CC BY
78
© Коллектив авторов, 2018
Муругина Н.Е.1, Балясова Л.С.1, Будихина А.С.1, Максимчик П.В.2, Дагиль Ю.А.1, Муругин В.В.1, Чкадуа Г.З.3, Пинегин Б.В.1, Пащенков М.В.1
Метаболическое репрограммирование макрофагов при их активации агонистом рецептора NOD1
1 Лаборатория клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115522, Москва, Россия
2 Лаборатория изучения механизмов апоптоза факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», 119991, Москва, Россия
3 Лаборатория экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, 115478, Москва, Россия
Активация клеток иммунной системы сопровождается перестройкой их метаболизма, или метаболическим репрограммированием. Мурамилпептиды - фрагменты пептидогликана бактерий -активируют клетки врожденной иммунной системы через рецепторы NOD1 и/или NOD2. В работе впервые охарактеризованы изменения углеводного и энергетического метаболизма макрофагов человека, активированных агонистом NOD1 - №ацетил-Э-мурамил-Ь-аланил-Э-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновой кислотой (М-триДАП), в сравнении с эффектами агониста рецептора TLR4 -липополисахаридом (ЛПС). По данным анализа метаболизма в реальном времени, оба агониста в течение 1 ч после добавления к клеткам вызывали усиление гликолиза наряду с незначительным снижением потребления кислорода. Влияние обоих агонистов на гликолиз блокировалось ингибитором киназы Akt, но не зависело от активности киназного комплекса mTORC1 и от повышения экспрессии ферментов гликолиза. В отличие от ЛПС М-триДАП практически не индуцировал экспрессию аконитатдекарбоксилазы-1 - фермента, разобщающего цикл Кребса. Влияние 2-дезоксиглюкозы (конкурентного ингибитора гликолиза) и ингибитора Akt на экспрессию цитокинов, индуцированную М-триДАП, было неоднозначным: ингибитор Akt уменьшал экспрессию фактора некроза опухоли (TNF), ИЛ-6 и ИЛ-1 в, тогда как 2-дезоксиглюкоза подавляла экспрессию TNF и ИЛ-6 на ранней стадии (1 ч), но усиливала ее на поздней стадии (4-9 ч) после добавления М-триДАП. Обсуждаются возможные механизмы действия указанных ингибиторов на экспрессию и продукцию цитокинов.
Ключевые слова: макрофаги; метаболическое репрограммирование; гликолиз; мурамилпептиды; NOD1
Статья поступила 19.11.2018. Принята в печать 16.01.2019.
Для цитирования: Муругина Н.Е., Балясова Л.С., Будихина А. С., Максимчик П.В., Дагиль Ю. А., Муругин В.В., Чкадуа Г.З., Пинегин Б.В., Пащенков М.В. Метаболическое репрограммирование макрофагов при их активации агонистом рецептора NOD1. Иммунология. 2019; 40 (1): 5-14. doi: 10.24411/0206-4952-2019-11001.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда № 16-1510314.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Murugina N.E.1, Balyasova L.S.1, Budikhina A.S.1, Maximchik P.V.2, Dagil Yu.A.1, Murugin V.V.1, Chkadua G.Z.3, Pinegin B.V.1, Pashenkov M.V.1
Metabolic reprogramming of macrophages upon activation with a NOD1 receptor agonist
1 Laboratory of Clinical Immunology, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, 115522, Moscow, Russia
2 Laboratory for the study of apoptosis mechanisms of the Faculty of Fundamental Medicine, Lomonosov Moscow State University, 119991, Moscow, Russia
3 Laboratory of Experimental Diagnostics and Biotherapy of Tumors, Research Institute of Pediatric Oncology and Hematology, N.N. Blokhin National Medical Research Centre of Oncology, 115478, Moscow, Russia
Для корреспонденции
Пащенков Михаил Владимирович - доктор медицинских наук, и.о. заведующего лабораторией клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Россия E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-6995-1790
Activation of immune system cells is accompanied by a profound rearrangement of their metabolism, or metabolic reprogramming. Muramyl peptides, which are fragments of bacterial peptidoglycan, activatie innate immune cells through NOD1 and/or NOD2 receptors. Here, we characterize, for the first time, alterations of carbohydrate and energy metabolism of human macrophages activated by a NOD1 agonist, N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-meso-diaminopimelic acid (M-triDAP) in comparison with a TLR4 agonist, lipopolysaccharide (LPS). Real-time analysis of cell metabolism showed that both agonists, within 1 h after addition to cells, boosted glycolysis along with a minor reduction of oxygen consumption.
For correspondence
Pashenkov Mikhail V. -MD, Acting Head of the Clinical Immunology Laboratory, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russia E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-6995-1790
The effect of either agonist on glycolysis was blocked by an Akt kinase inhibitor, but was independent of the mTORCl kinase complex and elevation of glycolytic enzyme expression. Unlike LPS, M-triDAP caused almost no induction of aconitate decarboxylase 1, an enzyme breaking the Krebs' cycle. The effect of 2-deoxyglucose (a competitive inhibitor of glycolysis) and Akt inhibitor on M-triDAP-induced cytokine expression was ambiguous. The Akt inhibitor reduced TNF, IL-6 and IL-ip, expression, whereas 2-DG inhibited TNF and IL-6 expression at an early stage (1 h), but enhanced it at a late stage (4-9 h) after addition of M-triDAP. Mechanisms whereby these inhibitors affect cytokine expression are discussed.
Keywords: imacrophages; metabolic reprogramming; glycolysis; muramyl peptides; NOD1
Received 19.11.2018. Accepted 16.01.2019.
