CC BY
43
№ 1 - 2011 г. 14.00.00 медицинские науки
УДК 616-006.68:612.57-091.818]-092.9
ПРОГРАММИРУЕМАЯ КЛЕТОЧНАЯ ГИБЕЛЬ ПРИ ОБЩЕЙ ГИПЕРТЕМИИ У КРЫС С КАРЦИНОСАРКОМОЙ WALKER 256
А.В. Ефремов1, Е. В. Овсянко1, П.М. Ларионов2, Ю.В. Пахомова1, Я.У. Овсянко1
1ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет»
(г. Новосибирск)
2
ГУ «Новосибирский НИИ патологии кровообращения им. академика Е.Н. Мешалкина
Ростмедтехнологии» (г. Новосибирск)
Проведено иммуногистохимическое исследование уровня экспрессии белков семейства Bcl-2 (Bcl-2, Bax и Bad) в клетках карциносаркомы Walker 256, имплантированных в мышцу бедра в дозе 1 х 106 клеток крысам-самцам линии Wistar при воздействии общей гипертермией. Полученные данные свидетельствуют о том, что одним из решающих моментов в запуске апоптоза клеток карциносаркомы Walker 256 является гетеродимеризация белков семейства Bcl-2. При воздействии общей гипертермии наблюдалась выраженная индукция апоптоза.
Ключевые слова: карциносаркома Walker 256, апоптоз, Bcl-2, Bax, Bad, общая гипертермия
Ефремов Анатолий Васильевич - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заведующий кафедрой патологической физиологии и клинической патофизиологии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», телефон рабочий: 8 (383) 225-39-78
Овсянко Елена Владимировна - кандидат медицинских наук, доцент кафедры анатомии, гистологии и биологии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: Vin [email protected]
Ларионов Петр Михайлович - доктор медицинских наук, профессор ГУ «Новосибирский НИИ патологии кровообращения им. академика Е.Н. Мешалкина Ростмедтехнологии», e-mail: Vin [email protected]
Пахомова Юлия Вячеславовна - доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», телефон рабочий: (383) 225-39-78
Овсянко Ясит Умеровна - кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры анатомии человека ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», телефон рабочий: 8 (383) 225-15-24
Введение. Одним из механизмов развития опухолевого роста является нарушение равновесия между процессами пролиферации клеток и апоптозом. В повреждении регуляции апоптоза, приводящем к развитию опухолевых заболеваний, одно из центральных мест связано с экспрессией одного из основных звеньев в регуляции программированной гибели клетки - белков семейства Bcl-2. Эти белки играют важную роль в регуляции внутреннего (митохондриального) пути апоптоза. К ним относятся как индукторы, так и ингибиторы апоптоза. В настоящей работе изучена методом иммуногистохимии экспрессия генов белков семейства Bcl-2 в опухолевой ткани у крыс линии Wistar с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 в динамике после воздействия общей гипертермией.
Материал и методы исследования. В эксперименте использовали крыс-самцов линии Wistar массой 180-200 г. Использовали перевиваемый штамм опухоли Walker 256, поддерживаемый in vivo (лаборатория физиологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). Суспензию клеток перевиваемой карциносаркомы Walker 256 вводили животным в мышцу бедра в дозе 1 х 106 клеток в 0,1 мл изотонического раствора NaCl. Через 5 суток с момента перевивки опухоли животных разделяли на 2 группы: 1-я группа - контроль со «спонтанным» развитием опухоли (n = 7); 2-я группа - при воздействии общей гипертермией (ОГ) (n = 14). ОГ животных производилась в полном соответствии со «Способом экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных» [1]. Уровень ОГ, при котором прекращали разогрев, определялся ректальной температурой 43,5 °С (стадия теплового удара). Опухолевую ткань для иммуногистохимического исследования брали в следующие сроки: 1-й группы - после 5-х суток с момента перевивки опухоли; 2-й - на 7е и 14-е сутки с момента прогревания животных. Иммуногистохимическое исследование уровня экспрессии белков семейства Bcl-2 выполняли на парафиновых срезах опухолевой ткани толщиной до 5 мкм с помощью непрямого стрептавидин-авидинового метода [3]. Использовали антитела Bax (поликлональный) к домену, играющему важную роль в образовании гомо- и гетеродимеров с антиапоптотическими членами семейства Bcl-2, а также к Bcl-2 и Ваd (моноклональные). Морфометрическое исследование изучали на фотографических снимках, сделанных при помощи моторизованного микроскопа M200 (Zeiss) и камерой AxioCam HRc (Zeiss) с конечным увеличением *630. Подсчет осуществляли с помощью компьютерной программы Axio Vision - Release 4.7.1. (Zeiss). Полученные в экспериментах цифровые данные обрабатывали с использованием общепринятых методов статистики, вычисляя среднюю арифметическую величину (М), ошибку репрезентативности средней величины (m) и уровень значимости различий средних величин (р) на основании t - критерия Стьюдента для уровня достоверности 95 % (Р < 0,05).
