жирорастворимых антиоксидантов в сыворотке крови у крыс с линейно-неспецифической карциносаркомой Walker-256 в динамике и на фоне применения общей управляемой гипертермии, циклофосфана и мелатонина. Полученные данные позволяют заключить, что используемые в проведенных исследованиях методики противоопухолевой терапии оказывают различное влияние на динамику содержания жирорастворимых антиоксидантов в организме экспериментальных животных.
Ключевые слова: противоопухолевая терапия, динамика содержания жирорастворимых антиоксидантов
Введение. Согласно современным научным взглядам, свободные радикалы играют важную роль как в инициации канцерогенеза (вызывая модификацию ДНК), так и на уровне длительно протекающей стадии промоции опухолевого роста, когда инициированная клетка постепенно приобретает фенотипические черты злокачественных клеток [9]. Экспериментальные исследования, в которых изучалась кинетика радикальных реакций при опухолевом росте, подтверждают данную гипотезу. Так было обнаружено, что свободный радикал окиси азота (N0*) способен оказывать повреждающее действие на структуру ДНК, окисляя ее основания, гидроксилируя метильную группу тимина и превращая гуанин в 8-оксипроизводное. Избыточное образование генотоксических соединений в этих условиях повышает вероятность мутации супрессорного гена р53, контролирующего апоптоз, а это, в свою очередь, повышает вероятность выживания клеток, инициированных сублетальными дозами канцерогена, которые способны в процессе воздействия промоторов и последующих фенотипических изменений дать начало злокачественному клону [1].
Считается, что канцерогенез сопровождается фазовой динамикой свободнорадикальных реакций в прогрессии опухолевого роста. Происходящие сдвиги в активности свободнорадикальных реакций тесным образом связаны с изменением содержания в тканях организма-опухоленосителя антиоксидантов [5]. Отмечено, что опухолевые ткани часто содержат более низкие концентрации свободнорадикальных соединений в сочетании с относительно высоким содержанием антиоксидантов (аскорбиновой кислоты, глютатиона) и
активностью протеинкиназы С (PKC), являющейся ключевым ферментом злокачественности [10]. Однако было показано, что а-токоферол ингибирует активность PKC вследствие предотвращения аутофосфорилирования фермента, которое является необходимым для активности или дефосфорилированием PKC протеиновой фосфатазой PP2A, которая активизируется витамином Е [13]. Среди аналогов витамина E сукцинат а-токоферола оказался мощным апоптогеном, механизм действия которого использует различные пути передачи сигналов, связанных с трансформирующим фактором роста бета, Fas и митогенактивированной протеинкиназы и сцепленный с фактором некроза опухоли лиганд Apo2 [14]. Все эти данные дают основание считать, что в развитии злокачественных опухолей большое значение имеют как характер и динамика протекания свободнорадикальных реакций, так и состояние антиоксидантной регуляторной системы. С другой стороны, использование химических и физических методов противоопухолевой терапии часто способствует увеличению интенсивности свободнорадикальных реакций в организме [4, 12]. Поэтому представляется вполне целесообразным провести исследование особенностей изменения состояния антиоксидантного потенциала на разных этапах экспериментального опухолевого роста и под влиянием современных методов терапии.
Цель исследования. Целью настоящего исследования было изучение содержания жирорастворимых антиоксидантов в сыворотке крови у крыс с линейно-неспецифической карциносаркомой Walker-256 в динамике и на фоне применения общей управляемой гипертермии, циклофосфана и мелатонина.
Материалы и методы исследования. Исследование проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 180-200 г, полученных из вивария ЦНИЛ университета. Эксперименты были выполнены с соблюдением принципов гуманности в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минздрава СССР от 12.08.77). Суспензию клеток прививаемой карциносаркомы Walker-256 вводили в мышцу бедра в дозе 106 клеток, концентрация была выбрана в соответствии с рекомендациями [11]. Размеры опухоли измеряли штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях, и их перемножением определяли объем. Животных держали при фиксированном световом режиме (свет -темнота 12:12 с включением освещения в 8.00 и выключением в 20.00) и максимально стандартизированной окружающей температурой. Циклофосфан (Ц) вводился однократно из расчета 25 мг/кг внутрибрюшинно. Мелатонин (М)
- 0,3 мг/кг внутрибрюшинно в течение 14 суток. Разогревание крыс производилось однократно по «Способу экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных» [3] при погружении объекта исследования в горячую воду (45 °С) до уровня шеи до достижения ректальной температуры 43,5 °С (стадия теплового удара). Процедуру общей
управляемой гипертермии, введение циклофосфана и мелатонина начинали с 5х суток введения опухолевых клеток.
