CC BY
26
© Дагиль Ю.А., Пащенков М.В., 2020 Дагиль Ю.А., Пащенков М.В.
Сопоставление трех видов клеточных тест-систем для оценки биологической активности агонистов рецептора NOD2
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Агонисты рецептора NOD2 представляют собой перспективный класс активаторов врожденного иммунитета. Актуально создание тест-систем для качественного и количественного определения их биологической активности.
Цель работы - сопоставить основные характеристики трех видов репортерных клеток, предназначенных для оценки биологической активности агонистов NOD2: с эндогенной экспрессией NOD2, с временной гиперэкспрессией NOD2 и со стабильной гиперэкспрессией NOD2.
Материал и методы. Репортерные клетки с эндогенной экспрессией NOD2 (293Luc) были получены путем стабильной трансфекции клеток HEK-293T геном люциферазы под контролем NF-кВ-зависимого промотора. Клетки с временной гиперэкспрессией NOD2 (293Luc-tNOD2) получали путем временной трансфекции клеток 293Luc плазмидой, кодирующей ген NOD2 под конститутивным промотором. При длительном культивировании NOD2-трансфицированных клеток с селективным антибиотиком были получены клетки, стабильно гиперэкспрессирующие NOD2 (293Luc-stNOD2). Для каждого вида клеток были получены контрольные клетки, позволяющие подтверждать активацию NF-кВ через рецептор NOD2. Эти клетки стимулировали 24 ч агонистом NOD2 - мурамилдипептидом (МДП); на выходе измеряли люциферин-зависимую хемилюминесценцию клеточных лизатов.
Результаты. Фоновый сигнал у клеток 293Luc-tNOD2 и 293Luc-stNOD2 был повышен соответственно в 30 и в 170 раз по сравнению с клетками 293Luc, что указывает на активацию NF-кВ в отсутствие агониста. В то же время предел количественного определения МДП в среде у клеток 293Luc-stNOD2 был на порядок меньше, чем у 293Luc (1,6 и 20 нМ соответственно). У систем с использованием клеток 293Luc и 293Luc-stNOD2 отмечались приемлемые значения правильности и повторяемости, тогда как клетки 293Luc-tNOD2 характеризовались неудовлетворительной повторяемостью, а также требовали повышенного расхода реактивов и рабочего времени.
Заключение. Клеточные линии 293Luc и 293Luc-stNOD2 могут использоваться для определения биологической активности агонистов рецептора NOD2.
Ключевые слова: NOD2; мурамилдипептид; NF-кВ; люцифераза; врожденный иммунитет
Статья поступила 15.05.2020. Принята в печать 16.06.2020.
Для цитирования: Дагиль Ю.А., Пащенков М.В. Сопоставление трех видов клеточных тест-систем для оценки биологической активности агонистов рецептора NOD2. Иммунология. 2020; 41 (4): 304—311. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-4-304-311
Финансирование. Работа выполнена в рамках госзадания «Изучение подходов к созданию иммунотропных препаратов» (шифр: Подход-16), соглашения № 388-00049-16 от 25.01.2016, 388-03-108 от 30.01.2017, 388-032018-179 от 1.02.2018, 388-03-2019-110 от 8.02.2019, 388-02-2020-008 от 15.01.2020.
Для корреспонденции
Пащенков Михаил Владимирович -доктор медицинских наук, и.о. заведующего лабораторией клинической иммунологии, ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: mvpashenkov@yandex.ru https//orcid.org/0000-0002-6995-1790
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Dagil Yu.A., Pashenkov M.V.
A comparison of three types of cell-based test systems for the assessment of biological activity of NOD2 receptor agonists
National Research Center Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency of Russia, 115522, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. NOD2 receptor agonists are a promising class of activators of innate immunity. Test systems for qualitative and quantitative measurements of their biological activity are required.
Aim - to compare main characteristics of three reporter cell types devised to assess biological activity of NOD2 agonists: cells with endogenous NOD2 expression, with transient NOD2 overexpression, with stable NOD2 overexpression.
Material and methods. Reporter cells with endogenous NOD2 expression (293Luc) were obtained by stably transfecting HEK-293T cells with luciferase reporter gene under an NF-KB-dependent promoter. Cells with transient NOD2 overexpression (293Luc-tNOD2) were obtained by transiently transfecting 293Luc cells with a plasmid encoding NOD2 gene under a constitutive promoter. Cells with stable NOD2 overexpression (293Luc-stNOD2) were obtained by prolonged culture of NOD2-transfected cells with selective antibiotic. For each cell type, control cells were created enabling to confirm NOD2-dependent NF-kB activation. Cells were stimulated for 24 h with a NOD2 agonist, muramyl dipeptide (MDP); as the readout, luciferin-dependent chemiluminescence of cell lysates was measured.
Results. Background signal in 293Luc-tNOD2 and 293Luc-stNOD2 was, respectively, 30 and 170 times higher than in 293Luc cells, pointing at NF-kB activation in the absence of NOD2 agonists. At the same time, limit of quantitation of MDP by 293Luc-stNOD2 cells was an order of magnitude lower than by 293Luc cells (1.6 nM and 20 nM, respectively). Systems based on 293Luc and 293Luc-stNOD2 cells possessed acceptable accuracy and repeatability, 293Luc-tNOD2 cells showed unsatisfactory repeatability as well as increased time and reagent consumption.
