CC BY
109
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2012
ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ
© М. в. ПАЩЕНКОВ, Б. В. ПИНЕГИН, 2012 УДК 612.017.1:579.22
М. В. Пащенков, Б. В. Пинегин
применение рнк-интерференции для изучения механизмов распознавания мурамилпептидов
ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, (115478, г Москва, Каширсое ш., д. 24, корп. 2)
При лизоцимном гидролизе пептидогликана (ПГ) грамотрицательных бактерий образуются мономерные и димерные мурамилпептиды. Первые представлены ^ацетилЮ-глюкозаминил-(Р1^ 4)-^ацетил^-мурамоил^-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелиновой кислотой (ГМтри) и ^ацетил^-глюкозаминил-(Р1^4)-^ацетил^-мурамоил^-аланилЮ-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил^-аланином (ГМтетра), вторые - димером ГМтетра (диГМтетра), в котором мономеры ГМтетра соединены путем амидной связи между карбоксильной группой терминального D-аланина одного остатка ГМтетра и ш-аминогруппой мезо-диаминопимелиновой кислоты другого остатка ГМтетра. Рецепторы, отвечающие за распознавание диГМтетра, не охарактеризованы. Для изучения этого вопроса макрофаги (МФ) человека трансфицировали малыми интерферирующими РНК (siRNA) против трех рецепторов, участвующих в распознавании ПГ и мурамилпептидов, - TLR2, NOD1 и NOD2. В МФ, трансфицированных siRNA, была снижена экспрессия целевых генов и подавлена продукция фактора некроза опухолей (ФНО) в ответ на специфические агонисты соответствующих рецепторов. В распознавании диГМтетра участвовали все три рецептора: ответ МФ на диГМтетра при нокдауне TLR2 был подавлен в 2 раза, при нокдауне NOD1 и NOD2 - в 3-4 раза. Суммарный ингибирующий эффект всех трех siRNA был больше 100%, что указывает на наличие супераддитивных взаимодействий между рецепторами, участвующими в распознавании диГМтетра.
Ключевые слова: мурамилпептиды, TLR2, NOD1, NOD2, РНК-интерференция, макрофаги M.V Pashenkov, B.V.Pinegin
THE USE OF RNA INTERFERENCE TO STUDY MECHANISMS OF MURAMYL PEPTIDE RECOGNITION
Upon lysosyme-mediated hydrolisis, peptidoglycan (PG) of Gram-negative bacteria yields monomeric and dimeric muramyl peptides. The former ones include N-acetyl-D-glucosaminyl-(P1^4)-N-acetyl-D-muramoyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-meso-diaminopimelic acid (GMtri) and N-acetyl-D-glucosaminyl-(P1^4)-N-acetyl-D-muramoyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-meso-diaminopimeloyl-D-alanin (GMtetra), while the latter ones are represented by a dimer of GMtetra (diGMtetra), wherein two monomeric residues of GMtetra are linked via an amide bond between the carboxyl group of terminal D-alanin of one monomer and the ш-amino group of meso-diaminopimelic acid of the other monomer. Receptors involved in the recognition of diGMtetra have not been characterized. To investigate this issue, we transfected human macrophages (Mphi) with small interfering RNAs (siRNAs) against three receptors known to recognize PG or muramyl peptides: TLR2, NOD1 and NOD2. In Mphi transfected with gene-specific siRNAs, expression of target genes was diminished, and production of tumor necrosis factor (TNF) in response to specific agonists of respective receptors was suppressed. All three receptors appeared to participate in the recognition of diGMtetra; thus, knock-down of TLR2 resulted in a 2-fold decrease, and knock-down of NOD1 or NOD2 in a 3-4-fold decrease of diGMtetra-induced TNF production. The sum of the inhibitory effects of all three siRNAs was greater than 100%, which points at the existence of super-additive interactions between receptors involved in the recognition of diGMtetra.
Keywords: muramyl peptides, TLR2, NOD1, NOD2, RNA interference, macrophages
Введение
Пептидогликан (ПГ) входит в состав клеточной стенки большинства бактерий и является мощным активатором врожденной иммунной системы. Основу ПГ составляют гликановые цепи, образованные чередующимися остатками №ацетил^-глюкозамина (GlcNAc) и N-ацетил-Э-мурамовой кислоты (MurNAc). К COOH-группам MurNAc присоединяются олигопептиды. Как правило, отходящие от соседних гликановых цепей олигопептиды образуют друг с другом сшивки. Лизоцим, вырабатываемый клетками иммунной системы, разрывает гликозидные связи MurNAc-(pi^4)-GlcNAc, в результате чего ПГ расщепляется до гликопептидных фрагментов - мурамилпептидов [3]. Кроме того,
Пащенков Михаил Владимирович - канд. мед. наук, вед. науч. сотр., тел. 8(499) 617-76-49, e-mail: mvpashenkov@yandex.ru
мурамилпептиды образуются как промежуточные продукты синтеза ПГ в бактериях.