Экспериментальные животные были разбиты на контрольную (интактные крысы) и опытные (крысы с карциносаркомой Walker-256 в динамике и получавшие ОУГ, циклофосфан, мелатонин) группы. В каждой группе было 710 крыс. Для получения сыворотки крови их декапитировали под эфирным наркозом на 7-е и 14-е сутки экспериментальных исследований.
Содержание жирорастворимых антиоксидантов (ретинола и а-токоферола) в сыворотке крови определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [8].
Анализ данных вели на PC CPU Intel P-II 750 МГц Celeron в среде Windows по программе SPSS 16.0 и Microsoft Excel версии 1998. Тестирование параметров распределения проводилось с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. При работе с базой данных велось определение средних арифметических величин и стандартных ошибок средних арифметических (М ± m). Значимость различий средних арифметических ранжированных критериев при нормальном распределении оценивалась с помощью t - критерия Стьюдента. За достоверность различий принималось значение p < 0,05.
Результаты исследования. Рассматривая динамику содержания жирорастворимых антиоксидантов при опухолевой прогрессии следует отметить, что у крыс с карциносаркомой Walker-256 в крови уровень а-токоферола на 7-е и 14-е сутки эксперимента был на 57 и 60 % ниже, чем в контроле (p < 0,05). Аналогичная закономерность наблюдалась и для содержания ретинола, величина которого в крови крыс с карциносаркомой Walker-256 на 7-е и 14-е сутки эксперимента был на 45 и 38 % ниже, чем в контроле (p < 0,05).
Одним из перспективных направлений в противоопухолевой терапии сегодня является общая управляемая гипертермия (ОУГ) [2] . Влияние ОУГ на трансмембранный перенос и метаболизм может привести к преодолению лекарственной устойчивости и повышению иммуногенности опухоли [6]. Не являясь канцерогенным и мутагенным агентом, гипертермия может вызвать в опухоли как апоптоз, так и некроз [15], что весьма обнадеживающим представляется ее включение в схемы лечения.
На фоне применения ОУГ у крыс с карциносаркомой Walker-256 концентрация жирорастворимых антиоксидантов в сыворотке крови на протяжении всего эксперимента имела четкую тенденцию к снижению. Так, содержание а-токоферола на 7-е и 14-е сутки было в 3,3 и 3,7 раза, а ретинола в
1,3 и 2,1 раза ниже значений, определенных у интактных животных (p < 0,05). Причем уровень последнего антиоксиданта в крови у крыс с карциносаркомой Walker-256 при ОУГ на 14-е сутки был достоверно меньше, по сравнению с показателями у этих животных на 7-е сутки эксперимента (p < 0,05).
Применение циклофосфана у крыс с карциносаркомой Walker-256 также сопровождалось уменьшением содержания жирорастворимых антиоксидантов в крови. Так, на 7-е сутки эксперимента уровень а-токоферола и ретинола был ниже величин в контроле на 49 и 43 % соответственно (p < 0,05). На 14-е сутки эксперимента низкое содержание жирорастворимых антиоксидантов в крови сохранялось, что может быть связано не только с особенностями опухолевого роста, но и действием циклофосфана в организме. Известно, что метаболиты циклофосфана индуцируют перекисное окисление липидов, продукты которого нарушают структуру и функции мембран, что, в свою очередь, способствует ускоренному расходованию антиоксидантов в свободнорадикальных реакциях [9]. Поэтому обоснованным является дополнительное использование в полихимиотерапии опухолей соединений, в частности мелатонина, обладающих антиоксидантным действием. Обнаружено, что мелатонин является более эффективным ингибитором гидроксильного (*ОН) и пероксильного (ROO*) радикалов, чем глютатион и витамин Е. Он и его метаболиты (6-гидроксимелатонин) беспрепятственно проникают в клетки и защищают нуклеиновые кислоты, липиды и белки от повреждения свободными радикалами. Выявлено также, что мелатонин может ингибировать NO-синтетазу и усиливать экспрессию генов, ответственных за синтез Cu-Zn-зависимой СОД
[7].
Использование мелатонина у крыс с карциносаркомой Walker-256 приводило к сохранению на относительно высоком уровне жирорастворимых антиоксидантов в крови к 7-м и 14-м суткам эксперимента. Аналогичная закономерность наблюдалась для содержания а-токоферола в крови животных и при сочетанном использовании в терапии циклофосфана и мелатонина. Хотя со стороны содержания ретинола наблюдалось уменьшение его концентрации в крови как на 7-е, так и 14-е сутки эксперимента (p < 0,05).