Conclusion. 293Luc and 293Luc-stNOD2 cell lines can be used to measure biological activity of NOD2 receptor agonists.
Keywords: NOD2; muramyl dipeptide; NF-kB; luciferase; innate immunity
Received 15.05.2020. Accepted 16.06.2020.
For citation: Dagil Yu.A., Pashenkov M.V. A comparison of three types of cell-based test systems for the assessment of biological activity of NOD2 receptor agonists. Immunologiya. 2020; 41 (4): 304—11. DOI: https://doi.org/ 10.33029/0206-4952-2020-41-4-304-311 (in Russian)
Funding. The work was performed in the framework of the State task «Study of approaches to the creation of immunotropic drugs» (cipher: Approach-16), contracts No 388-00049-16 from 25.01.2016, 388-03-108 from 30.01.2017, 388-03-2018-179 from 1.02.2018, 388-03-2019-110 from 8.02.2019, No 388-02-2020-008 from 15.01.2020.
For correspondence
Mikhail V. Pashenkov — MD, Acting Head of the Laboratory of Clinical Immunology, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mvpashenkov@yandex.ru https//orcid.org/0000-0002-6995-1790
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Введение
Активаторы врожденного иммунитета представляют большой интерес как средства профилактики и лечения инфекционных заболеваний человека. Одной из наиболее разработанной в фармакологическом отношении групп этих препаратов являются агонисты рецептора N002 врожденной иммунной системы. Базовым аго-нистом этого рецептора является фрагмент бактериального пептидогликана - мурамилдипептид (МДП, или ^ацетил-0-мурамил-Ь-аланил-0-изоглутамин) [1]. В России из этой группы препаратов наиболее хорошо известен глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП, или ^адетил-0-глюкозаминил-Ы-ацетил-0-мурамил-Ь-аланил-0-изоглутамин) [2]. В мире группа N002-агонистов представлена также препаратами мурабутид, ромуртид и мифамуртид [3-5]. Ведутся разработки других, более эффективных, агонистов, а также антагонистов рецептора N002 [6-8], что требует создания надежных, информативных и удобных в применении тест-систем для оценки биологической активности и фармакокинетики вновь создаваемых соединений.
Большинство рецепторов врожденного иммунитета, в том числе N002 и его ближайший родственник N001, передают сигнал в ядро при помощи факторов транскрипции семейства №-кВ [9, 10]. Поэтому для оценки биологической активности различных активаторов врожденного иммунитета используются репортерные клеточные линии, в которых измеряемым параметром является ОТ-кВ-зависимая экспрессия репортерного белка, например люциферазы, щелочной фосфатазы или зеленого флюоресцентного белка. Для введения в клетки репортерных генов, регулируемых №-кВ-зависимым промотором, используют плазмидные или вирусные векторы. Трансфекция репортерными конструкциями может быть временной (делается в каждом эксперименте, что повышает трудозатраты и снижает воспроизводимость) или стабильной. Последний вариант реализован в виде репортерных клеточных линий, созданных, в частности, фирмой Invivogen (США).
Для придания системе специфичности в отношении конкретного рецептора, как правило, прибегают к временной или стабильной гиперэкспрессии данного
рецептора, для чего используют векторные конструкции, в которых экспрессия интересующего рецептора регулируется конститутивно активным промотором. Однако гиперэкспрессия рецептора может приводить к нежелательным последствиям, в частности к активации NF-kB в отсутствие специфических агонистов [9, 10]. Кроме того, репортерные клетки экспрессируют эндогенные рецепторы врожденного иммунитета, что в ряде случаев может затруднять интерпретацию результатов. Альтернативным подходом является использование эндогенной экспрессии интересующего рецептора репортерными клетками, без его искусственной гиперэкспрессии; специфичность таких систем контролируют созданием вариантов репортерных клеток с нокдауном или нокаутом данного рецептора.
В данной работе мы сравнили ключевые характеристики трех видов репортерных клеток, предназначенных для оценки биологической активности агонистов NOD2: 1) с использованием эндогенной экспрессии NOD2; 2) с использованием временной гиперэкспрессии NOD2;
3) с использованием стабильной гиперэкспрессии NOD2. Все три вида клеток получены на основе клеточной линии HEK-293T, стабильно трансфицированной репортерным геном люциферазы под контролем NF-кВ-зависимого промотора. Вариант 2 характеризуется наибольшими разбросами измеряемого показателя (хе-милюминесценции) в пределах опыта, а также требует наибольших затрат времени и реактивов. Варианты 1 и 3 характеризуются хорошей вопроизводимостью и взаимно дополняют друг друга с точки зрения эффективного диапазона концентраций агониста, что позволяет применять их как для качественных, так и для количественных исследований агонистов NOD2-рецептора.