Известно, что активирующее действие на иммунную систему оказывает как полимерный ПГ (распознается поверхностным рецептором TLR2 [4]), так и мурамилпептиды (распознаются цитозольными рецепторами NOD1 и NOD2 [2, 7]). NOD1 распознает мурамилпептиды грамотрицательных бактерий, содержащие остаток мезо-ДАП, в частности ГМтри и ГМтетра [2, 6, 12]. NOD2 распознает мурамилди-пептид (МДП) и глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП) - фрагменты ПГ практически всех бактерий [6, 7, 13]. Активация TLR2, NOD1 и NOD2 ведет к индукции экспрессии медиаторов воспаления, антимикробных пептидов и других защитных факторов [9, 12, 17, 22].
При лизоцимном гидролизе ПГ грамотрицательных бактерий в зависимости от длины олигопептида, связанного с данным остатком MurNAc, и от наличия его сшивок с другой олигопептидной цепью образуются три мурамилпептида: 1)
- 292 -
врожденный иммунитет
Н-ацетил-Э-глюкозаминил-(Р1 ^4)-№ацетил-Э-мурамоил-L-аланил-D-uзоглютаминил-мезо-диаминопимелиновая кислота (ГМтри); 2) Н-ацетил-Э-глюкозаминил-(Р1^4)-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютаминил-мезо-диаминопимелоил-Э-аланин (ГМтетра); 3) димер ГМтетра (диГМтетра), в котором мономеры ГМтетра соединены путем амидной связи между карбоксильной группой терминального D-аланина одного остатка ГМтетра и ю-аминогруппой мезо-диаминопимелиновой кислоты другого остатка ГМтетра [17].
Данные, доступные в литературе, касаются только распознавания таких мономерных мурамилпептидов, как ГМтри [7, 8, 13]. Рецепторы, отвечающие за распознавание таких димерных мурамилпептидов, как диГМтетра, не охарактеризованы.
Для идентификации рецепторов, распознающих микробное вещество X, применяют два подхода. Первый основан на использовании клеточных линий, которые в исходном состоянии не экспрессируют рецепторы к веществам микробной природы. В этих клетках трансгенно экспрессирует предполагаемый рецептор Y в сочетании с репортерной конструкцией [8, 13]. Активация репортера в присутствии вещества X однозначно свидетельствует о том, что вещество действует через рецептор Y. Основной недостаток подхода заложен в его базовом принципе: в клетках, исходно не экспрессирующих рецептор Y, могут отсутствовать и фунционально значимые кофакторы и компоненты сигнальных путей, что может вести к недооценке или переоценке роли рецептора в распознавании вещества X.
Второй подход основан на подавлении функции рецепторов, естественным образом экспрессируемых клетками врожденной иммунной системы. Наиболее специфичными из них являются блокировка связывания рецептора с лигандом с помощью антител и ингибирование экспрессии рецептора на уровне мРНК путем РНК-интерференции (RNAi). В случае таких цитозольных молекул, как NOD1 и NOD2, единственным приемлемым способом является RNAi. Наиболее распространенный и технически простой вариант RNAi основан на введении в клетку малой интерферирующей РНК (small interfering RNA, siRNA), которая представляет собой двухцепочечный олигонуклеотид длиной 19-21 пар оснований, одна из цепей которых комплементарна целевой мРНК [5]. К недостаткам RNAi относится необходимость тщательного подбора условий и сроков, при которых происходит наибольшее подавление экспрессии данного рецептора.
В настоящей работе были поставлены две задачи: 1) отработать методику ингибирования экспрессии NOD1, NOD2 и TLR2 в макрофагах (МФ) путем трансфекции малых интерферирующих РНК; 2) применить эту методику для идентификации рецепторов, участвующих в распознавании димерного мурамилпептида диГМтетра.
Материалы и методы
2.1. Мурамилпептиды
ГМтри и диГМтетра получали из ПГ S. typhi, как описано ранее [1, 17]. ГМДП был куплен у "Sigma" (США).
2.2. Получение siRNA
Последовательности siRNA против мРНК NOD1, NOD2 и TLR2, а также контрольной siRNA, не взаимодействующей с какой-либо из известных мРНК, описаны B. Opitz и соавт. [16] и приведены в табл. 1. Пары комплементарных одноцепочечных рибоолигонуклеотидов, содержащих по два некомплементарных дезоксирибонуклеотидных остатка на 3’-конце [5], были синтезированы фирмой "Синтол" (Москва). Для того чтобы получить двухцепочечные siRNA, комплементарные олигонуклеотиды смешивали в гибридизацион-ном буфере (100 мМ NaCl, 50 мМ HEPES, pH 7,4) в эквимолярной концентрации (20 мкМ каждый), инкубировали 3 мин при 90°C и плавно охлаждали до комнатной температуры. Полноту гибридизации подтверждали путем электрофореза в 20% неденатурирующем полиакриламидном геле. В качестве
флюорохроммеченной siRNA использовали контрольную siRNA, антисмысловая цепь которой содержала метку FAM (флюоресцеин) на 3’-конце (FAMsi).