Сходная закономерность в отношении изменения содержания
жирорастворимых антиоксидантов в крови животных на протяжении всего опыта наблюдалась у крыс с карциносаркомой Walker-256, получавших ОУГ, циклофосфан и мелатонин. Так, уровень а-токоферола на 7-е и 14-е сутки был на 35 и 66 %, а ретинола на 31 и 29 % ниже, чем животных контрольной группы (p < 0,05). Причем содержание а-токоферола в крови крыс с карциносаркомой Walker-256, получавших ОУГ, циклофосфан и мелатонин, на 14-е сутки было достоверно ниже, по сравнению с показателями на 7-е сутки эксперимента (p <
0,05).
Заключение. Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что используемые в проведенных исследованиях методики противоопухолевой терапии оказывают различное влияние на динамику содержания
жирорастворимых антиоксидантов в организме экспериментальных животных. Если использование ОУГ и циклофосфана сопровождается снижением уровней а-токоферола и ретинола в крови крыс с карциносаркомой Walker-256, то
добавление мелатонина к лечению сохраняет их содержание. Следовательно, одним из перспективных путей повышения эффективности лечения злокачественных новообразований может быть сохранение высокой активности антиоксидантной регуляторной системы во внеопухолевых клетках и тканях.
Список литературы
1. Букин Ю. В. Молекулярно-биологические механизмы гастроканцерогенеза и подходы к профилактике рака желудка / Ю. В. Букин, В. А. Драудин-Крыленко // Успехи биол. химии. - 2000. - Т. 40.
- С. 329-356.
2. Гипертермия и гипергликемия в онкологии / Э. А. Жаврид, С. П. Осинский, С. З. Фрадкин. - Киев : Наук. думка, 1997. - 256 с
3. Ефремов А. В., Пахомова Ю. В., Пахомов Е. А., Ибрагимов Р. Ш. [и др.] Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных. - Патент РФ № 2165105. - Бюл. № 10.
- 2001.
4. Ефремов А. В. Изменение активности перекисного окисления липидов у животных с карциносаркомой Walker-256 под влиянием различных методов лечения / А. В. Ефремов [и др.] // Вестн. новых мед. технологий. - 2008. - Т. XV, № 3. - С. 22-24.
5. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов / Н. М. Эммануэль. - М. : Наука, 1977. - 419 с.
6. Курпешов О. К. Механизмы развития и пути преодоления химиорезистентности опухолей / О. К. Курпешов [и др.] // Рос. онкол. журн. - 2003. - № 3. - С. 50-53.
7. Мелатонин в физиологии и патологии желудочно-кишечного тракта / В. Н. Анисимов [и др.]. - М., 2000.
8. Микичур Н. И. Микрометод определения различных форм токоферола для оценки компенсаторных и патологических состояний организма / Н. И. Микичур, И. Д. Сафронов // Проблемы оценки и прогнозирования функциональных состояний организма в прикладной физиологии. -Фрунзе, 1988. - С. 238-240.
9. Окислительный стресс : патологические состояния и заболевания / Е. Б. Меньщикова [и др.]. - Новосибирск : АРТА, 2008. - 284 с.
10. Пальмина Н. П. Влияние альфа-токоферола в широком спектре концентраций (10-2 - 10-17 М) на активность протеинкиназы С. Связь с пролиферацией и опухолевым ростом / Н. П. Пальмина [и др.] // Биохимия. - 1994. - Т. 59, вып. 2. - С. 193-200.
11.Хегай И. И. Влияние экспрессии гена вазопрессина на рост карциносаркомы Walker 256 у крыс / И. П. Хегай, Н. А. Попова, Л. Н. Иванова // Генетика. - 2000. - Т. 42, № 7. - С. 993-995.
12. Эритроциты и злокачественные новообразования / В. В. Новицкий [и др.]. - Томск, 2000. - 288 с.
13.Clement S. The effect of alpha-tocopherol on the synthesis, phosphorylation and activity of protein kinase C in smooth muscle cells after phorbol 12-myristate 13-acetate down-regulation / S. Clement [et al.] // Eur. J. Biochem.
- 1997. - Vol. 246. - Р. 745-9.
14.Weber T. Vitamin E succinate is a potent novel anti-neoplastic agent with high selectivity and cooperativity with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (Apo2 ligand) in vivo / Т. Weber [et al.] // Clin. Cancer. Res. - 2001. - Vol. 8. - Р. 863-869.
15.Yonezawa M. Hyperthermia induced apoptosis in malignant fibrous histiocytoma cell in vitro / М. Yonezawa [et al.] // International J. of Cancer.
- 1996. - Vol. 66. - 347-351.