For citation: Murugina N.E., Balyasova L.S., Budikhina A.S., Maximchik P.V., Dagil Yu.A., Murugin V.V., Chkadua G.Z., Pinegin B.V., Pashenkov M.V. Metabolic reprogramming of macrophages upon activation with a nod1 receptor agonist. Immunologiya. 2019; 40 (1): 5-14. doi: 10.24411/0206-4952-2019-11001. (in Russian)
Acknowledgments. The work is executed at financial support of Russian Science Foundation grant No. 16-15-10314. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
При активации клеток врожденной иммунной системы происходит масштабная перестройка их метаболизма, или метаболическое репрограммирование, которое является базисом для других процессов, протекающих в активированных клетках, таких как синтез цитокинов и эффекторных молекул, пролиферация, миграция и т. д. [1, 2]. При этом конкретные характеристики метаболического репрограммирования зависят от вида активирующего стимула. Так, в покоящихся макрофагах основным источником энергии является окислительное фосфорилирование (ОФ). Активация макрофагов по провоспалительному М1-типу, индуцируемая агонистами паттерн-распознающих рецепторов (ПРР) и интерфероном-у, сопровождается переходом клеток на так называемый аэробный гликолиз [1], разобщением цикла Кребса [3] и угнетением ОФ [4]. Активация макрофагов по противовоспалительному М2-типу, индуцируемая интерлейкином-4 (ИЛ-4), характеризуется усилением глутаминолиза и р-окисления жирных кислот [3, 5]. Высказываются предположения, что тип метаболизма не только обеспечивает конкретные функциональные потребности клеток, но и в известной мере определяет направление их активации и дифференци-ровки [6]. Таким образом появляется возможность воздействовать на ход иммунного ответа, влияя на метаболизм клеток иммунной системы [7, 8].
Под аэробным гликолизом понимают такое состояние метаболизма, при котором, несмотря на достаточное поступление кислорода в клетку, основным источником энергии является гликолиз (не требующий присутствия кислорода). Хотя при гликолизе образуются лишь 2 молекулы адено-зинтрифосфата (АТФ) на 1 молекулу глюкозы (в отличие от 30-36 молекул АТФ при окислительном фосфорилиро-вании), АТФ генерируется при гликолизе быстрее, чем при окислительном фосфорилировании, что компенсирует низкую энергоэффективность [9, 10]. Кроме того, продукты гликолиза являются исходным материалом в биосинтетических процессах, интенсивно протекающих в активированных клетках иммунной системы [9]. Переход клеток с ОФ на аэробный гликолиз сопровождается увеличением потребления глюкозы и образования лактата - побочного продукта гликолиза. Перестройка метаболизма глюкозы при активации клеток обеспечивается как минимум двумя
механизмами: быстрым, связанным с внутриклеточным перераспределением ферментов гликолиза, и медленным, связанным с активацией транскрипции генов, кодирующих ферменты гликолиза [11-13]. Аэробный гликолиз рассматривается как метаболическая основа воспаления [1].
Из всего многообразия микробных соединений -агонистов ПРР - для изучения метаболического ре-программирования клеток врожденного иммунитета в основном используется липополисахарид (ЛПС), аго-нист рецептора TLR4 [3, 12, 14-16]. Гораздо меньше известно о перестройке метаболизма под действием агонистов других ПРР. В частности, не изучено метаболическое репрограммирование при активации рецепторов NOD1 и NOD2, агонистами которых являются мура-милпептиды - фрагменты пептидогликана бактерий [17, 18]. Изучение этого вопроса представляет интерес, поскольку мурамилпептиды и их производные являются перспективными иммуностимуляторами и иммунологическими адъювантами.
Мы впервые изучили метаболическое репрограм-мирование макрофагов, индуцированное веществом мурамилпептидной природы. В работе использовался мурамилпептид М-триДАП ^-ацетил-Э-мурамил-L-аланил-D-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновая кислота), который является сильным агонистом NOD1 с небольшой активностью в отношении NOD2 [19, 20]. Веществом сравнения служил ЛПС.
Материал и методы
Реактивы. Рекомбинантный человеческий грануло-цитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) был закуплен у фирмы Miltenyi Biotec (ФРГ), М-триДАП - у Invivogen (США), ЛПС E. coli O111:B4, 2-дезоксиглюкоза (2-ДГ) и олигомицин -у Sigma (США), рапамицин - у Merck Millipore (Франция), ингибиторы Akt-I-1/2, PFK-15 и AZ PFKFB3 67 -у Tocris (США). Полная культуральная среда (ПКС) представляла собой RPMI-1640 (Life Technologies, Великобритания) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Life Technologies) и 10% фетальной телячьей сыворотки (PAA, Австрия).
Получение и стимуляция макрофагов. Культуры макрофагов были получены путем 6-суточного культивирования моноцитов крови доноров с ГМ-КСФ, как было описано ранее [21]. По истечении 6 сут клетки рипсини-зировали, отмывали, подсчитывали и помещали в 24-лу-ночные планшеты (SPL Life Sciences, Республика Корея) в количестве 250 тыс. клеток в 500 мкл ПКС на лунку. Рабочие растворы М-триДАП и ЛПС готовили на ПКС, и по 25 мкл этих растворов добавляли в лунки. Конечная концентрация М-триДАП составляла 10 мкг/мл (данная концентрация определена как оптимальная по результатам более ранних опытов [20, 21]). Конечная концентрация ЛПС составляла 100 нг/мл. В лунки отрицательного контроля добавляли 25 мкл чистой ПКС. Если использовались ингибиторы ферментов, их вносили за 30 мин до добавления стимуляторов. Планшеты инкубировали 24 ч при +37 °C в атмосфере 5% CO2, после чего собирали супернатанты для определения концентраций глюкозы, лактата и фактора некроза опухоли (TNF).
Исследование потребления глюкозы, высвобождения лактата и TNF. Концентрацию глюкозы в куль-туральных супернатантах и в ПКС определяли на биохимическом анализаторе Synchron CX5 Pro (Beckman Coulter, США). Потребление глюкозы (ПГ) одной клеткой за 24 ч рассчитывали по формуле:
ПГ = (CnKÏ, - C ) 5 ■ 10-4 / 250 000,
4 ПКС супернатант'
где 5 ■ 10-4 - объем культуры (в литрах), 25 0000 - количество клеток в культуре.
Результаты нормализовали по количеству клеточного белка, принимая количество белка в нестимулиро-ванной лунке в данном опыте за 100%. Концентрации лактата измеряли колориметрическим методом с помощью набора реактивов фирмы Biovision (США). Высвобождение лактата в расчете на клетку вычисляли аналогично потреблению глюкозы. Уровни TNF в су-пернатантах определяли с помощью иммунофермент-ного анализа, используя наборы реактивов фирмы «Ци-токин» (Cанкт-Петербург, Россия).