Материал и методы
Плазмиды и реактивы. Использовали следующие плазмиды: 1) pGL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro], кодирующую репортерный ген люциферазы (luc2P) под контролем NF-кВ-зависимого промотора (Pro-mega, США); 2) pUNO-hNOD2a, кодирующую ген NOD2 человека под контролем конститутивного промотора (Invivogen, США); 3) контрольную плаз-миду pcDNA3.1 (Life Technologies, Великобритания);
4) pcDNA3.3-Cas9n, кодирующую Cas9-никазу (Cas9n) [11]; 5) плазмиды pKS-gRNA-NOD2.1 и pKS-gRNA-NOD2.2, таргетирующие два близлежащих сайта в гене NOD2 человека [12]; 6) плазмиды pKS-gRNA-NOD1.1 и pKS-gRNA-NOD1.2, таргетирующие два близлежащих сайта в гене NOD1 человека [12]. N-ацетилмурамил-Ь-аланил-Э-изоглутамин (МДП) и бластицидин S были приобретены у фирмы Invivogen, липофектамин 2000, гигромицин В и рекомбинантный фактор некроза опухолей (ФНО) человека - у Life Technologies. N-ацетил-D-глюкозаминил-N-ацетил-D-сорбито-ламинил-О-лактоил-Ь-аланил-О-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновая кислота (ГС-триДАП) была получена, как описано ранее [12] и любезно предоставлена к.х.н. В.Л. Львовым (Институт иммунологии).
Получение репортерных клеток, содержащих ген люциферазы под контролем NF-кВ-зависимого промотора. Клетки HEK293T культивировали в среде DMEM («Панэко», Российская Федерация) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma, США) и 10 % инактивированной фетальной телячьей сыворотки (PAA, Австрия). Клетки трансфицировали плазмидой pGL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro] в комплексе с липо-фектамином 2000 согласно инструкции производителя. Селекцию стабильных трансфектантов выполняли в присутствии 200 мкг/мл гигромицина B (Life Technologies). Полученную клеточную линию, названную 293Luc, далее вели с указанной концентрацией гигромицина B, пассируя 2-3 раза в нед.
Получение клеток 293Luc со стабильной гиперэкспрессией NOD2. Экспоненциально растущие клетки 293Luc высевали в 24-луночный планшет по 105 на лунку. По достижении конфлюэнтности 50 % (примерно 2 • 105 клеток на лунку) клетки трансфицировали плазмидой pUNO-hNOD2a в дозе от 4 • 104 до 4 копий плаз-миды на клетку в комплексе с липофектамином 2000. Через 2 дня начинали селекцию стабильных трансфектантов в присутствии гигромицина B и бластицидина S (10 мкг/мл). Минимальное количество плазмиды, при котором клетки приобретали резистентность к бласти-цидину S, составило 400 копий на клетку. Клеточная линия, трансфицированная указанной дозой плазмиды и стабильно растущая в присутствии гигромицина B и бластицидина S на 21-й день после трансфекции, была названа 293Luc-stNOD2 (stable NOD2). Полученная клеточная линия является аналогом клеточной линии HEK-Blue™ hNOD2 (Invivogen).
Получение вариантов клеток 293Luc с нокаутом генов NOD2 и NOD1. Для нокаутирования генов использовали технологию CRISPR-Cas9 [12, 13]. Вкратце, клетки 293Luc котрансфицировали плазмидами pcDNA3.3-Cas9n и двумя плазмидами, таргетирующими ген NOD2 или NOD1. Через 3 суток трансфицированные клетки пересевали для получения клеточных клонов. Через 3 нед собирали клоны, среди которых отбирали те, у которых отсутствовал ответ на специфический агонист нокаутируемого рецептора при сохранности ответа на ФНО. Наличие изменений геномных последовательностей генов NOD2 и NOD1 в отобранных клонах подтверждали путем секвенирования по Сэнгеру. В работе использовали по одному клону с нокаутом NOD2 и NOD1 (293Luc-ANOD2 и 293Luc-ANOD1).
Стимуляция клеток 293Luc и их вариантов с нокаутом гена NOD2 и со стабильной гиперэкспрессией NOD2. Клетки высевали в плоскодонные 96-луночные планшеты (SPL Life Sciences, Республика Корея) по 104 клеток на 100 мкл на лунку. Через 48 ч, когда монослой достигал коэнфлюэнтности 70-80 %, добавляли МДП в необходимой конечной концентрации либо рекомби-натный ФНО человека в конечной концентрации 100 нг/мл (положительный контроль). В лунки отрицательного контроля добавляли DMEM в том же объеме. Все стимуляции делали в дублях или триплетах. Еще через
24 ч в лунки добавляли лизирующий субстрат Bright-Glo (Promega), полученные клеточные лизаты переносили в 96-луночные планшеты из белого пластика (SPL Life Sciences) и измеряли люциферазную активность (хемилюминесценцию) на приборе Lucy II (Anthos, Австрия). Результаты выражали в относительных световых единицах (ОСЕ). Для корректного сравнения экспериментов результаты нормализовали, принимая ответ данного вида клеток на ФНО в каждом эксперименте за 100 %.
Временная гиперэкспрессия NOD2 в клетках 293Luc в сочетании со стимуляцией МДП. Клетки с временной гиперэкспрессией NOD2 ниже называются 293Luc-tNOD2 (transient NOD2). Методика описана в других работах [14]. 96-луночные планшеты с клетками 293Luc готовили, как описано выше. В день эксперимента готовили комплексы, содержащие: 1) требуемое количество МДП (контроль - среда без МДП); 2) плазмиду pUNO-hNOD2a в количестве 2 нг/лунку или примерно 1,0-1,5 • 104 копий на клетку (контроль -плазмида pcDNA3.1, 2 нг/лунку); 3) липофектамин 2000 (0,4 мкл/лунку). Комплексы добавляли к клеткам в течение 10-15 мин после приготовления. В качестве положительного контроля использовали ФНО. Через 24 ч измеряли люциферазную активность, как описано выше.