2.3. Культивирование, трансфекция и стимуляция МФ
МФ получали из моноцитов периферической крови
путем 6-суточного культивирования с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ; "Invitrogen", Великобритания), как описано ранее [17]. На 6-е сутки МФ отделяли от пластика путем трипсиниза-ции, отмывали и подсчитывали.
siRNA вводили в МФ с помощью реагента Липофекта-мин 2000 (Л2000; "Invitrogen", Великобритания). Требуемое количество МФ вносили в лунки 24-луночных планшетов на 500 мкл полной культуральной среды (RPMI-1640 с 2 мМ L-глутамином и 10% фетальной телячьей сывороткой (все PAA, Австрия). Давали клеткам прикрепиться к пластику, после чего удаляли среду и вносили по 500 мкл свежей среды. Липосомы готовили путем смешивания нужных количеств Л2000 и siRNA в бессывороточной среде с последующей 20-минутной инкубацией при комнатной температуре, после чего добавляли к МФ.
В опытах с трансфекцией FAMsi клетки культивировали с липосомами 6 или 15 ч, после чего анализировали на проточном цитометре FACSCalibur ("BD Bioscience", США). Эффективность трансфекции оценивали по средней интенсивности флюоресценции (СИФ) в канале FL-1.
В остальных опытах период трансфекции составлял 15 ч. По его окончании среду с липосомами замещали на свежую среду, содержащую 20 нг/мл ГМ-КСФ. Для определения экспрессии мРНК и TLR2, NOD1, NOD2 клетки лизировали в TRI Reagent ("Sigma", США) через 48 ч после начала трансфекции. Для определения поверхностной экспрессии TLR2 клетки трипсинизировали в различные сроки после начала трансфекции, окрашивали фикоэритринмеченными антителами к TLR2 ("eBioscience", США) и анализировали на проточном цитометре FACSCalibur.
Ответ МФ на стимуляцию ГМтри, диГМтетра и ГМДП оценивали через 60 ч после начала трансфекции. ГМтри и диГМтетра использовали в конечной концентрации 10 мкг/мл, ГМДП - 1 мкг/мл [17]. В контрольные лунки стимуляторы не добавляли. Через 12 ч после начала стимуляции собирали супернатант.
2.4. Иммуноферментный анализ (ИФА)
Уровень фактора некроза опухолей (ФНО) в супернатантах МФ исследовали методом сандвич-ИФА с использованием набора фирмы "Цитокин" (Санкт-Петербург) согласно инструкции производителя. Эффект ингибиторов оценивали по остаточной продукции ФНО (ОПфно), которую рассчитывали по формуле:
Таблица 1
Последовательности siRNA против NOD1, NOD2, TLR2 и контрольной siRNA [16]
Мишень Цепь
NOD1 Смысловая
Антисмысловая
NOD2 Смысловая
Антисмысловая
TLR2 Смысловая
Антисмысловая
Контроль Смысловая
Антисмысловая
Последовательность (5’ ^ 3’)* GGGUGAGACCAUCUUCAUCTT GAUGAAGAUGGUCUCACCCTG GGAAUUACCAGUCCCAUUGTT CAAUGGGACUGGUAAUUCCTG GCCUUGACCUGUCCAACAATT UUGUUGGACAGGUCAAGGCTT UUCUCCGAACGUGUCACGU TT ACGUGACACGUUCGGAGAATT
Примечание. * - курсивом выделены дезоксирибонуклеотид-ные остатки.
- 293 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2012
Праймеры, использованные в работе
Ген Праймер Последовательность (5’ ^ 3’) Ампли-кон, п.о.
NOD1 Прямой Обратный CGTGGTCAACACTGACCCAGTGAGC TGACCCCTGCGTCTAGCCGG 329
NOD2 Прямой Обратный ACACCGTCCCAGAGGGCAAGAAG CGAGACTGAGCAGACACCGTGG 179
TLR2 Прямой Обратный TGGTATCTGCAAGGGCAGCTCAG TTCACACACCTCTGTAGGTCACTGTTG 132
GAPDH Прямой Обратный CAGCCTCCCGCTTCGCTCTC ACCAGGCGCCCAATACGACC 143
ОПфно = -
ШО0^
C - C
cmuM+cne^siRNA KOHmp.siRNA
C - C
стим+KOHmp.siRNA KOHmp.siRNA
- концентрация ФНО в присутствии данного
Таблица 2 Накопление FAMsi в МФ происходило только в присутствии Л2000 (рис. 1, а). Эффективность трансфекции МФ зависела от всех четырех вышеперечисленных параметров. При стандартных условиях, рекомендуемых производителем (20 пмоль FAMsi, 1 мкл Л2000), клетки поглощали умеренное количество FAMsi (СИФ от 100 до 450 усл. ед. в зависимости от плотности клеток; рис. 1, б). Снижение дозы FAMsi вдвое, до 10 пмоль, приводило к примерно двукратному снижению СИФ. Однако повышение дозы FAMsi до 40 пмоль при неизменном количестве Л2000 (1 мкл) не сопровождалось повышением СИФ, что указывает на лимитирующую роль дозы Л2000 в доставке FAMsi в клетку. Если количество Л2000 повышали до 2 мкл на лунку при сохранении дозы FAMsi 20 пмоль, то СИФ возрастала примерно в 1,5 раза; если же одновременно удваивали и дозу FAMsi (до 40 пмоль), то СИФ возрастала в 4 раза по срав-
где Cстим ......... .