Анализ клеточного метаболизма в реальном времени. Скорость закисления внеклеточной среды (extracellular acidification rate - ECAR) и скорость потребления кислорода (oxygen consumption rate - OCR) измеряли на приборе Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent Technologies, США). ECAR и OCR отражают интенсивность, соответственно, гликолиза и митохондриального дыхания. Изменения pH и содержания кислорода фиксируются чувствительными датчиками в тонком слое среды, прилегающем к клеточному монослою. Макрофаги высевали в планшеты Seahorse XF96 (Agilent) в количестве 16 000 клеток на лунку в 80 мкл ПКС. Наутро производили замену ПКС на специальную среду, представляющую собой XF base medium (Agilent) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 11 мМ D-глюкозы (Sigma) и 10% фетальной телячьей сыворотки. После уравновешивания pH в инкубаторе с атмосферным воздухом планшеты переносили в прибор. ECAR и OCR измеряли каждые 9 мин (продолжительность измерений 3 мин). После 3 ба-зальных измерений впрыскивали стимуляторы (растворы
М-триДАП, ЛПС или среды) и делали еще 22 измерения. Ингибиторы ферментов впрыскивали после 3 базальных измерений, после чего делали еще 3-6 измерений, а затем впрыскивали стимуляторы. Результаты нормализовали по клеточному белку. Вычисляли площади под кривыми «время-ответ» (AUC) после добавления стимулов.
Исследование экспрессии генов с помощью поли-меразной цепной реакции обратного транскрипта в реальном времени. Экспрессию генов в М-триДАП-и ЛПС-стимулированных макрофагах анализировали с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени, как было описано ранее [22]. Дизайн прайме-ров осуществляли с помощью онлайн-сервиса Primer-BLAST. Относительную экспрессию (ОЭ) генов рассчитывали по методу 2-ÄÄCt. Референс-образцом, в котором ОЭ всех генов равнялась 1, служили нестимулирован-ные клетки данного донора. В качестве нормировочного гена использовали GAPDH, экспрессия которого была наименее вариабельной из всех исследованных генов. Коэффициент вариации порогового цикла (Ct) для GAPDH в рамках опыта составил 2,18 ± 0,65% (по данным 6 независимых опытов); для сравнения, коэффициент вариации Ct ACTB - другого часто используемого нормировочного гена - составил 3,67 ± 0,6%. Относительную экспрессию самого GAPDH вычисляли по методу 2-ÄCt (без нормировки).
Вестерн-блоттинг. Методика подробно была описана ранее [22]. Для определения киназы Akt, фосфо-рилированных форм Akt (p-T308 и p-S473) и аконитат-декарбоксилазы-1 (ACOD1) использовали поликло-нальные кроличьи антитела производства Cell Signaling Technologies (США), для определения а-тубулина - мышиные моноклональные антитела (клон DM1A) производства Novus Biologicals (США).
Статистика. Все значения p получены с помощью парного /-теста. Для статистической обработки использовали программу GraphPad Instat 3.06 (GraphPad Software, США).
Результаты
Экспрессия TNF, ИЛ-6, ИЛ-lß при стимуляции макрофагов М-триДАП и липополисахаридом. М-триДАП и ЛПС вызывали мощную, примерно сопоставимую секрецию TNF макрофагами (рис. 1, А). Оба стимула индуцировали экспрессию мРНК TNF с максимумом в точке 1 ч, а также мРНК ИЛ-6 и ИЛ-lß с максимумом в точке 4 ч (рис. 1, Б-Г).
Изменения метаболизма глюкозы при стимуляции М-триДАП и липополисахаридом. В процессе гликолиза 1 молекула глюкозы расщепляется до 2 молекул пирувата, при этом образуется 2 молекулы АТФ и потребляются (восстанавливаются) 2 молекулы NAD+. Запасы NAD+ восстанавливаются двумя путями: 1) путем отдачи электронов в митохондриальную дыхательную цепь; 2) в реакции превращения пирувата в лактат, который высвобождается из клетки и приводит к закис-лению среды.
Э
=
105 1
104 -
103 -
•
102 -
•
101 - 1
100 -
If
i
il
3ч
24 ч
О
> М-триДАП ' ЛПС
0 3 6 9 12 15 18 21 24 Время, ч
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Время, ч
> М-триДАП ЛПС
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Время, ч
Рис. 1. Экспрессия провоспалительных цитокинов макрофагами при стимуляции М-триДАП и ЛПС А - уровни TNF в супернатантах макрофагов после 3 и 24 ч культивирования без стимуляторов (0), с М-триДАП (10 мкг/мл) и с ЛПС (100 нг/мл). 18 доноров. Горизонтальные линии в каждой группе - средние значения, пунктирная линия - нижний предел определения в ИФА; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001 (парный t-test); Б - кинетика экспрессии мРНК TNF; В - ИЛ-6; Г - ИЛ-1 ß макрофагами при стимуляции М-триДАП и ЛПС. M ± а, 9 доноров.
3
2
1
0
М-триДАП и ЛПС вызывали сопоставимое по величине повышение скорости закисления среды (ECAR) (рис. 2, А, Б). Это повышение начиналось в течение 1 ч после впрыска стимуляторов и достигало максимума примерно в течение 2 ч с последующим более плавным снижением (см. рис. 2, А). В качестве положительного контроля использовали олигомицин - ингибитор ми-тохондриальной АТФ-синтазы, заставляющий клетку максимально задействовать свой гликолитический резерв. Олигомицин вызывал более быстрое повышение ECAR с выходом на верхнее плато в течение 30-40 мин (см. рис. 2, А). Как видно из рис. 2, А, на пике ответа на М-триДАП и ЛПС клетки практически полностью задействовали гликолитический резерв. В период между 3 и 20 ч после начала стимуляции ECAR не измеряли, однако в макрофагах, исследованных через 20 ч после стимуляции М-триДАП, ECAR оставалась достоверно повышенной, тогда как ЛПС-стимулированные макрофаги по этому показателю не отличались от нестимули-рованных клеток (рис. 2, В).
Так, OCR в первые часы после стимуляции М-триДАП и ЛПС незначительно падала (рис. 2, Г, Д), тогда как в присутствии олигомицина она падала более чем на % (см. рис. 2, Д). Через 20 ч после начала стимуляции М-триДАП-стимулированные макрофаги характеризовались повышенным OCR по сравнению с контрольными нестимулированными клетками, тогда как у ЛПС-стимулированных макрофагов этот показатель не отличался от контроля (рис. 2, Е).