Анализ данных. Отношение сигнала к шуму рассчитывали как отношение ОСЕ в лунках с агонистами (МДП или ФНО) к OCE в лунках без агонистов (фон). Предел количественного определения (ПКО) устанавливали путем анализа образцов, не содержащих МДП и содержащих низкие концентрации МДП, все в 6 по-вторностях. ПКО определяли как наименьшую концентрацию МДП, при которой получаемый сигнал еще удовлетворял следующим 3 критериям [15]: 1) сигнал в любой из 6 лунок с данной концентрацией МДП должен быть выше, чем M + 1,645с фонового сигнала;
2) наличие высокодостоверного отличия сигнала при данной концентрации МДП от фонового сигнала (p < 0,001 при использовании /-критерия Стьюдента);
3) коэффициент вариации сигнала при данной концентрации МДП - не более 20 %. Правильность и повторяемость оценивали путем 6-кратного определения
концентрации МДП в растворе, содержащем известное количество МДП. Правильность рассчитывали как М ± а относительного отклонения измеренной концентрации МДП от фактической, выраженного в процентах. Повторяемость (сходимость) оценивали по коэффициенту вариации измеренной концентрации МДП (в процентах). Для статистического анализа использовали /-критерий Стьюдента.
Результаты
Базальные и индуцированные показатели хемилюминесценции у трех видов репортерных клеток. Отношение полезного сигнала к шуму
На рисунке и в табл. 1 показаны базальные и индуцированные показатели хемилюминесценции клеток 293Ьис, 293Ьис4Ш02 и 293Ьис^Ш02.
Фоновый сигнал у клеток 293Luc-tN0D2 был примерно в 30 раз выше, а у клеток293Luc-stN0D2 - в 170 раз выше, чем у клеток 293Ьис (см. табл. 1). Таким образом, гиперэкспрессия N002 приводит к резкому повышению фоновой (в отсутствие специфического агониста) активации №-кВ.
ФНО индуцировал примерно одинаковую люцифе-разную активность во всех трех типах клеток (см. табл. 1). Однако, поскольку фоновые сигналы резко различались, отношение сигнала к шуму при стимуляции ФНО у клеток 293Ьис составило 2450 ± 820, тогда как у клеток 293Ьис4Ш02 - 137 ± 91, а у клеток 293Ьис^Ш02 -всего 12,2 ± 3,7.
Зависимость ответа от логарифма концентрации МДП у клеток 293Ьис, экспрессирующих эндогенный N002, носила характер сигмоидной функции (рисунок А). Верхнее плато ответа на МДП у клеток 293Ьис не превышало 5 % от ответа на ФНО, ЕС50 составила 0,18 ± 0,05 мкМ (^ЕС50 = -0,77 ± 0,14). Однако в связи с низкой базальной хемилюминесценцией клетки 293Ьис характеризовались наибольшими среди трех видов клеток отношениями полезного сигнала к шуму при ответе на МДП (см. табл. 1).
У клеток 293Luc-stN0D2 кривая ответа на МДП имела колоколообразную форму (см. рисунок Б). Максимум ответа на МДП, составляющий > 50 % ответа
Таблица 1. Функциональные свойства клеток 293Luc, 293Luc-tNOD2 и 293Luc-stNOD2*
Агонист Показатель (ед. измерения) 293Luc 293Luc-tNOD2 293Luc-stNOD2
- Сигнал (ОСЕ) 6,6 ± 2,9 201±182 1109±504
ФНО (100 нг/мл) Сигнал (ОСЕ) 15036±3482 15299±1599 12359±2864
ОСШ 2450 ± 820 137 ± 91 12,2 ± 3,7
МДП (100 нМ) Сигнал (ОСЕ) 140 ± 69 1800±978 9975±3173
ОСШ 22,7 ± 9,8 11,3 ± 6,6 10,4 ± 5,1
МДП (1 мкМ) Сигнал (ОСЕ) 409±212 2011±616 1143 ±170
ОСШ 64,6 ± 31,8 16,8 ± 11,3 1,46 ± 0,52
МДП Ь^,„ЕС5„ -0,77 ± 0,14 -1,64 ± 0,25 -1,68 ± 0,15
МДП Предел количественного определения (мкМ) 0,02 < 0,02 0,0016
Примечание. * - значения средних и стандартных отклонений рассчитаны по результатам 7-15 независимых экспериментов; ОСШ - отношение сигнала к шуму; ФНО - фактор некроза опухоли; здесь и в табл. 2: МДП - мурамилдипептид.
