CC BY
67
№ 1 - 2013 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки
УДК 616-006-092:612.57
АПОПТОЗМОДУЛИРУЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ ОБЩЕЙ ГИПЕРТЕРМИИ ПРИ ПЕРЕВИВАЕМОМ ОПУХОЛЕВОМ ПРОЦЕССЕ У ЖИВОТНЫХ
А. В. Ефремов1, И. Д. Сафронов12, Е. В. Овсянко1, М. Е. Тулеутаев1, Д. Л. Колодин1,
Я. У. Овсянко1, Ю. В. Пахомова1
1ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава
России (г. Новосибирск)
2ФБГУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» СО РАМН
(г. Новосибирск)
В работе изучены показатели активности процесса апоптоза у крыс с карциносаркомой Walker-256 при воздействии общей гипертермии (43,5 °С). Полученные данные свидетельствуют, что при воздействии общей гипертермии у крыс с карциносаркомой Walker-256 наблюдается индукция апоптоза клеток опухолевой ткани, что подтверждается ростом уровней экспрессии промоторов апоптоза Bax и Bad. Можно заключить, что общая гипертермия оказывает апоптозмодулирующее влияние на жизненный цикл клеток злокачественной опухоли.
Ключевые слова: карциносаркома Walker-256, апоптоз, общая гипертермия.
Ефремов Анатолий Васильевич — член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 225-39-78, е-mail: [email protected]
Сафронов Игорь Дмитриевич — доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», ведущий научный сотрудник ФБГУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины», рабочий телефон: 8 (383) 225-39-78, e-mail: [email protected]
Овсянко Елена Владимировна — доктор медицинских наук, доцент кафедры анатомии человека ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 225-15-24, e-mail: [email protected]
Тулеутаев Мухтар Есенжанович — кандидат медицинских наук, соискатель кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», телефон контактный: 8 (383) 225-39-78
Колодин Дмитрий Леонидович — заочный аспирант кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», контактный телефон: 8 (383) 225-39-78
Овсянко Яхид Умеровна — кандидат медицинских наук, ассистент кафедры анатомии человека ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 225-15-24, e-mail: [email protected]
Пахомова Юлия Вячеславовна — доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 225-39-78, e-mail: [email protected]
Введение. В настоящее время изучение механизмов регуляции апоптоза становится одной из важнейших задач медицинской науки. Запрограммированная гибель клеток играет важную роль в формировании и функционировании многоклеточного организма. Патогенез целого ряда заболеваний, в том числе и опухолевых, связан с потерей нормального контроля организма над апоптозом [1]. Установлено, что в нарушениях регуляции апоптоза, приводящих к прогрессированию опухолевых заболеваний, одно из центральных мест отводят экспрессии и функциональной активности белков семейства Bcl-2, которые принимают участие в реализации внутреннего (митохондриального) пути апоптоза [9]. Белки семейства Bcl-2 подразделяют на проапоптотические (Вах, Bad) и антиапоптотические (Bcl-2, Bcl-X1), биологическая роль этих белков до сих пор точно не установлена. Хотя обнаружено, что они принимают участие в формировании ионопроводяших пор в мембране митохондрий, образуя для этого ди- и олигомеры. Интерес к механизмам регуляции процессов пролиферации и апоптоза клеточных структур организма связан не только с углубленным изучением патогенеза злокачественных заболеваний, но и с поиском новых технологий коррекции нарушений программ клеточного деления и дифференцировки.
Одним из перспективных направлений в противоопухолевой терапии сегодня является общая гипертермия (ОГ) [3]. Влияние ОГ на метаболизм может привести к преодолению лекарственной устойчивости и повышению иммуногенности опухоли, а также вызвать в опухоли апоптоз [4]. Поэтому представляется целесообразным провести исследование особенностей изменения выраженности процесса апоптоза на этапах опухолевого роста при воздействии ОГ.
Целью настоящего исследования явилось изучение уровня экспрессии белков семейства Bcl-2 у крыс с карциносаркомой Walker-256 при воздействии ОГ.