Чтобы подтвердить, что повышение БСАЯ при стимуляции клеток обусловлено именно приростом гликолиза, использовали конкурентный ингибитор гликолиза - 2-ДГ. Добавление 2-ДГ в концентрации 50 мМ (5-кратный избыток по отношению к концентрации глюкозы в культу -ральной среде) приводило к снижению базальной БСАЯ и полной отмене повышения БСАЯ в М-триДАП и ЛПС-стимулированных клетках (рис. 2, Ж). Кроме того, и М-триДАП, и ЛПС вызывали повышение суточного потребления глюкозы примерно на 40% (рис. 2, З), что тоже указывает на интенсификацию гликолиза и согласуется с изменениями БСАЯ. При этом высвобождение лактата достоверно повышалось только при стимуляции ЛПС (рис. 2, И). В ходе гликолиза из 1 моля глюкозы может образоваться 2 моля лактата. Соотношение измеренного количества лактата (см. рис. 2, И) к рассчитанному, исходя из данных по потреблению глюкозы (рис. 2, З) составило 74,5 ± 15,8% у нестимулированных, 63 ± 17,9% у М-триДАП-стимулированных и 87,1 ± 24,6% у ЛПС-стимулированных клеток. Хотя эти различия не были статистически достоверными, наблюдается тенденция к занижению измеренных уровней лактата по сравнению с расчетными при стимуляции М-триДАП. Известно, что лактат может реутилизироваться клетками с превращением в пируват [23, 24]. Поскольку М-триДАП и ЛПС вызывали сопоставимое повышение БСАЯ (т. е. сопоставимое высвобождение лактата; см. рис. 2, А, Б), можно предположить, что у макрофагов,
Время, мин
1601 140 120 100 -806040200
Время, мин
э
Впрыск А: О Среда о М-триДАП Д ЛПС
□ Олигомицин
0 27 54 81 108 135 162 189 216
0 27 54 81 108 135 162 189 216
Впрыск А: О Среда о М-триДАП Д ЛПС
□ Олигомицин
6000-, 5000-^ 4000-^ 3000-
S 2000-У 10003 0 -1000J
Впрыск А - Впрыск В: О Среда - среда о Среда - М-триДАП д Среда - ЛПС « 2-ДГ - среда • 2-ДГ - М-триДАП А 2-ДГ - ЛПС
& -
э
0 27 54 81 108 135 162 189 216 243 270
т
о
с
Время, мин
0
^_^ 50—1
IS
X 40-
s
ш 30-
&
£
20-
а
< о 10-
W
0
4-'
ё-Л*
Через 20 ч
м
с
й О О
Э
Через 20 ч
200-
150-
100-
50-
0
15-
10
5
Рис. 2. Изменения углеводного и энергетического метаболизма макрофагов при стимуляции М-триДАП и ЛПС А - кинетика ECAR и Г - OCR в культурах макрофагов после впрыска среды, М-триДАП (конечная 10 мкг/мл), ЛПС (конечная 100 нг/мл) и олигомицина (конечная 2 мкМ). 1 репрезентативный опыт из 9 (M ± а по 4 повторностям); Б - площади под кинетическими кривыми ECAR и Д - OCR 9 экспериментов; В - значения ECAR и Д - OCR после 20-часового культивирования макрофагов без стимуляторов, с М-триДАП и с ЛПС. 5 экспериментов; Ж - влияние 2-ДГ (50 мМ) на ECAR в базальных условиях и при стимуляции М-триДАП и ЛПС. 1 репрезентативный опыт из 3. З - потребление глюкозы, высвобождение лактата (И) макрофагами за 24 ч в расчете на 1 клетку в базальных условиях и в присутствии М-триДАП и ЛПС (6-12 доноров на точку). На графиках Б, В, Д, Е, З, И значения, полученные у одного и того же донора, для наглядности соединены линиями. Значения достоверности: # -p = 0,07, * -p < 0,05, ** - p < 0,01, *** - p < 0,001 при сравнении с нестимулированными клетками парным t-тестом.
стимулированных М-триДАП, имеется тенденция к повышению утилизации лактата.
Роль киназы Akt и комплекса mTORCl в изменениях метаболизма глюкозы при стимуляции М-триДАП и липополисахаридом. Наблюдаемая по данным ECAR интенсификация гликолиза при стимуляции макрофагов, развивается достаточно быстро, и, видимо, она не связана с изменениями экспрессии генов, по крайней мере на раннем этапе. Быстрое усиление гликолиза в дендритных клетках при стимуляции ЛПС связывают с перераспределением гексокиназы-II из цитозоля на наружную мембрану митохондрий, где этот фермент, катализирующий первую реакцию гликолиза, становится полностью активным [25]. Для связывания гексокиназы-II с митохондриями необходимо ее фосфорилирование по треонину-473, которое осуществляется киназой Akt [12, 26]. По данным вестерн-блоттинга, в макрофагах, стимулированных М-триДАП
и ЛПС, происходило повышение уровня фосфорили-рования Akt по треонину-308 и серину-473 примерно через 0,5-1 ч после начала стимуляции (рис. 3, А), что совпадает по времени с началом роста ECAR (рис. 3, Б). Специфический ингибитор Akt (Akt-I-1/2 [27]) подавлял как базальные показатели гликолиза макрофагов, так и их повышение при добавлении М-триДАП и ЛПС (рис. 3, Б-Д). В целом, эффекты ингибитора Akt на гликолиз в макрофагах аналогичны эффектам 2-ДГ.