Э
20 000 i 10 000 -
н
о 600 Н
о
4002000
• Опыт: 293 Luc О Контроль: 293 Luc-ANOD2
ч-—i-Ч-
-3 -2 -1 0
МДП (log10C [мкМ])
Э
10 000 -, 8000
g 6000 пО
4000-
2000-
0
• Опыт: 293 Luc-stNOD2 О Контроль: 293 Luc
-4 -3 -2 -1 0 1 2 МДП (log10C [мкМ])
16 000 80004000 -г
О 3000 О
200010000
3000 п
• Опыт: 293 Luc-tNOD2 О Контроль: 293 Luc-pcDNA3.1
-3 -2 -1 0 1 2 МДП (log10C [мкМ])
э
2000-
1000-
X
I Без агонистов ■ ГС-триДАП (50 мкМ)
(У
I
2000-,
1500 -
H
О 1000-О
500-
0
• Опыт: 293 Luc-stNOD2 О Контроль: 293 Luc
2
-2 -1 0 1
ГС-триДАП (log10C [мкМ])
Примеры ответов клеток 293Luc, 293Luc-tNOD2 и 293Luc-stNOD2, а также соответствующих контрольных клеток на агонисты NOD-рецепторов.
А - ответ клеток 293Luc и контрольных клеток 293Luc-ANOD2 на мурамилдипептид (МДП); Б - ответ клеток 293Luc-stNOD2 и контрольных клеток 293Luc на МДП; В - ответ на МДП клеток 293Luc-tNOD2 и контрольных клеток 293Luc, трансфици-рованных плазмидой pcDNA3.1; Г - ответ клеток 293Luc, 293Luc-ANOD2 и 293Luc-ANOD1 на ГС-триДАП; Д - ответ клеток 293Luc-stNOD2 и контрольных клеток 293Luc на ГС-триДАП. На всех графиках показаны результаты 1 репрезентативного эксперимента из не менее чем 3 для каждой серии (M±a по 3 повторностям в каждом эксперименте). На графиках А, Б, В и Д пунктирной линией отмечена средняя фоновая хемилюминесценция опытных клеток, точечно-пунктирной линией - средняя ФНО-индуцированная хемилюминесценция опытных клеток.
2
0
на ФНО, достигался при концентрации около 0,1 мкМ. При дальнейшем повышении концентрации МДП ответ падал, так что при концентрациях свыше 1 мкМ уровни хемилюминесценции были даже ниже базаль-ного, что может быть обусловлено истощением пулов сигнальных молекул при гиперактивации N002. Левая часть кривой «доза-ответ» аппроксимировалась сигмоидной функцией (рисунок Б), причем ЕС50 была примерно на порядок ниже, чем у клеток 293Ьие (ЕС50 = 0,021 ± 0,008 мкМ, 1оя10ЕС50 = -1,68 ± 0,15; см. табл. 1). Отношения сигнала к шуму у клеток
293Luc-stN0D2 были существенно ниже, чем у клеток 293Ьие, за счет как более высокой базальной хемилю-минесценции, так и аутоингибирования сигнала при высокой концентрации МДП.
Клетки 293Luc-tN0D2 занимали промежуточное положение по указанным показателям (см. табл. 1). При наиболее высокой исследованной концентрации МДП (2,5 мкМ) тоже отмечалась тенденция к ауто-ингибированию сигнала, хотя и не столь выраженная, как у клеток 293Luc-stN0D2 (рисунок В). Также у клеток 293Luc-tN0D2 обращают на себя внимание
большие стандартные отклонения сигнала в пределах опыта, что указывает на низкую воспроизводимость методики.
Предел количественного определения
Предел количественного определения МДП составил у клеток 293Ьис - 20 нМ, у клеток 293Ьис^Ш002 -1,6 нМ (см. табл. 1). Для клеток 293Ьис^002 этот показатель не был точно определен, он находился в диапазоне 4-20 нМ.
Специфичность
Как любые другие клетки, клеточная линия НЕК293Т и ее модифицированные варианты экспресси-руют не только N002, но и другие паттерн-распознаю-щие рецепторы, стимуляция которых может приводить к активации №-кВ. В связи с этим необходима проверка специфичности сигнала, получаемого под действием исследуемых соединений.
При использовании линии 293Ьис контролями специфичности служат варианты этой клеточной линии с нокаутами генов N002 и других паттерн-распознаю-щих рецепторов. Например, клетки с нокаутом N002 (293Luc-ДN0D2) не отвечают на МДП в концентрациях вплоть до 50 мкМ (см. рисунок А). Тем самым подтверждается, что МДП активирует №-кВ в клетках 293Luc исключительно через рецептор N002. Для сравнения, другое вещество мурамилпептидной природы, ГС-триДАП, тоже вызывает активацию №-кВ в клетках 293Luc, но эта активность сохраняется в клетках 293Luc-ДN0D2 и исчезает в клетках 293Luc-ДN0D1 с нокаутом гена N001, что указывает на избирательность ГС-триДАП по отношению к рецептору N001 (см. рисунок Г).
Контролем для клеток 293Luc-stN0D2 служат клетки 293Luc. Как было отмечено выше, клетки 293Luc-stN0D2 отвечают на МДП в концентрациях на порядок ниже, чем клетки 293Luc, что подтверждает активность МДП по отношению к рецептору N002 (см. рисунок Б). Вещество ГС-триДАП, являющееся агонистом N001, тоже активирует №-кВ и в клетках 293Luc, и в клетках 293Luc-stN0D2 (см. рисунок Д). Однако ЕС50 для ГС-триДАП в клетках 293Luc-stN0D2 даже несколько выше, чем в клетках 293Luc (в опыте на рисунке Д -2,54 мкМ и 1,43 мкМ соответственно). Следовательно, активация №-кВ в клетках 293Luc-stN0D2 под действием ГС-триДАП не обусловлена активацией N002.