Материалы и методы исследования. В эксперименте использовали 28 крыс-самцов Вистар массой 180-200 г. Работу с животными проводили согласно директивам Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации. Использовали перевиваемый штамм опухоли Walker-256, поддерживаемый in vivo в лаборатории физиологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН. Суспензию клеток карциносаркомы Walker-256 вводили животным в мышцу бедра (106 клеток в 0,1 мл изотонического раствора NaCl). Через 5 суток после перевивания опухоли животных разделили на две группы: контрольная (n = 7) — со «спонтанным развитием опухоли»; опытная (n = 21) — при воздействии ОГ. Используемый способ моделирования ОГ у мелких лабораторных животных [5] предполагает разогревание объекта исследования
в резервуаре универсального водного термостата BWT-U, предназначенного для точного поддержания установленной температуры в диапазоне от 25 до 100 °С. Уровень ОГ, при котором прекращали разогрев животных, определялся ректальной температурой 43,5 °С (стадия теплового удара). Время разогревания каждого животного было индивидуальным, не зависело от исходной температуры тела, массы и составляло не более 17 мин.
Образцы опухолевой ткани для иммуногистохимического исследования брали у животных контрольной группы на 5-е сутки после перевивания опухоли; у крыс опытной группы — через 7 и 14 суток после проведения ОГ.
Исследование уровня экспрессии белков семейства Bcl-2 выполняли на парафиновых срезах с помощью непрямого стрептавидин-авидинового метода [6]. Для выявления Вс1-2 и Bad в качестве первичных использовали мышиные моноклональные антитела (BD Biosciences) в разведении 1:100. Для выявления Вах применяли кроличьи поликлональные антитела к домену, играющему важную роль в образовании гомо-и гетеродимеров с антиапоптотическими членами семейства Bcl-2 (BD Biosciences). Срезы докрашивали гематоксилином и эозином. О специфическом связывании антител с исследуемыми антигенами свидетельствовало выявляемое дисперсное мелкогранулярное окрашивание цитоплазмы клеток. Выраженность экспрессии антигенов в клетках опухолевой ткани анализировали по интенсивности иммуногистохимического окрашивания, оценку которого осуществляли с помощью программы «Axio Vision 4.7.1» (Carl Zeiss) и блока автоматических измерений (Auto measure). В программу вычислений вводили значение процента площади позитивно окрашиваемых опухолевых элементов.
Полученные количественные данные обрабатывали с использованием методов статистики [2], уровень значимости различий средних величин оценивали на основании t-критерия Стьюдента для уровня достоверности 95 % (р < 0,05).
Результаты и их обсуждение. Рассматривая характер изменения уровня экспрессии белков семейства Bcl-2 у крыс с карциносаркомой Walker-256 при воздействии ОГ, следует отметить (см. табл.), что в контрольной группе (со спонтанным развитием опухоли) не было выявлено достоверных различий между величинами показателей Bcl-2 и Вах. В то же время уровень экспрессии Bad был значимо выше соответствующих величин показателей Bcl-2 и Вах в 1,6 и 1,7 раза соответственно (р < 0,05). Известно, что один из механизмов апоптотической гибели клеток связан с изменением степени фосфорилирования/дефосфорилирования белка-индуктора Bad, поскольку при дефосфорилировании образуются гетеродимеры Bcl -2/Bad, и запускается апоптоз. Возможно, это являете фактором, сдерживающим рост опухоли на ранних стадиях развития, так как установлено, что в молодых опухолях на ранних стадиях происходит активация апоптоза, но с увеличением массы опухоли активность гибели клеток резко падает и сохраняется на относительно стабильном уровне [7].