Более медленный механизм гликолитического ре-программирования основан на повышении экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза. В этом механизме тоже участвует Akt, которая активирует киназ-ный комплекс mTORC1 с последующей активацией фактора транскрипции HIF-1a, регулирующего экспрессию указанных генов [13]. Мы изучили экспрессию мРНК ряда ферментов, которые либо являются узкими местами гликолитического каскада, либо подвержены
Э
М-триДАП
ЛПС
Время, ч > 0 0,5 1 2 4 0,5 1 2 4 p-Akt t (T308) p-Akt (S473) Общая щ Akt
э
60
? 50-l м
Ä 40-
Я
H30 * 20-
< 10-W 0
Впрыск А - Впрыск В: О Среда - среда о Среда - М-триДАП д Среда - ЛПС ■ АШ-1/2 - среда с АШ-1/2 - М-триДАП . АШ-1/2 - ЛПС
0 27 54 81 108 135 162 189 216 243 270
э
к
p
о
A
jj
К m 2 ffl § ь
X X й Й-и Ё ^ О Рм IS S н С
э
Х>С
УХ
160-,
s I 140 ¡2 3 120
§ 100
« 53
Я (о 80-
и , о
60
б е
S
40
Х>С
УХ
1,2 -
1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 -0,4
• •
% й 200 -2 й я 5
I: Ч : !■
Ii
Время, мин
Ц 3 100
еа
иб 50
н
g Ь § р 0 4
1 ч
10 ч
У'/ ^ ^
Ва
I j
- *
* *
* *
Щ1-
ан
g =а 300-
s «3 200-н
ч ^
К графикам В-Д: □ Среда I М-триДАП I ЛПС
К графикам Ж-З: □ Среда ■ М-триДАП
150
5000
4000
3000
2000
9. 1000
0
250-,
150 -
100 -
50 -
0
Рис. 3. Роль киназ Akt, mTORC1 и PFKFB3 в метаболическом репрограммировании макрофагов под действием М-триДАП и ЛПС А - кинетика фосфорилирования Akt по треонину-308 и серину-473 при стимуляции (1 репрезентативный опыт из 3); Б - влияние специфического ингибитора Akt (Akt-I-1/2, 10 мкМ) на параметры ECAR (1 опыт из 4); В - площади под кинетическими кривыми ECAR в присутствии Akt-I-1/2 (10 мкМ) и рапамицина (10 нМ); Г - влияние Akt-I-1/2 и рапамицина на 24-часовое потребление глюкозы и Г - высвобождение лактата в базальных условиях и в присутствии М-триДАП и ЛПС (M ± а, 4 донора). Значения достоверности на графиках В, Г, Д указаны по отношению к клеткам, культивированным с тем же стимулятором, но без ингибиторов (* -p < 0,05, ** - p < 0,01, *** - p < 0,001, парный t-тест); Е - экспрессия мРНКPFKFB3 при стимуляции М-триДАП и ЛПС (11 доноров); значения достоверности указаны по отношению к нестимулированным клеткам (** - p < 0,01, *** - p < 0,001); Ж - влияние специфических ингибиторов PFKFB3 (AZ PFKFB3 67 [AZ] и PFK15 [PFK]) на 24-часовое потребление глюкозы (Ж) и З - высвобождение лактата в базальных условиях и при стимуляции М-триДАП (M ± а, 4 донора). Значения достоверности на графиках Ж и З указаны по отношению к клеткам, культивированным с тем же стимулятором, но без ингибиторов (* -p < 0,05, ** -p < 0,01, *** -p < 0,001, парный t-тест).
транскрипционной регуляции при активации клеток [13]. Экспрессия генов гексокиназ (HK1, HK2, HK3), L-и M-субъединиц фосфофруктокиназы-1 (PFKL, PFKM), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), M1-и М2-изоформ пируваткиназы (PKM1 и PKM2), а также М-субъединицы лактатдегидрогеназы (LDHA) после 1, 10 и 24 ч стимуляции макрофагов М-триДАП и ЛПС не изменялась (данные не показаны). Кроме того, рапами-цин - специфический ингибитор mTORC1 - не влиял на базальные и стимулированные параметры гликолиза (рис. 3, В-Д), что исключает роль сигнального пути Akt - mTORC1 - HIF-1a в изменениях гликолиза, наблюдаемых при стимуляции макрофагов в наших экспериментах.
Роль фермента РЖЕЖИЗ в изменениях метаболизма глюкозы. По данным литературы, существенную роль в метаболическом репрограммировании играет фермент РРКРВЗ, или индуцибельная 6-фосфофрукто-2-киназа/фруктозо-2,6-бисфосфатаза [11, 28]. Этот фермент не участвует в основном гли-колитическом каскаде, но катализирует превращение фруктозо-6-фосфата (одного из промежуточных продуктов гликолиза) во фруктозо-2,6-бисфосфат; последний аллостерически активирует фосфофруктоки-назу-1 - третий фермент гликолитического каскада, что приводит к стимуляции гликолиза. В наших экспериментах достоверное повышение экспрессии PFKFB3 в М-триДАП-стимулированных клетках отмечалось
в точке 1 ч, а в ЛПС-стимулированных - в точках 1 и 10 ч (рис. 3, Е). Однако два высокоспецифичных ингибитора PFKFB3 (AZ PFKFB3 67 и PFK15 [29, 30]) не повлияли на ECAR (данные не показаны), а один из ингибиторов даже повысил потребление глюкозы макрофагами в базальных условиях и при стимуляции М-триДАП (рис. 3, Ж). Таким образом, роль PFKFB3 в гликолитиче-ском репрограммировании макрофагов остается неясной.
Влияние 2-ДГ и ингибитора Akt на экспрессию провоспалительных цитокинов. Эффект 2-ДГ на продукцию TNF оказался двунаправленным, что было для нас несколько неожиданным. На раннем этапе активации (3 ч) 2-ДГ в концентрации 50 мМ ингибиро-вала секрецию TNF, индуцированную М-триДАП и ЛПС, тогда как на позднем этапе (24 ч) - напротив, вызывала повышение уровней TNF в супернатантах (рис. 4, А). Оба эффекта 2-ДГ были дозозависимыми и проявлялись также в концентрациях 10 и 2 мМ (данные не показаны). Иная картина наблюдалась при использовании Akt-I-1/2: этот ингибитор подавлял М-триДАП-индуцированную продукцию TNF как на
ранних, так и на поздних сроках, но не влиял на ЛПС-индуцированную продукцию TNF (рис. 4, Б).
Влияние 2-ДГ на экспрессию мРНК цитокинов тоже было двунаправленным (рис. 4, В). 2-ДГ ингибиро-вала раннюю экспрессию TNF, ИЛ-6 и ИЛ-ф (через 1 ч после добавления М-триДАП и ЛПС). Однако в более поздние сроки (4 и 9 ч) 2-ДГ усиливала М-триДАП- и ЛПС-индуцированную экспрессию TNF, а также М-триДАП-индуцированную экспрессию ИЛ-6, тогда как ингибирую-щий эффект 2-ДГ на ЛПС-индуцированную экспрессию ИЛ-6 и на экспрессию ИЛ-ф, наблюдавшийся на ранних сроках, на более поздних сроках исчезал. Фактически в присутствии 2-ДГ экспрессия провоспалительных цито-кинов, в частности TNF, не подавлялась, а смещалась на более поздние сроки после активации клетки.
Ингибитор Akt-I-1/2 подавлял экспрессию мРНК ИЛ-6 и в меньшей степени TNF и HH-1ß, в М-триДАП-стимулированных клетках на раннем сроке активации (1 ч), не влияя на эти показатели на более поздних сроках (рис. 4, Г). Akt-I-1/2 не влиял на ЛПС-индуцированную экспрессию мРНК цитокинов (см. рис. 4, Г), что согласуется с данными по секреции TNF (см. рис. 4, Б).