стимулятора и специфической siRNA; Ц центрация в присутствии стимулятора и контрольной siRNA:
стим+KOHmp.siRNA
C
стим+KOHmp.siRNA
концентрация в присутствии контрольной
siRNA и в отсутствие каких-либо стимуляторов.
2.5. Выделение РНК, обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ)
Общую РНК выделяли из МФ с помощью реактива TRI Reagent ("Sigma", США) согласно инструкции производителя. По 1 мкг РНК подвергали обратной транскрипции с помощью фермента RevertAid и олигодезокситимидинового праймера (все реактивы "Fermentas", Литва). Праймеры для ПЦР-РВ конструировали с помощью программы Primer-BLAST (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi); последовательности указаны в табл. 2. ПЦР-РВ проводили по методу SYBR Green с использованием 2,5x реакционной смеси фирмы "Синтол" с добавлением MgCl2 до 0,5 мМ. Концентрации всех праймеров составляли 400 нМ. Амплификацию проводили на приборе 7300 Real Time PCR System ("Applied Biosystems", США) при следующих условиях: начальная денатурация 5 мин при 95°C, затем 40 циклов денатурации (95°C, 15 с) и гибридизации/элонгации (60°C, 45 с). Специфичность амплификации подтверждали с помощью анализа кривых плавления (наличие единственного пика на графике в координатах "температура - 1-я производная от интенсивности сигнала" в области температур, равных и выше температуры детекции). Экспрессию мРНК NOD1, NOD2 и TLR2 нормализовали по уровню мРНК GAPDH. Относительную экспрессию (ОЭ) мРНК NOD1, NOD2 и TLR2 рассчитывали по методу AAQ:
ОЭ = 2rbACt = 2~((С{ ген обр. ~ Ctген контр. обр.) - (Ct GAPDH обр. - Ct GAPDH контр. обр.)),
где Ct - пороговый цикл; ген - любой исследуемый ген; обр. - любой образец; контр. обр. - контрольный образец, в котором экспрессия мРНК принимается равной единице; в качестве последнего использовали МФ данного донора, трансфицированные контрольной siRNA.
2.6. Статистическая обработка данных
Для сравнения парных измерений использовали непараметрический тест Уилкоксона. Различия считали достоверными при p < 0,05.
+Л2000 (2 мкл) -FAM-si
-Л2000 +Л2000 (2 мкл)
+FAM-si (20 пмоль) +FAM-si (20 пмоль)
&! 9 5
S ю
I8
: о,5% 1 0,2% 1 I 96% 1
J 1 СИФ = 3,5 1 1 СИФ = 3 1 СИФ= 347
FL-1
Результаты
3.1. Отработка условий трансфекции siRNA
Для отработки условий трансфекции использовали FAMsi. Варьировали следующие параметры: 1) количество клеток на лунку (0,5 • 105, 105 или 2 • 105); 2) дозу siRNA на лунку (10, 20 или 40 пмоль); 3) дозу Л2000 на лунку (1 или 2 мкл); 4) время трансфекции (6 или 15 ч). В качестве отрицательного контроля использовали пустые липосомы (без FAMsi) и свободную FAMsi.
Рис. 1. Подбор оптимальных условий для трансфекции МФ siRNA. а - типичная цитометрическая картина МФ, инкубированных 15 ч с Л2000 (левый график) свободным FAMsi (средний график) и комплексами FAMsi и Л2000 (правый график) при плотности клеток 105 на лунку в 24-луночном планшете; указаны проценты позитивных клеток и средняя СИФ клеток в канале FL-1; б - СИФ МФ на канале FL-1 после 15-часовой инкубации при указанных количествах FAMsi, Л2000 и клеток на лунку; стрелками отмечены стандартные условия (20 пмоль FAMsi и 1 мкл Л2000); показан один репрезентативный опыт из трех; в - СИФ МФ в канале FL-1 после 6-часовой или 15-часовой инкубации с указанными количествами FAMsi и Л2000; показаны результаты одного опыта из двух.
- 294 -
врожденный иммунитет
Время после трансфекции, ч
Рис. 2. Подавление экспрессии (нокдаун) TLR2, NOD1 и NOD2 после трансфекции соответствующими siRNA.