Правильность и повторяемость
Для оценки правильности и повторяемости методик исследовали одно и то же разведение МДП в 6 повтор-ностях (расчетная конечная концентрация МДП в среде составляла 100 нМ в случае клеток 293Luc и 293Luc-tN0D2 и 10 нМ в случае 293Luc-stN0D2), после чего по калибровочным кривым рассчитывали концентрацию МДП в среде. Как видно из табл. 2, клетки 293Luc и 293Luc-stN0D2 позволяли правильно определять концентрацию МДП в среде при достаточно хорошей повторяемости. В то же время клетки 293Luc-tN0D2
характеризовались неудовлетворительной повторяемостью, о чем свидетельствует высокий коэффициент вариации.
Обсуждение
N0D2-репортерные клеточные линии могут использоваться для решения нескольких задач: 1) фундаментальные исследования рецептора N002, в частности изучение его сигнальных путей; 2) изучение биологической активности вновь создаваемых агонистов и антагонистов N002, а также контроль качества производственных партий этих групп препаратов; 3) определение содержания агонистов N002 в биологических жидкостях. Различия свойств полученных клеточных линий определяют их сферы применения. Ниже мы исключаем из сравнения клетки 293Luc-tN0D2 с временной гиперэкспрессией N002, поскольку данная модель является наиболее затратной с точки зрения рабочего времени и расходных материалов и обладает наихудшей воспроизводимостью.
Изучение сигнальных путей рецептора КСБ2. Клетки 293Luc характеризуются естественной экспрессией рецептора N002, низкой фоновой активацией №-кВ, а также высоким отношением сигнала к шуму при стимуляции классическим агонистом N002 (МДП), что позволяет использовать их для изучения сигнальных путей рецептора N002, например путем нокаутирования или ингибирования известных или предполагаемых компонентов сигнальных путей. Клетки 293Luc-stN0D2 менее пригодны для этой цели, поскольку избыточная экспрессия белка N002 может приводить к его неестественным взаимодействиям с другими белками, искажая естественную картину N0D2-зависимой передачи сигнала. Проявлением этого может служить высокая фоновая активация №-кВ в клетках 293Luc-stN0D2 в отсутствие специфического агониста, что уже было описано в литературе [9, 10].
Изучение биологической активности агонистов и антагонистов КСБ2. Для определения биологической активности агонистов N002 пригодны обе клеточные линии. Хотя антагонисты N002 в работе не изучались за неимением коммерчески доступных соединений этого класса, есть основания для предположения, что и этот класс соединений может быть изучен с помощью полученных клеточных линий. Однако необходимо учитывать, что избыточная чувствительность клеток 293Luc-stN0D2 к агонистам N002 способна приводить к искажению показателей активности изучаемых соединений, в связи с чем требуется перепроверка данных, полученных с помощью 293Luc-stN0D2, на клетках 293Luc с естественной экспрессией N002, которая сопоставима с экспрессией N002 в макрофагах человека [12].
Определение агонистов КСБ2 в биологических жидкостях. Как клетки 293Luc, так и клетки 293Luc-stN0D2 могут в перспективе быть использованы для количественного определения агонистов N002 в биологических жидкостях, например при фармакокине-
тических исследованиях. Оба вида клеток характеризуются приемлемыми показателями правильности и повторяемости. Предел определения МДП у клеток 293Luc и 293Luc-stN0D2 сопоставим или лучше, чем у систем, основанных на высокоэффективной жидкостной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии [16-18]. Хотя полезный диапазон каждой клеточной линии сравнительно невелик (20 нМ - 1 мкМ для клеток 293Luc, 1,6 нМ - 100 нМ для клеток 293Luc-stN0D2), параллельное тестирование образцов на двух клеточных линиях позволяет расширить его примерно до трех порядков. При использовании клеток 293Luc-stN0D2 возможно ошибочное занижение концентрации агони-ста, обусловленное колоколообразной зависимостью ответа от концентрации у клеток 293Luc-stN0D2, тогда как параллельное тестирование образцов на клетках 293Luc-stN0D2 и 293Luc позволит избежать этой ошибки, поскольку у клеток 293Luc отсутствует ауто-ингибирование сигнала вплоть до концентрации МДП 50 мкМ (данные не представлены).
Выводы
1. В работе получены репортерные клеточные линии с естественной экспрессией, с временной гиперэк-
спрессией и со стабильной гиперэкспрессией рецептора N0D2, а также соответствующие контрольные линии.
2. Полученные клеточные линии позволяют оценивать биологическую активность агонистов рецептора N0D2, а также могут быть использованы для других исследований, связанных с активацией этого рецептора. Наилучшими характеристиками по правильности и повторяемости обладают клеточные линии с естественной экспрессией N0D2 (293Luc) и со стабильной гиперэкспрессией N0D2 (293Luc-stN0D2).