Э
э
Z
102
2-ДГ > - +
х
104
103
102
Э
I а.
х
s-
О
3 ч
- + 24 ч
- + 3 ч
- + 24 ч
Akt-l-1/2 > - + 3 ч
- + 24 ч
М-триДАП
- + 3 ч
- + 24 ч
ЛПС
М-триДАП
ЛПС
ИЛ-lß
О Среда о М-триДАП « Akt+М-триДАП д ЛПС А Akt+ЛПС
02468 10 02468 10 02468 10 Время, ч Время, ч Время, ч
I
Рч
S
ИЛ-lß
О Среда о М-триДАП • Akt+М-триДАП д ЛПС ж Akt+ЛПС
3
2
0
Ё5 02468 10 02468 10 02468 10
Время, ч Время, ч Время, ч
Рис. 4. Влияние 2-ДГ (50 мМ) и Akt-I-1/2 (10 мкМ) на продукцию и экспрессию провоспалительных цитокинов макрофагами, стимулированными М-триДАП и ЛПС
А - влияние 2-ДГ; Б - Akt-I-1/2 на уровни TNF в супернатантах макрофагов через 3 и 24 ч после добавления М-триДАП и ЛПС. От 6 до 16 доноров на точку. В - влияние 2-ДГ; Г - Akt-I-1/2 на кинетику экспрессии мРНК TNF, ИЛ-6 и ИЛ-lß при стимуляции М-триДАП и ЛПС (M± а, 3 донора). Значения достоверности на графиках В и Г: * - p < 0,05, ** - p < 0,01, *** - p < 0,001 при сравнении с макрофагами в той же точке, стимулированными М-триДАП в отсутствие ингибиторов; # -p < 0,05, ## -p < 0,01 при сравнении с макрофагами в той же точке, стимулированными ЛПС в отсутствие ингибиторов.
э
Время, ч > ACOD1
a-tubulin
М-триДАП ЛПС
0 1 2 4 10 24 0 1 2 4 10 24
э
S Q
§ CD ч <
э
1-1-1-1-1
0 5 10 15 20 25
-г
2 4 6 8 10
Время, ч
Время, ч
• М-триДАП
* ЛПС
Рис. 5. Экспрессия АСОБ1 и МХ1 макрофагами при стимуляции М-триДАП и ЛПС
А - кинетика экспрессии белка ЛСОБ1 (вестерн-блоттинг), 1 репрезентативный опыт из 3; Б, В - кинетика экспрессии мРНКЛСОБ1 и МХ1 при стимуляции М-триДАП и ЛПС (М ± а, 6 доноров); ** - р<0,01 при сравнении М-триДАП- и ЛПС-стимулированных макрофагов в данной точке.
Индукция экспрессии аконитатдекарбоксилазы-1 (АСОБ1). Характерной чертой метаболического ре-программирования макрофагов при стимуляции ЛПС является индукция гена ЛСОБ1 (другое название -ГО.01) [31]. Фермент АСОБ1 декарбоксилирует цис-аконитат - один из метаболитов цикла Кребса - с образованием итаконата [31]. Поскольку нормальный ход цикла Кребса предполагает превращение цис-аконитата в изоцитрат и далее в а-кетоглутарат, то вследствие активности АСОБ1 цикл Кребса прерывается (за счет изъятия цис-аконитата), возобновляясь со стадии а-кетоглутарата, запасы которого пополняются благодаря глутаминолизу [3]. Итаконат обладает выраженной антимикробной активностью [31], ингибирует сукцинатдегидрогеназу, вызывая второй разрыв цикла Кребса [16, 32], а также ингибирует экспрессию ИЛ-1Р [16, 33].
В нестимулированных макрофагах экспрессия белка АСОБ1 не определялась (рис. 5, А). При стимуляции макрофагов ЛПС наблюдалась мощная индукция мРНК и белка АСОБ1 (рис. 5, А, Б), что согласуется с литературными данными. В макрофагах, стимулированных М-триДАП, уровни мРНК АСОБ1 были на порядок ниже, а белок АСОБ1 присутствовал лишь в следовых количествах (см. рис. 5, А, Б).
По данным литературы, для индукции экспрессии АСОБ1 необходимо аутокринное действие интерферо-нов I типа [33]. Поэтому мы изучили экспрессию МХ1 -интерферон-индуцибельного гена, являющегося маркером эндогенной продукции интерферонов. При стимуляции ЛПС наблюдалось повышение экспрессии МХ1 через 4 ч и позже (рис. 5, В), что, вероятно, объясняется индукцией выработки интерферона-Р через ТШР-зависимый сигнальный путь. В макрофагах, стимулированных М-триДАП, экспрессия МХ1 не менялась (рис. 5, В). Таким образом, экспрессия АСОБ1 действительно коррелирует с отсутствием/наличием индукции эндогенных интерферонов. Однако из рис. 5 видно, что повышение мРНК АСОБ1 до максимального уровня происходило уже через 1 ч после добавления стимуляторов (т. е. раньше повышения мРНК МХ1), что не может быть объяснено аутокринным действием интерферонов, для выработки которых требуется не менее 2-3 ч.
Обсуждение
Проведенная работа показала, что характеристики метаболического репрограммирования макрофагов, активированных агонистом NOD1 (М-триДАП) и стандартным стимулом (ЛПС), во многом схожи. По данным анализа метаболизма в реальном времени, оба агониста вызывают быстрый прирост гликолиза наряду с незначительным снижением потребления кислорода, что может расцениваться как активация аэробного гликолиза. Влияние обоих агонистов на гликолиз зависит от активности киназы Akt, но не зависит от активности комплекса mTORC1 и повышения экспрессии ферментов гликолиза. Указанные процессы, вероятно, являются стереотипным ответом клеток врожденного иммунитета на стимуляцию ПРР [12], хотя выраженность ответа может зависеть от вида и дозы стимула. В то же время выявлены особенности метаболического репрограмми-рования, индуцированного агонистом NOD1 по сравнению с ЛПС: 1) более устойчивое повышение ECAR, сохраняющееся спустя 20 ч после добавления агониста; 2) тенденция к утилизации высвобождаемого клетками лактата; 3) практическое отсутствие индукции ACOD1 и, следовательно, сохранение непрерывности цикла Кребса. Возможно, эти особенности связаны между собой: поскольку поглощаемый клеткой лактат метаболи-зируется в цикле Кребса, непрерывность цикла может способствовать переработке больших количеств лактата М-триДАП-стимулированными клетками по сравнению с ЛПС-стимулированными.