Результаты исследования и их обсуждение
Полученные результаты представлены в таблице.
Величины показателей уровня экспрессии белков семейства Bcl-2 у крыс линии Wistar с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 при воздействии общей
гипертермией (M ± m)
Группы Сутки Bcl-2, % Bax, % Bad, %
1 группа 5-е 19,86 ± 1,52 19,13 ± 2,05 32,59 ± 1,81
2 группа, ОГ 7-е 13,06 ± 1,48 * 71,52 ± 4,49 * 68,06 ± 3,58 *
14-е 8,91 ± 1,41* 33,47 ± 1,59 * 70,58 ± 1,95 *
Примечание: 1-я группа - контроль со «спонтанным» развитием опухоли; 2-я группа - при воздействии общей гипертермией (ОГ); * - р < 0,05 по сравнению с показателями в контрольной группе со «спонтанным» развитием опухоли
При сравнительной оценке экспрессии белков семейства Bcl-2 при «спонтанном» развитии опухоли не было выявлено достоверных различий между величинами показателей Bcl-2 и Bax. Уровень показателя экспрессии Bad был достоверно выше соответствующих величин показателей Bcl-2 и Bax в 1,64 и 1,7 раза соответственно. Один из механизмов апоптоза связан с изменением степени
фосфорилирования/дефосфорилирования белка-индуктора Bad. Bad дефосфорилируется, образуются гетеродимеры Bcl-2/Bad, и запускается процесс апоптоза за счет высвобождения митохондриальных факторов, при этом в конечном итоге происходит активация каспазы-9. Возможно, апоптоз является фактором, сдерживающий рост опухоли на ранних стадиях развития. По наблюдениям I. D. Bowen, S. M. Bowen [4] в молодых опухолях на начальных стадиях развития происходит активация апоптоза, но с увеличением массы опухоли апоптоз резко падает и сохраняется на относительно стабильном уровне.
При воздействии ОГ на протяжении всего эксперимента резко возрастал уровень экспрессии промоторов апоптоза Bax и Bad, инициирующих программируемую клеточную смерть в присутствии ингибиторов каспаз. Выявлено, что показатель уровня экспрессии Bad как на 7-е, так и на 14-е сутки эксперимента был выше уровня величины того же показателя группы контрольных животных со «спонтанным» развитием опухоли в 2,08 и 2,16 раза соответственно.
Экспрессия уровня проапоптогенного белка Bax была также выше соответствующего показателя уровня контроля в большей степени на 7-е сутки в 3,74 и 1,74 раза соответственно. Высвобождение этих белков происходит при повышении проницаемости мембран митохондрий под контролем белков семейства Bcl-2/Bax. Отношение Bcl-2 и Bax находится в состоянии постоянного динамического равновесия, образуя гомо- и гетеродимеры, что завершается апоптозом клетки [5]. Ранее нами было обнаружено при воздействии ОГ на крыс линии Wistar с перевиваемой карциносаркомой Walker 256 повышенное на 14-е сутки содержание ТБК-активных продуктов, уровня диеновых конъюгатов, а также увеличение активности лизосомных ферментов (арилсульфатазы А- и №ацетил-В^-глюкозаминидазы) в сыворотке крови, свидетельствующие о стимуляции окислительного стресса, индуцирующие гибель клеток Walker 256 путем апоптоза [2]. Важно отметить, что уровень экспрессии протоонкогена Bcl-2 при воздействии ОГ на протяжение всего эксперимента достоверно ниже соответствующего показателя контроля у животных со «спонтанным» развитием опухоли в большей степени на 14-е сутки эксперимента в 1,52 и 2,23 раза соответственно.