3. Нижний предел количественного определения мурамилдипептида у клеточной линии с 293Luc составляет 20 нМ, у клеточной линии 293Luc-stN0D2 -1,6 нМ. Диапазон измеряемых концентраций МДП при параллельном использовании двух клеточных линий варьирует от 1,6 до 1 мкМ.
Вклад авторов
Участие в получении репортерных клеточных линий, оценка их функциональных свойств, статистическая обработка данных, участие в написании статьи - Да-гиль Ю.А.; общее руководство работой, получение репор-терных клеточных линий, участие в статистической обработке результатов, написание статьи - Пащенков М. В.
■ Литература
1. Girardin S.E., Boneca I.G., Viala J., Chamaillard M., Labigne A., Thomas G. et al. Nod2 is a general sensor of peptidoglycan through muramyl dipeptide (MDP) detection. J. Biol. Chem. 2003; 278 (11): 8869-72.
2. Винницкий Л.И.,БунятянК.А.,ПинегинБ. В., МироноваЕ. В., Швец Л.И., Волков А.А. и др. Отечественный иммуномодулятор нового поколения Ликопид в комплексном лечении и профилактике инфекционных осложнений в хирургической клинике. Вестник Российской академии медицинских наук. 1997; (11): 46-9.
3. Bahr G.M., Darcissac E., Bevec D., Dukor P., Chedid L. Im-munopharmacological activities and clinical development of muramyl peptides with particular emphasis on murabutide. Int. J. Immunophar-macol. 1995; 17 (2): 117-31.
4. Azuma I. Review: inducer of cytokines in vivo: overview of field and romurtide experience. Int. J. Immunopharmacol. 1992; 14 (3): 487-96.
5. Kager L., Potschger U., Bielack S. Review of mifamurtide in the treatment of patients with osteosarcoma. Ther. Clin. Risk Manag. 2010; 6: 279-86.
6. Kecek Plesec K., Urbancic D., Gobec M., Pekosak A., Toma-sic T., Anderluh M. et al. Identification of indole scaffold-based dual inhibitors of NOD1 and NOD2. Bioorg. Med. Chem. 2016; 24 (21): 5221-234.
7. Wang S., Yang J., Li X., Liu Z., Wu Y., Si G. et al. Discovery of 1,4-benzodiazepine-2,5-dione (BZD) derivatives as dual nucleotide binding oligomerization domain containing 1/2 (NOD1/ NOD2) antagonists sensitizing paclitaxel (PTX) to suppress Lewis lung carcinoma (LLC) growth in vivo. J. Med. Chem. 2017; 60 (12): 5162-92.
8. Rickard D.J., Sehon C.A., Kasparcova V., Kallal L.A., Zeng X., Montoute M.N. et al. Identification of benzimidazole diamides as selective inhibitors of the nucleotide-binding oligomeriza-tion domain 2 (NOD2) signaling pathway. PLoS One. 2013; 8 (8): e69619.
9. Ogura Y., Inohara N., Benito A., Chen F.F., Yamaoka S., Nunez G. Nod2, a Nod1/Apaf-1 family member that is restricted to monocytes and activates NF-kappaB. J. Biol. Chem. 2001; 276 (7): 4812-8.
10. Inohara N., Koseki T., del Peso L., Hu Y., Yee C., Chen S. et al. Nod1, an Apaf-1-like activator of caspase-9 and nuclear factor-kappaB. J. Biol. Chem. 1999; 274 (21): 14 560-7.
11. Tarasevich A., Filatov A., Pichugin A., Mazurov D. Monoclonal antibody profiling of cell surface proteins associated with the viral biofilms on HTLV-1 transformed cells. Acta Virol. 2015; 59 (3): 247-56.
12. Dagil Y.A., Arbatsky N.P., Alkhazova B.I., L'vov V.L., Mazurov D.V., Pashenkov M.V. The dual NOD1/NOD2 agonism of mu-ropeptides containing a meso-diaminopimelic acid residue. PLoS One. 2016; 11 (8): e0160784.
13. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J., Agarwala V., Scott D.A., Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 2013; 8 (11): 2281-308.
14. Girardin S.E.,Travassos L.H., Herve M., Blanot D., Boneca I.G., Philpott D.J. et al. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2. J. Biol. Chem. 2003; 278 (43): 41 702-8.
15. Armbruster D.A., Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 2008; 29 (1): S49-52.
16. Курсаков С.В., Кузнецова Е.Г., Курылева О.М., Салома-тина Л.А., Гурьянова С.В., Борисова О. и др. Разработка и вали-дация методики определения глюкозаминилмурамилдипептида в водных растворах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Иммунология. 2020; 41 (1): 74-82.
17. Fosset S., Fromentin G., Rampin O., Lang V., Mathieu F., Tome D. Pharmacokinetics and feeding responses to muramyl dipep-tide in rats. Physiol. Behav. 2003; 79 (2): 173-82.
18. Fox A., Fox K. Rapid elimination of a synthetic adjuvant pep-tide from the circulation after systemic administration and absence of detectable natural muramyl peptides in normal serum at current analytical limits. Infect. Immun. 1991; 59 (3): 1202-5.
■ References
1. Girardin S.E., Boneca I.G., Viala J., Chamaillard M., Lab- through muramyl dipeptide (MDP) detection. J. Biol. Chem. 2003; igne A., Thomas G., et al. Nod2 is a general sensor of peptidoglycan 278 (11): 8869-72.