Особый интерес представляет связь между параметрами гликолиза и экспрессией провоспалительных цитокинов. В нашей работе гликолиз в макрофагах ингибировали два соединения: 2-ДГ и ингибитор Akt. Однако их эффект на экспрессию TNF, ИЛ-6 и HH-1ß оказался неодинаков и неоднозначен. Это заставляет предполагать, что влияние 2-ДГ и ингибитора Akt на экспрессию цитокинов обусловлено не только и не столько ингибированием гликолиза, сколько воздействием на другие процессы и сигнальные пути. Так, ингибитор Akt снижал М-триДАП-индуцированную экспрессию TNF, ИЛ-6 и ИЛ-Щ но практически не влиял на ЛПС-индуцированную экспрессию этих же цитоки-
нов. Известно, что киназа Akt участвует в различных сигнальных путях, связанных с активацией и диффе-ренцировкой макрофагов [34], хотя о вовлеченности Akt в сигнальные пути от рецепторов NOD1 и NOD2 до сих пор не сообщалось.
2-ДГ подавляла раннюю стадию экспрессии цитоки-нов при активации клеток М-триДАП и ЛПС, но усиливала позднюю стадию, фактически сдвигая экспрессию цитокинов на более поздний срок после начала активации. Литературные данные о влиянии 2-ДГ на продукцию цитокинов противоречивы. Сообщалось как об ингибирующем [12, 35-37], так и об усиливающем [38] действии 2-ДГ на ЛПС-индуцированную продукцию TNF и ряда других цитокинов, а также об отсутствии эффекта [39]. Описания ингибирующего действия 2-ДГ также противоречивы. По данным B. Everts и соавт., 2-ДГ не влияет на экспрессию мРНК TNF, ИЛ-6 и ряда других цитокинов при 3-часовой активации мышиных дендритных клеток ЛПС, но ингибирует секрецию этих цитокинов, что указывает на избирательное действие 2-ДГ на посттранскрипционные этапы продукции цитокинов [12]. Однако по данным Na и соавт., в мышиных макрофагах ингибируется также ЛПС-индуцированная
■ Литература/References
1. O'Neill L.A., Pearce E.J. Immunometabolism governs dendritic cell and macrophage function. J. Exp. Med. 2015; 213 (1): 15-23.
2. Buck M.D., O'Sullivan D., Pearce E.L. T cell metabolism drives immunity. J. Exp. Med. 2015; 212 (9): 1345-60.
3. Jha A.K., Huang S.C., Sergushichev A., Lampropoulou V. et al. Network integration of parallel metabolic and transcriptional data reveals metabolic modules that regulate macrophage polarization. Immunity. 2015; 42 (3): 419-30.
4. Mills E.L., Kelly B., Logan A., Costa A.S.H. et al. Succinate dehydrogenase supports metabolic repurposing of mitochondria to drive inflammatory macrophages. Cell. 2016; 167 (2): 457-70.e13.
5. Huang S.C., Everts B., Ivanova Y., O'Sullivan D. et al. Cell-intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nat. Immunol. 2014; 15 (9): 846-55.
6. Van den Bossche J., O'Neill L.A., Menon D. Macrophage immunometabolism: where are we (going)? Trends Immunol. 2017; 38 (6): 395-406.
7. Stienstra R., Netea-Maier R.T., Riksen N.P., Joosten L.A.B. et al. Specific and complex reprogramming of cellular metabolism in myeloid cells during innate immune responses. Cell Metab. 2017; 26 (1): 142-56.
8. Ip W.K.E., Hoshi N., Shouval D.S., Snapper S. et al. Antiinflammatory effect of IL-10 mediated by metabolic reprogramming of macrophages. Science. 2017; 356 (6337): 513-9.
9. Vander Heiden M.G., Cantley L.C., Thompson C.B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 2009; 324 (5930): 1029-33.
10. Diskin C., Palsson-McDermott E.M. Metabolic modulation in macrophage effector function. Front Immunol. 2018; 9: 270.
11. Tannahill G.M., Curtis A.M., Adamik J., Palsson-McDermott E.M. et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL-1beta through HIF-1alpha. Nature. 2013; 496 (7444): 238-42.
12. Everts B., Amiel E., Huang S.C., Smith A.M. et al. TLR-driven early glycolytic reprogramming via the kinases TBK1-IKKvarepsilon supports the anabolic demands of dendritic cell activation. Nat. Immunol. 2014; 15 (4): 323-32.
экспрессия мРНК TNF, ИЛ-6 и ИЛ-ф, на ранних этапах активации (1-4 ч) [37]. Возможно, наблюдаемые различия в эффектах 2-ДГ зависят от вида животных, типа клеток, а также от времени, прошедшего после добавления агонистов ПРР, о чем говорят и данные настоящей работы. Механизмы действия 2-ДГ как ингибитора гликолиза на экспрессию цитокинов могут быть разнообразны. В частности, ферменты гликолиза GAPDH и PKM2 могут транслоцироваться в ядро и выступать в качестве непосредственных транскрипционных и посттранскрипционных регуляторов экспрессии цитокинов, причем данная функция GAPDH и PKM2 зависит от интенсивности гликолиза [36, 40]. Позднее усиливающее влияние 2-ДГ на экспрессию цитокинов может реализовываться через создание оксидативного стресса в клетке [41], однако этот вопрос нуждается в дальнейшем изучении.
Таким образом, в работе впервые охарактеризованы изменения углеводного и энергетического метаболизма макрофагов при их активации веществом мурамилпеп-тидной природы. Показана неоднозначность влияния ингибиторов гликолиза на продукцию и экспрессию провоспалительных цитокинов.
13. Cheng S.C., Quintin J., Cramer R.A., Shepardson K.M. et al. mTOR- and HIF-1 alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 2014; 345 (6204): 1250684.
14. Krawczyk C.M., Holowka T., Sun J., Blagih J. et al. Toll-like receptor-induced changes in glycolytic metabolism regulate dendritic cell activation. Blood. 2010; 115 (23): 4742-9.
15. Meiser J., Kramer L., Sapcariu S.C., Battello N. et al. Pro-inflammatory macrophages sustain pyruvate oxidation through pyruvate dehydrogenase for the synthesis of itaconate and to enable cytokine expression. J Biol Chem. 2016; 291 (8): 3932-46.