а - относительная экспрессия мРНК TLR2, NOD1 и NOD2 через 48 ч после трансфекции указанными siRNA (по данным ПЦР-РВ); б - СИФ поверхностного TLR2 в указанные сроки после трансфекции siRNA против TLR2 (по данным проточной цитометрии). Результат выражен в процентах от экспрессии TLR2 в МФ, трансфицированных контрольной siRNA, в той же точке. а и б - M ± <г, n = 6. Здесь и на рис. 3: * - p < 0,05 в тесте Уилкоксона.
нению со стандартными условиями (см. рис. 1, б). Дозы Л2000 выше 2 мкл на лунку были токсичны для клеток (выраженная зернистость цитоплазмы после 15-часовой инкубации).
Как видно из рис. 1, б, удвоение количества клеток на лунку приводило к примерно двукратному снижению средней интенсивности флюоресценции FAMsi в МФ при том же количестве FAM-si и липофектамина-2000. Кроме того, эффективность трансфекции при 6-часовом режиме была приблизительно втрое ниже, чем при 15-часовом (рис. 1, в).
Среди всех протестированных условий наивысшая эффективность трансфекции МФ при приемлемой плотности клеток и отсутствии токсичности была достигнута при дозе Л2000 2 мкл/лунка, дозе FAMsi 40 пмоль/лунка, плотности клеток 105 на лунку и 15-часовом режиме трансфекции. Доля флюоресцирующих (трансфицированных) клеток при этом составила более 95%. Эти условия были выбраны для нокдауна экспрессии NOD1, NOD2 и TLR2 -трех рецепторов, участвующих в распознавании ПГ и мурамилпептидов.
3.2. Нокдаун экспрессии NOD1, NOD2 и TLR2 с помощью siRNA
С учетом данных B. Opitz и соавт. [15, 16] уровень мРНК TLR2, NOD1 и NOD2 в МФ оценивали через 48 ч после начала трансфекции siRNA (33 ч после удаления липосом). siRNA против TLR2,
NOD1 и NOD2 подавляли экспрессию соответствующих целевых генов примерно на 50% (рис.
2, а). Так, уровень мРНК TLR2 в клетках, трансфицированных siRNA против TLR2, составил 0,5 ± 0,16 уровня той же мРНК в клетках, трансфицированных контрольной siRNA; уровень мРНК NOD1 в клетках, трансфицированных siRNA против NOD1, - 0,49 ± 0,28 контрольного уровня; уровень мРНК NOD2 в клетках, трансфицированных siRNA против NOD2, - 0,54 ± 0,14 контрольного уровня. Подавление экспрессии генов было спец-
ифичным, так как уровень мРНК нецелевых генов в соответствующих клетках достоверно не менялся (см. рис. 2, а).
Исследовали также экспрессию белка TLR2 на поверхности МФ в различные сроки после трансфекции siRNA против TLR2 и контрольной siRNA. Минимум экспрессии TLR2 наблюдался через 60 ч после начала трансфекции специфической siRNA, что составило 61,7 ± 2,0% экспрессии TLR2 клетками, трансфицированными контрольной siRNA, в этой же точке (рис. 2, б). Это время было выбрано для исследования функционального ответа МФ на мурамилпептиды.
3.3. Влияние нокдауна TLR2, NOD1 и NOD2 на продукцию ФНО, индуцированную ГМтри, ГМДП и диГМтетра
ГМтри и ГМДП являются специфическими агонистами соответственно NOD1 и NOD2 [2, 13], тогда как рецепторы, распознающие диГМтетра, не охарактеризованы. Уровень ФНО в супернатантах МФ, трансфицированных контрольной siRNA, составил без стимуляции 11 ± 10 пг/ мл, при стимуляции ГМтри 1382 ± 474 пг/мл, при стимуляции ГМДП 245 ± 191 пг/мл, при стимуляции диГМтетра 283 ± 64 пг/мл.
Продукция ФНО, индуцированная ГМтри, наиболее эффективно ингибировалась siRNA к NOD1 (ОП = 57 ± 10%; рис. 3). NOD1 является специфическим рецептором для ГМтри [2], и степень ингибирования продукции ФНО была сопоставима со степенью подавления экспрессии мРНК NOD1 по данным ПЦР-РВ. Однако siRNA к TLR2 и NOD2 также оказывали небольшое, но статистически достоверное ингибирующее действие на продукцию ФНО, индуцированную ГМтри. Это действие не объяснялось снижением экспрессии мРНК TLR2 и NOD2 в клетках, трансфицированных siRNA к NOD1 (см. рис. 3).
Ответ на ГМДП был подавлен только в МФ, трансфицированных siRNA против NOD2, причем подавление было практически полным (ОПФНО = 2 ± 16%; см. рис. 3). Остальные siRNA не оказывали достоверного влияния на ГМДП-индуцированную продукцию ФНО.