2. Vinnitskiy L.I., Bunyatyan K.A., Pinegin B.V., Mironova E.V., Shvets L.I., Volkov A.A., et al. Domestic immunomodulator of a new generation, Licopid, in the comprehensive therapy and prevention of infectious complications in surgery. Vestnik Rossiyskoy akademii meditsinskikh nauk. 1997; (11): 46-9. (in Russian)
3. Bahr G.M., Darcissac E., Bevec D., Dukor P., Chedid L. Im-munopharmacological activities and clinical development of muramyl peptides with particular emphasis on murabutide. Int. J. Immunophar-macol. 1995; 17 (2): 117-31.
4. Azuma I. Review: inducer of cytokines in vivo: overview of field and romurtide experience. Int. J. Immunopharmacol. 1992; 14 (3): 487-96.
5. Kager L., Potschger U., Bielack S. Review of mifamurtide in the treatment of patients with osteosarcoma. Ther. Clin. Risk Manag. 2010; 6: 279-86.
6. Kecek Plesec K., Urbancic D., Gobec M., Pekosak A., Toma-sic T., Anderluh M., et al. Identification of indole scaffold-based dual inhibitors of NOD1 and NOD2. Bioorg. Med. Chem. 2016; 24 (21): 5221-234.
7. Wang S., Yang J., Li X., Liu Z., Wu Y., Si G., et al. Discovery of 1,4-benzodiazepine-2,5-dione (BZD) derivatives as dual nucleotide binding oligomerization domain containing 1/2 (NOD1/NOD2) antagonists sensitizing paclitaxel (PTX) to suppress Lewis lung carcinoma (LLC) growth in vivo. J. Med. Chem. 2017; 60 (12): 5162-92.
8. Rickard D.J., Sehon C.A., Kasparcova V., Kallal L.A., Zeng X., Montoute M.N., et al. Identification of benzimidazole diamides as selective inhibitors of the nucleotide-binding oligomerization domain 2 (NOD2) signaling pathway. PLoS One. 2013; 8 (8): e69619.
9. Ogura Y., Inohara N., Benito A., Chen F.F., Yamaoka S., Nunez G. Nod2, a Nod1/Apaf-1 family member that is restricted to monocytes and activates NF-kappaB. J. Biol. Chem. 2001; 276 (7): 4812-8.
10. Inohara N., Koseki T., del Peso L., Hu Y., Yee C., Chen S., et al. Nodi, an Apaf-1-like activator of caspase-9 and nuclear factor-kappaB. J. Biol. Chem. 1999; 274 (21): 14 560-7.
11. Tarasevich A., Filatov A., Pichugin A., Mazurov D. Monoclonal antibody profiling of cell surface proteins associated with the viral biofilms on HTLV-1 transformed cells. Acta Virol. 2015; 59 (3): 247-56.
12. Dagil Y.A., Arbatsky N.P., Alkhazova B.I., L'vov V.L., Mazurov D.V., Pashenkov M.V. The dual NOD1/NOD2 agonism of mu-ropeptides containing a meso-diaminopimelic acid residue. PLoS One. 2016; 11 (8): e0160784.
13. Ran F.A.,Hsu P.D., Wright J., Agarwala V., Scott D.A., Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 2013; 8 (11): 2281-308.
14. Girardin S.E.,Travassos L.H., Herve M., Blanot D., Boneca I.G., Philpott D.J., et al. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2. J. Biol. Chem. 2003; 278 (43): 41 702-8.
15. Armbruster D.A., Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 2008; 29 (1): S49-52.
16. Kursakov S.V., Kuznetsova E.G., Kuryleva O.M., Saloma-tina L.A., Gur'yanova S.V., Borisova O.Yu., et al. Development and validation of method for glucosaminylmuramyl dipeptide determining in aqueous solutions by high-performance liquid chromatography. Im-munologiya. 2020; 41 (1): 74-82. (in Russian)
17. Fosset S., Fromentin G., Rampin O., Lang V., Mathieu F., Tome D. Pharmacokinetics and feeding responses to muramyl dipep-tide in rats. Physiol. Behav. 2003; 79 (2): 173-82.
18. Fox A., Fox K. Rapid elimination of a synthetic adjuvant pep-tide from the circulation after systemic administration and absence of detectable natural muramyl peptides in normal serum at current analytical limits. Infect. Immun. 1991; 59 (3): 1202-5.
Сведения об авторах
Дагиль Юлия Алексеевна - к. б. ннаучный сотрудник лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация; e-mail: dagilya@petrovax.ru, http://orcid.org/0000-0001-9320-0789
Пащенков Михаил Владимирович - д.м.н., и.о. заведующего лабораторией клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация; e-mail: mvpashenkov@yandex.ru, http://orcid.org/0000-0002-6995-1790
Authors' information
Yuliya A. Dagil — PhD, Researcher of the Laboratory of Clinical Immunology, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation; e-mail: dagilya@petrovax.ru, http://orcid. org/0000-0001-9320-0789
Mikhail V. Pashenkov — MD, Acting Head of the Laboratory of Clinical Immunology, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation; e-mail: mvpashenkov@yandex.ru, http://orcid.org/0000-0002-6995-1790