16. Lampropoulou V., Sergushichev A., Bambouskova M., Nair S. et al. Itaconate links inhibition of succinate dehydrogenase with macrophage metabolic remodeling and regulation of inflammation. Cell Metab. 2016; 24 (1): 158-66.
17. Girardin S.E., Boneca I.G., Carneiro L.A., Antignac A. et al. Nod1 detects a unique muropeptide from gram-negative bacterial peptidoglycan. Science. 2003; 300 (5625): 1584-7.
18. Chamaillard M., Hashimoto M., Horie Y., Masumoto J. et al. An essential role for NOD1 in host recognition of bacterial peptidoglycan containing diaminopimelic acid. Nat Immunol. 2003; 4 (7): 702-7.
19. Dagil Y.A., Arbatsky N.P., Alkhazova B.I., L'Vov V L. et al. The dual NOD1/NOD2 agonism of muropeptides containing a meso-diaminopimelic acid residue. PLoS One. 2016; 11 (8): e0160784.
20. Дагиль Ю.А., Арбатский Н.П., Алхазова Б.И., Львов В. Л. и др. Структурные особенности селективных и неселективных агонистов NOD-рецепторов. Мед. иммунология. 2017; (19): 705-14. [Dagil Yu.A., Arbatsky, N.P., Alkhazova, B.I., L'vov, V.L. et al. Structural features of selective and non-selective NOD receptor agonists. Meditsinskaya immunologiya [Medical Immunology]. 2017; (19): 705-14. (in Russian)]
21. Pashenkov M.V., Popilyuk S.F., Alkhazova B.I., L'Vov V.L. et al. Muropeptides trigger distinct activation profiles in macrophages and dendritic cells. Int Immunopharmacol. 2010; 10 (8): 875-82.
22. Pashenkov M.V., Balyasova L.S., Dagil Y.A., Pinegin B.V. The role of the p38-MNK-eIF4E signaling axis in TNF production downstream of the NOD1 receptor. J. Immunol. 2017; 198 (4): 1638-48.
23. Rogatzki M.J., Ferguson B.S., Goodwin M.L., Gladden L.B. Lactate is always the end product of glycolysis. Front Neurosci. 2014; 9: 22.
24. Hahn E.L., Halestrap A.P., Gamelli R.L. Expression of the lactate transporter MCT1 in macrophages. Shock. 2000; 13 (4): 253-60.
25. John S., Weiss J.N., Ribalet B. Subcellular localization of hexokinases I and II directs the metabolic fate of glucose. PLoS One. 2011; 6 (3): e17674.
26. Miyamoto S., Murphy A.N., Brown J.H. Akt mediates mitochondrial protection in cardiomyocytes through phosphorylation of mitochondrial hexokinase-II. Cell Death Differ. 2008; 15 (3): 521-9.
27. Bain J., Plater L., Elliott M., Shpiro N. et al. The selectivity of protein kinase inhibitors: a further update. Biochem. J. 2007; 408 (3): 297-315.
28. Jiang H., Shi H., Sun M., Wang Y. et al. PFKFB3-driven macrophage glycolytic metabolism is a crucial component of innate antiviral defense. J. Immunol. 2016; 197 (7): 2880-90.
29. Boyd S., Brookfield J.L., Critchlow S.E., Cumming I.A. et al. Structure-based design of potent and selective inhibitors of the metabolic kinase PFKFB3. J. Med. Chem. 2015; 58 (8): 3611-25.
30. Clem B.F., O'Neal J., Tapolsky G., Clem A.L. et al. Targeting 6-phosphofructo-2-kinase (PFKFB3) as a therapeutic strategy against cancer. Mol. Cancer Ther. 2013; 12 (8): 1461-70.
31. Michelucci A., Cordes T., Ghelfi J., Pailot A. et al. Immune-responsive gene 1 protein links metabolism to immunity by catalyzing itaconic acid production. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 2013; 110 (19): 7820-5.
32. Cordes T., Wallace M., Michelucci A., Divakaruni A.S. et al. Immunoresponsive gene 1 and itaconate inhibit succinate dehydrogenase to modulate intracellular succinate levels. J. Biol. Chem. 2016; 291 (27): 14 274-84.
33. Mills E.L., Ryan D.G., Prag H.A., Dikovskaya D. et al. Itaconate is an anti-inflammatory metabolite that activates Nrf2 via alkylation of KEAP1. Nature. 2018; 556 (7699): 113-7.
34. Vergadi E., Ieronymaki E., Lyroni K., Vaporidi K. et al. Akt Signaling pathway in macrophage activation and M1/M2 polarization. J. Immunol. 2017; 198 (3): 1006-14.
35. Dietl K., Renner K., Dettmer K., Timischl B. et al. Lactic acid and acidification inhibit TNF secretion and glycolysis of human monocytes. J Immunol. 2010; 184 (3): 1200-9.
36. Hu K., Yang Y., Lin L., Ai Q. et al. Caloric restriction mimetic 2-Deoxyglucose alleviated inflammatory lung injury via suppressing nuclear pyruvate kinase M2-signal transducer and activator of transcription 3 pathway. Front Immunol. 2018; 9: 426.
37. Na Y.R., Gu G.J., Jung D., Kim Y.W. et al. GM-CSF induces inflammatory macrophages by regulating glycolysis and lipid metabolism. J. Immunol. 2016; 197 (10): 4101-9.
38. Miller E.S., Koebel D.A., Sonnenfeld G. The metabolic stressor 2-deoxy-D-glucose (2-DG) enhances LPS-stimulated cytokine production in mice. Brain Behav Immun. 1993; 7 (4): 317-25.
39. Wang A., Huen S.C., Luan H.H., Yu S. et al. Opposing effects of fasting metabolism on tissue tolerance in bacterial and viral inflammation. Cell. 2016; 166 (6): 1512-25.e12.
40. Millet P., Vachharajani V., McPhail L., Yoza B. et al. GAPDH binding to TNF-alpha mRNA contributes to posttranscriptional repression in monocytes: a novel mechanism of communication between inflammation and metabolism. J. Immunol. 2016; 196 (6): 2541-51.
41. Shutt D.C., O'Dorisio M.S., Aykin-Burns N., Spitz D.R. 2-deoxy-D-glucose induces oxidative stress and cell killing in human neuroblastoma cells. Cancer Biol. Ther. 2010; 9 (11): 853-61.