Ответ МФ на димерный мурамилпептид диГМтетра подавляли все три использованные siRNA (см. рис. 3). Более выраженным оказалось действие siRNA к NOD1 (ОПФНО = 27 ± 6%) и к NOD2 (ОПФНО = 28 ± 22%). Эффект siRNA к TLR2 был менее значительным (ОПФНО = 57 ± 19%), однако более выраженным, чем в случае стимуляции ГМтри.
Рис. 3. Остаточная продукция ФНО (ОПФНО) МФ, трансфицированными контрольной или геноспецифическими siRNA и стимулированными ГМтри, ГМДП или диГМтетра. Подробности метода - см. текст. ОПФНО в клетках, трансфицированных контрольной siRNA, равна 100%. M± a, n = 7.
- 295 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2012
Обсуждение
Механизмы распознавания ПГ клетками врожденной иммунной системы до сих пор остаются спорным вопросом. Убедительно показана роль NOD1 и NOD2 в распознавании фрагментов ПГ - мурамилпептидов [2, 7], хотя взаимодействие между NOD-рецепторами и мурамилпептидами до сих пор не продемонстрировано [20]. В конце 1990-х годов была показана также роль TLR2 в распознавании ПГ [18, 19]. В последующем некоторые авторы пытались объяснить способность ПГ активировать TLR2 наличием примесей липопептидов и липотейхоевых кислот в препаратах ПГ [21]. Однако другие авторы показали, что и высокоочищенные препараты ПГ все же активируют TLR2 [4, 14]. Эти противоречия могут объясняться различиями в источниках и методах очистки ПГ, а также различиями в клеточных моделях. В отличие от NOD1 и NOD2 TLR2 распознает полимерный ПГ [4], однако строение минимального фрагмента ПГ, способного активировать TLR2, не охарактеризовано.
Для исследования рецепторного аппарата, участвующего в распознавании мурамилпептидов грамотрицательных бактерий, в том числе димерного мурамилпептида диГМтетра, мы использовали нокдаун рецепторов NOD1, NOD2 и TLR2 в человеческих МФ с помощью siRNA. Преимуществом данного подхода является использование естественных клеток, которые в отличие от искусственно созданных трансгенных клеточных линий имеют все рецепторы, кофакторы и сигнальные молекулы, необходимые для распознавания бактериальных лигандов.
По результатам опытов с FAMsi можно сделать вывод о том, что МФ трансфицируются siRNA (см. рис. 1), сохраняя при этом жизнеспособность. В МФ, трансфицированных геноспецифическими siRNA, экспрессия целевых генов была подавлена в среднем на 50%, при отсутствии изменений экспрессии нецелевых генов (см. рис. 2). На функциональном уровне действие siRNA было также специфичным и либо соответствовало степени подавления экспрессии рецептора, либо превышало ее. Так, нокдаун NOD2 приводил к полному выключению ответа МФ на специфический агонист этого рецептора - ГМДП; при этом нокдаун двух других рецепторов никак не влиял на ГМДП-индуцированную продукцию ФНО (см. рис. 3). Ответ МФ на ГМтри был наиболее значительно снижен при нокдауне NOD1, что согласуется как со степенью подавления экспрессии этого гена (рис. 3), так и с литературными данными по роли NOD1 в распознавании ГМтри [2].
Результаты опытов с siRNA показали, что в распознавании диГМтетра участвуют все три исследованных рецептора. Более существенную роль играют NOD1 и NOD2, нокдаун каждого из которых вызывает 3-4-кратное снижение продукции ФНО в ответ на диГМтетра. Известно, что мурамилпептиды доставляются в цитозоль путем эндоцитоза и последующего транспорта через мембрану эндосом [10, 11]. Мы полагаем, что диГМтетра расщепляется эндосомальными пептидазами до мономерных мурамилпептидов (ГМтри, ГМДП), которые затем транспортируются в цитозоль и распознаются соответствующими рецепторами. Это согласуется с результатами нашего предыдущего исследования, где было показано, что продукция ФНО, индуцированная диГМтетра, подавляется коктейлем ингибиторов протеаз широкого спектра действия [17]. Интересно, что ответ на ГМтри (агонист NOD1) ингибировался при нокдауне NOD2, хотя и в незначительной степени. Эти результаты сопоставимы с данными S. Girardin и соавт. [6, 8], согласно которым мурамилпептид Мтри (ГМтри без остатка GlcNAc) активирует NOD2, хотя и в небольшой степени. Можно предположить, что либо ГМтри обладает некоторым (незначительным) сродством к NOD2, либо такие лизосомальные карбоксипептидазы, как катепсин A, отщепляют терминальный остаток мезо-ДАП, в результате чего часть ГМтри превращается в ГМДП (агонист NOD2).