Уровень экспрессии белков семейства Bcl-2 в опухолевой ткани у крыс с карциносаркомой Walker-256 при воздействии ОГ (M ± m)
Г руппы Bcl-2, % Bax, % Bad, %
Контрольная 19,9 ± 1,52 19,1 ± 2,05 ,81 -н ,6 2, СП
Опытная, 7-е сутки 13,1 ± 1,48 71,5 ± 4,49 68,1 ± 3,58
Опытная, 14-е сутки 8,91 ± 1,41 33,5 ± 1,59 70,6 ± 1,59
Примечание: * — достоверность различий p < 0,05 по сравнению с контрольной группой
Дальнейший анализ результатов показал, что при воздействии ОГ возрастает уровень экспрессии промоторов апоптоза Bax и Bad (см. табл.). Обнаружено, что показатели экспрессии Bad в опухолевой ткани у крыс с карциносаркомой Walker-256 на 7-е и 14-е сутки эксперимента были значимо выше в 2,1 и 2,2 раза соответственно по сравнению с животными контрольной группы (p < 0,05). Экспрессия уровня белка Вах была также выше соответствующего показателя контроля, в большей степени на 7-е сутки, в 3,7 и 1,7 раза соответственно (p < 0,05). Высвобождение этих белков происходит при повышении проницаемости мембран митохондрий под контролем белков семейства Bcl-2/Bax, которые непрерывно взаимодействуют друг с другом, находясь в динамическом равновесии между гомо- и гетеродимерами [8]. Важно отметить, что уровень экспрессии Вс1-2 у крыс с карциносаркомой Walker-256 при воздействии ОГ на 7-е и 14-е сутки эксперимента был достоверно ниже показателей контроля в 1,5 и 2,2 раза соответственно (Р < 0,05).
Заключение. Полученные в настоящем исследовании данные позволяют заключить, что при воздействии ОГ у крыс с карциносаркомой Walker-256 наблюдается апоптозмодулирующий эффект, индуцирующий запрограммированную гибель клеток опухолевой ткани. Следовательно, одним из путей повышения эффективности противоопухолевой терапии может быть включение в комплексные лечебные мероприятия ОГ, являющейся важным моментом в запуске апоптоза злокачественной опухоли.
Список литературы
1. Белушина Н. Н. Молекулярные основы патологии апоптоза / Н. Н. Белушина, С. Е. Северин // Арх. патологии. — 2001. — № 1. — С. 51-59.
2. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. — М., 1999.
3. Жаврид Э. А. Гипертермия и гипергликемия в онкологии / Э. А. Жаврид, С. П. Осинский, С. З. Фрадкин. — Киев : Наук. думка, 1997. — 256 с.
4. Механизмы развития и пути преодоления химиорезистентности опухолей / О. К. Курпешов, А. Ф. Цыб, Ю. С. Мардынский, Б. А. Бердов // Рос. онкол. журн. — 2003. — № 3. — С. 50-53.
5. Пат. 2165105 Российская Федерация. Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных / Ефремов А. В., Пахомова Ю. В., Пахомов Е. А. и др. Опуб. 2001. Бюл. № 10.
6. Эллиниди В. Н. Практическая иммуногистохимия : методич. рекомендации / В. Н. Эллиниди, Н. В. Аникиев, Н. А. Максимов. — СПб., 2002.
7. Bowen I. D. Programmed cell death in tumours and tissues / I. D. Bowen, S. M. Bowen.
— London : Champman and hall, 1990.
8. Chinaiyn A. M. Molecular ordering of the cell death pathway — Bcl-2 and Bcl-X(L) function upstream of the CED-3-like apoptotic proteases / А. М. Chinaiyn // J. Biol. Chem. — 1996. — Vol. 271. — Р. 4573-4576.
9. Mutational inactivation of the proapoptotic gene Bax confers selective advantage during tumor clonal evolution / Y. M. Ionov, H. Yamamoto, S. Krajewski [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2000. — Vol. 97, N. 20. — P. 10872-10877.
APOPTOSIS MODULATING INFLUENCE OF GENERAL HYPERTHERMIA AT TRANSFERED TUMORAL PROCESS AT ANIMALS
А. V. Efremov1, I. D. Safronov1,2, E. V. Ovsyanko1, №^. Е. Tuleytaev1, D. L. Kolodin1,
Y. Y. Ovsyanko1, J. V. Pakhomova1
1SEIHPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment» (Novosibirsk c.) FSBE «Scientific Center of clinical and experimental medicine SB RAMS» (Novosibirsk c.)