Заключение. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что члены семейства белков Bcl-2 непрерывно взаимодействуют друг с другом, находясь в динамическом равновесии между гомо- и гетеродимерами. Показано, что решающим моментом в запуске апоптоза карциносаркомы выраженная индукция апоптоза наблюдалась при воздействии общей гипертермии.
Список литературы
1. Ефремов А. В., Пахомова Ю. В., Пахомов Е. А. и др. Патент 2165105 Российская Федерация. Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных / опубл. 2001. Бюл. № 10.
2. Пупышев А. Б., Федина Р. Г., Мичурина С. В., Овсянко Е. В. [и др.] // Вопр. онкологии. - 2009. - Т. 55, № 2. - С. 221-223.
3. Эллиниди В. Н. Практическая иммуногистохимия : методич. рекомендации / В.
Н. Эллиниди, Н. В. Аникиева, Н. А. Максимова. - Спб., 2002. - 36 с.
4. Bowen I. D. Programmed cell death in tumours and tissues / I. D. Bowen, S. M. Bowen. - London : Champman and hall, 1990.
5. Chinaiyan A. M. Molecular ordering of the cell death pathway - Bcl-2 and Bcl-X(L) function upstream of the CED-3-like apoptotic proteases / А. М. Chinaiyan // J. Biol. Chem. -1996. - Vol. 271. - P. 4573-4576.
PROGRAMMED CELL DECAY IN GENERAL HYPERTHERMIC RATS WITH CARCINO - SARCOMA WALKER 256
A.V. Efremov1, E.V. Ovsyanko1, P.M. Larionov2, Y.V. Pakhomova1, Y.U. Ovsyanko1 1SEIHPE «Novosibirsk State Medical University»
2
SI «Novosibirsk SRI of Blood Circulation Pathology named after academician E.N. Meshalkin Rosmedtechnology» (c. Novosibirsk)
The Bcl-2 ( Bcl-2, Bax and Bad) proteins‘ expression level immunehistochemical research is carried out in carcino-sarcoma cells Walker 256, implanted into Wistar mail-rats muscular thigh cells in the dosage of 1 x 10'6, under general hyperthermia. The given data observe the Bcl-2 proteins heterodimerization being one of the decisive moments in Walker 256 carcino- sarcoma cells start of apopthosis. The marked apopthosis induction was observed under general hyperthermia.
Keywords: carcino-sarcoma Walker 256, apopthosis, Bcl-2 Bcl-2, Bax, Bad, general hyperthermia
About authors:
Efremov Anatoliy Vasilyevich - doctor of medical sciences, professor, correspondent member RAMS, head of pathological physiology and clinical pathophysiology department SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», office telephone 8(383) 225-39-78
Ovsyanko Elena Vladimirovna - medical sciences candidate, assistant professor at anatomy, histology and biology department SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», e-mail: [email protected]
Larionov Petr Mikhailovich - doctor of medical sciences, professor SI «Novosibirsk SRI of Blood Circulation Pathology named after E.N. Meshalkin Rosmedtechnology», e-mail: [email protected]
Pakhomova Yulia Viacheslavovna - doctor of medical sciences, professor at pathological physiology and clinical pathophysiology department SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», office telephone 8(383) 225-39-78
Ovsyanko Yasit Umerovna - medical sciences candidate, senior teacher at human anatomy department SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», office telephone: 8(383) 225-1524
List of the Literature:
1. Efremov A.V., Pakhomova Y.V., Pakhomov E.A. [et. al]. Licence 21651G5 of Russian Federation. Experimental modeling way of general hyperthermia in little laboratory animals / published in 2GG1. Bulletin № 10.
2. Pupyshev A.B., Fedina R.G., Michurina S.V., Ovsyanko E.V. [et.al] // Oncology Questions. - 2GG9. - V. 55, № 2. P. 221-223.
3. Ellinidy V.N. Practical immunehistochemistry: methodical recommendations / V.N. Ellinidy, N.V. Anikieva, N.A. Maksimova. - Spb., 2GG2. - 36p.
4. Bowen I. D. Programmed cell death in tumours and tissues / I. D. Bowen, S. M. Bowen. - London : Champman and hall, 199G.
5. Chinaiyan A. M. Molecular ordering of the cell death pathway - Bcl-2 and Bcl-X(L) function upstream of the CED-3-like apoptotic proteases / А. М. Chinaiyan // J. Biol. Chem. - 1996. - Vol. 271. - P. 4573-4576.