Наиболее неожиданным оказалось почти двукратное ингибирование ответа на диГМтетра при нокдауне TLR2. В
клетках с нокдауном TLR2 был также незначительно снижен ответ на ГМтри. В связи с этим интересны данные R. Dziar-ski и D. Gupta [4], согласно которым обработка лизоцимом снижает, но не устраняет полностью способность ПГ активировать TLR2. Наши данные позволяют предположить, что эта остаточная активность ПГ может быть обусловлена димерными мурамилпептидами, которые, таким образом, могут рассматриваться как минимальные фрагменты ПГ, способные активировать TLR2. Интересно, что суммарный ингибирующий эффект всех трех siRNA на продукцию ФНО, индуцированную диГМтетра, был больше 100% (см. рис. 3), что указывает на наличие супераддитивных взаимодействий между рецепторами.
Таким образом, метод siRNA-опосредованного нокдауна позволяет добиться специфического подавления экспрессии паттернраспознающих рецепторов в МФ. С помощью этого метода показано, что в распознавании димерного мурамил-пептида диГМтетра участвуют три рецептора: NOD1, NOD2 и TLR2.
Благодарность
Авторы выносят благодарность В. Л. Львову, Н. П. Арбатскому и Б. И. Алхазовой за предоставленные мурамилпеп-тидные препараты. Работа выполнена при финансовой поддержке ООО "Корус Фарм".
ЛИТЕРАТУРА
1. ПащенковМ. В., Попилюк С. Ф., Алхазова Б. И. и др. Иммунобиологические свойства мурамилпептидных фрагментов пептидогликана грамотрицательных бактерий // Иммунология. - 2010. - Т. 31, № 3. - С. 119-125.
2. ChamaillardM., Hashimoto M., Horie Y. et al. An essential role for NOD1 in host recognition of bacterial peptidoglycan containing diaminopimelic acid // Nature Immunol. - 2003. - Vol. 4.
- P. 702-707.
3. Davis K. M., Nakamura S., Weiser J. N. Nod2 sensing of lysozyme-digested peptidoglycan promotes macrophage recruitment and clearance of S. pneumoniae colonization in mice // J. Clin. Invest. - 2011. - Vol. 121. - P. 3666-3676.
4. Dziarski R., Gupta D. Staphylococcus aureus peptidoglycan is a toll-like receptor 2 activator: a reevaluation // Infect. and Immun.
- 2005. - Vol. 73. - P. 5212-5216.
5. Elbashir S. M., Harborth J., Lendeckel W. et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells // Nature. -2001. - Vol. 411. - P. 494-498.
6. Girardin S. E., Boneca I. G., Carneiro L. A. et al. Nod1 detects a unique muropeptide from gram-negative bacterial peptidoglycan // Science. - 2003. - Vol. 300. - P. 1584-1587.
7. Girardin S. E., Boneca I. G., Viala J. et al. Nod2 is a general sensor of peptidoglycan through muramyl dipeptide (MDP) detection // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278. - P. 8869-8872.
8. Girardin S. E., Travassos L. H., Herve M. et al. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2 // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278. - P. 41702-41708.
9. Leber J. H., Crimmins G. T., Raghavan S. et al. Distinct TLR-and NLR-mediated transcriptional responses to an intracellular pathogen // PLoS Pathog. - 2008. - Vol. 4. - P. e6.
10. Lee J., Tattoli I., Wojtal K. A. et al. pH-dependent internalization of muramyl peptides from early endosomes enables Nod1 and Nod2 signaling // J. Biol. Chem. - 2009. - Vol. 284. - P. 23818-23829.
11. Marina-Garcia N., Franchi L., Kim Y. G. et al. Pannexin-1-me-diated intracellular delivery of muramyl dipeptide induces cas-pase-1 activation via cryopyrin/NLRP3 independently of Nod2 // J. Immunol. - 2008. - Vol. 180. - P. 4050-4057.
12. Masumoto J., Yang K., Varambally S. et al. Nod1 acts as an intracellular receptor to stimulate chemokine production and neutrophil recruitment in vivo // J. Exp. Med. - 2006. - Vol. 203. - P. 203-213.
13. Meshcheryakova E., Makarov E., PhilpottD. et al. Evidence for correlation between the intensities of adjuvant effects and NOD2 activation by monomeric, dimeric and lipophylic derivatives of
- 296 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl peptides // Vaccine. -2007. - Vol. 25. - P. 4515-4520.
14. Muller-AnstettM. A., Muller P., Albrecht T. et al. Staphylococcal peptidoglycan co-localizes with Nod2 and TLR2 and activates innate immune response via both receptors in primary murine keratinocytes // PLoS One. - 2010. - Vol. 5. - P. e13153.
15. OpitzB., Forster S., Hocke A. C. et al. Nodl-mediated endothelial cell activation by Chlamydophila pneumoniae // Circ. Res. - 2005. - Vol. 96. - P. 319-326.
16. OpitzB., PuschelA., Beermann W. et al. Listeria monocytogenes activated p38 MAPK and induced IL-8 secretion in a nucleotidebinding oligomerization domain 1-dependent manner in endothelial cells // J. Immunol. - 2006. - Vol. 176. - P. 484-490.