Indicators of activity of apoptosis process at rats with Walker 256 carcinosarcoma are studied in the work at influence of general hyperthermia (43,5 °C). The obtained data testify that the induction of apoptosis cells of tumoral fabric is observed at influence of general hyperthermia at rats with Walker 256 carcinosarcoma. It is confirmed by growth of expression levels of promotors apoptosis Bax and Bad.It can be concluded that the general hyperthermia has apoptosis modulating impact on life cycle of malignant tumor cells.
Keywords: Walker 256 carcinosarcoma, apoptosis, general hyperthermia.
About authors:
Efremov Anatoly Vasilevich — Corresponding member of the RAMS, doctor of medical sciences, professor,head of pathological physiology and clinical pathophysiology chair at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment»,work phone: 8 (383) 225-39-78, e-mail: [email protected]
Safronov Igor Dmitrievich — doctor of medical sciences, professor of pathological physiology and clinical physiology chair at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment», leading research scientist at FSBE «Scientific Center of clinical and experimental medicine SB RAMS», contact phone: 3(383) 225-39-78, e-mail:
Ovsyanko Elena Vladimirovna — doctor of medical sciences, assistant professor of anatomy histology and biology chair at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», work phone: 8 (383) 225-15-24, e-mail: [email protected]
Tuleutayev Mukhtar Esenzhanovich — candidate of medical sciences, degree-seeking student of pathological physiology and clinical pathophysiology chair at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», contact phone: 8 (383) 225-39-78
Kolodin Dmitry Leonidovich — correspondence post-graduate student of of pathological physiology and clinical pathophysiology chair at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», contact phone: 8 (383) 225-39-78
Ovsyanko Yakhid Umerovna — candidate of medical sciences, assistant of human anatomy chair at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», office phone: 8 (383) 225-15-24, email: [email protected]
Pakhomova Julia Vyacheslavovna — doctor of medical sciences, professor of pathological physiology and clinical pathophysiology chair at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», work phone: (383 225-39-78), e-mail: [email protected]
List of the Literature:
1. Belushina N. N. Molecular bases of pathology of apoptosis / N. N. Belushina, S. E. Severin // Arch. of pathologies. — 2001 . — № 1. — P. 51-59.
2. Glants S. Medicobiological statistics / S. Glants. — M, 1999.
3. Zhavrid E. A. Hyperthermia and hyperglycemia in oncology / E. A. Zhavrid, S. P. Osinsky, S. Z. Fradkin. — Kiev: Sciences, 1997. — 256 P.
4. Mechanisms of development and way of overcoming for chemoresistance of tumors / O. K. Kurpeshov, A. F. Tsyb, Y. S. Mardynsky, B. A. Berdov // Rus. oncol. journ. — 2003. — № 3. — P. 50-53.
5. Patent. 2165105 The Russian Federation. Way of experimental modeling of the general hyperthermia at small laboratory Animals / Efremov A. V., Pakhomova Y. V., Pakhomov E. A. etc. Publ. 2001. Bulletin № 10.
6. Ellinidi V. N. Practical immunohistochemistry: method. recommendation / V. N. Ellinidi, N. V. Anikiyev, N. A. Maksimov. — SPb. 2002.
7. Bowen I. D. Programmed cell death in tumours and tissues / I. D. Bowen, S. M. Bowen.
— London : Champman and hall, 1990.
8. Chinaiyn A. M. Molecular ordering of the cell death pathway — Bcl-2 and Bcl-X(L) function upstream of the CED-3-like apoptotic proteases / A. M. Chinaiyn // J. Biol. Chem. — 1996. — Vol. 271. — P. 4573-4576.
9. Mutational inactivation of the proapoptotic gene Bax confers selective advantage during tumor clonal evolution / Y. M. Ionov, H. Yamamoto, S. Krajewski [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2000. — Vol. 97, N. 20. — P. 10872-10877.