17. Pashenkov M. V., Popilyuk S. F., Alkhazova B. I. et al. Muropeptides trigger distinct activation profiles in macrophages and dendritic cells // Int. Immunopharmacol. - 2010. - Vol. 10. - P. 875-882.
18. Schwandner R., DziarskiR., Wesche H. et al. Peptidoglycan- and lipoteichoic acid-induced cell activation is mediated by toll-like
receptor 2 // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274. - P. 1740617409.
19. Takeuchi O., Hoshino K., Kawai T. et al. Differential roles of TLR2 and TLR4 in recognition of gram-negative and gram-positive bacterial cell wall components // Immunity. - 1999. - Vol. 11. - P. 443-451.
20. Ting J. P., Duncan J. A., Lei Y. How the noninflammasome NLRs function in the innate immune system // Science. - 2010. - Vol. 327. - P. 286-290.
21. Travassos L. H., Girardin S. E., Philpott D. J. et al. Toll-like receptor 2-dependent bacterial sensing does not occur via peptido-glycan recognition // EMBO Rep. - 2004. - Vol. 5. - P. 10001006.
22. Voss E., Wehkamp J., Wehkamp K. et al. NOD2/CARD15 mediates induction of the antimicrobial peptide human beta-defensin-2 // J. Biol. Chem. - 2006. - Vol. 281. - P. 2005-2011.
Поступила 26.07.12
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.849.12.03:616.438].015.44.076.9
А. Н. Митин, В. В. Комогорова, М. М. Литвина, С. В. Шевелев, Н. И. Шарова, А. А. Ярилин
ДИНАМИКА СУБПОПУЛЯЦИй ТИМОЦИТОВ ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ ТИМУСА ПОСЛЕ ОБЛУЧЕНИЯ
ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России (115478, г Москва, Каширское ш., 24, корп. 2)
Исследовали в динамике восстановление популяций и субпопуляций тимуса мышей после общего Y-облучения в дозе 4 Гр. В наибольшей степени ионизирующей радиацией поражается популяция кортикальных CD4+CD8+-тимоцитов, в результате чего изменяется соотношение клеток различных стадий развития в период максимального опустошения органа (на 5-е сутки). Затем общая численность тимоцитов и практически повторяющая ее численность CD4+CD8+-клеток восстанавливаются с двухволновой кинетикой: к 10-м суткам достигается экстренное восстановление, за которым следует вторичная атрофия с минимальным содержанием клеток на 20-е сутки, после чего реализуется окончательное восстановление. двухволновая кинетика, выраженная менее отчетливо, характерна для всех фракций тимоцитов, кроме двух субпопуляций CD-CD8-клеток - DN2 (CD44+CD25+) и DN3 (CD44-CD25+). Вероятно, эти субпопуляции служат источником экстренного восстановления, и их истощение является причиной вторичной атрофии. для периодов опустошения тимуса под прямым влиянием облучения (на 5-е сутки) и на пике вторичной атрофии (на 20-е сутки) характерно снижение соотношения тимоцитов, слабо и сильно экспрессирующих рецепторный комплекс CD3-TCR (CD3lo/CD3hi). Это изменение проявляется также на 60-е сутки после облучения, что рассматривается как ранний признак лучевого старения тимуса.
Ключевые слова: у-облучение, тимус, тимоциты, регенерация, лучевое старение A.N. Mitin, V.V. Komogorova, M.M. Lytvyna, S.V Shevelev, N.I. Sharova, A.A. Yarilin
DYNAMICS OF POPULATIONS THYMOCYTES DURING THE REGENERATION OF THE THYMUS AFTER IRRADIATION
Investigated the dynamics of the recovery of the populations and subpopulations of mice after the General Y-irradiation in the dose of 4 Gy. To the greatest degree of ionizing radiation affects the population of the cortical of CD4+CD8+ thymocytes, as a result of which the ratio changes of the cells of different stages of development in the period of devastation body (5 per day). Then the total number of thymocytes and practically repeated the number of CD4+CD8+ cells is restored with two-wave kinetics: the 10 days is achieved by «emergency» recovery, followed by the secondary atrophy with a minimum content of cells for 20 days, after which implemented the «final» recovery. Double wavelengths kinetics, expressed as clearly, it is characteristic for all factions thymocytes in addition to the two sub-CD-CD8 - cell - DN2 (CD44+CD25+) and DN3 (CD44-CD25+). Probably, these subpopulations are a source of emergency recovery, and their depletion is the cause of secondary atrophy. For periods of devastation thymus under the direct influence of irradiation (5 days) and at the peak of secondary atrophy (20 day) is characteristic of the ratio of thymocytes, weakly and strongly expressing receptor complex CD3-TCR (CD3lo/CD3hi). This change is also evident in the 60 days after the irradiation, which is seen as an early sign of a «radiation» of aging of the thymus.
Keywords: y-irradiation, thymus, thymocytes, regeneration, radiation aging
- 297 -
