Структурные особенности селективных и неселективных агонистов NOD-рецепторов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Medical Immunology (Russia)/ Медицинская иммунология ОрЫгЫНаЛЬНЬ1@ C^fttt^ftbW Meditsinskaya Immunologiya 2017, Т. 19, № 6, стр. 705-714 * ^ . . . . . 2017, Vol. 19, No 6, pp. 705-714

© 2017, СПбРО РААКИ Original articles © 2017, SPb RAACI

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СЕЛЕКТИВНЫХ И НЕСЕЛЕКТИВНЫХ АГОНИСТОВ NOD-РЕЦЕПТОРОВ

Дагиль Ю.А., Арбатский Н.П., Алхазова Б.И., Львов В.Л., Пащенков М.В.

ФГБУ «Государственный научный центр „Институт иммунологии "» ФМБА России, Москва, Россия

Резюме. Мурамилпептиды — фрагменты бактериального пептидогликана, играющие важную роль в активации врожденной иммунной системы. Основой структуры мурамилпептидов является остаток N-ацетилмурамовой кислоты (MurNAc), с которым ковалентно связан пептид длиной 2-5 аминокислотных остатков. Первой аминокислотой пептида обычно является L-аланин, второй — D-изоглутамин или D-изоглутаминовая кислота, в четвертой и пятой — D-аланин. Наиболее вариабелен третий аминокислотный остаток, который у грамположительных бактерий чаще всего представлен L-лизином или L-орнитином, а у грамотрицательных — мезо-диаминопимелиновой кислотой (meso-DAP). Мурамилпептиды являются перспективными иммуностимуляторами и адъювантами. Известно, что основную роль в их распознавании играют рецепторы NOD1 и NOD2. Однако данные о рецепторной специфичности ряда распространенных мурамилпептидов отсутствуют или являются неполными.

Цель: расширить представления о взаимосвязи между структурой природных и химически модифицированных мурамилпептидов и их селективностью по отношению к рецепторам NOD1 и NOD2.

Исследовали способность природных мурамилпептидов и их производных активировать рецепторы NOD1 и NOD2 человека, для чего использовали новую биологическую тест-систему — модифицированные клетки HEK293T с NF-кВ-зависимой экспрессией репортерного гена (люциферазы) и нокаутами собственных генов NOD1 и/или NOD2.

Показано, что рецептор NOD2 имеет более широкий спектр естественных агонистов, чем полагали ранее. В частности, NOD2 распознает мурамилпептиды грамотрицательных бактерий, содержащие остаток meso-DAP, ранее считавшиеся неактивными по отношению к этому рецептору. Рецептор NOD1 распознает только мурамилпептиды, содержащие остаток meso-DAP, однако этот остаток может находиться не только в концевом положении, как считалось ранее, но и внутри пептидной цепи. Из этих данных следует, что природные мурамилпептиды, содержащие остаток meso-DAP, обладают двойной рецепторной специфичностью (NOD1 и NOD2), т.е. являются неселективными агонистами NOD-рецепторов. Разрушение остатка MurNAc устраняет активность этих мурамилпептидов в отношении NOD2, но не влияет на активность в отношении NOD1. Таким образом, модифицированные мурамилпептиды, у которых разрушен остаток MurNAc и имеется остаток meso-DAP, являются селективными агонистами NOD1. Природные мурамилпептиды, имеющие интактный остаток MurNAc и не содержащие остатка meso-DAP, являются селективными агонистами NOD2.

Адрес для переписки:

Пащенков Михаил Владимирович

ФГБУ «Государственный научный центр „Институт

иммунологии"» ФМБА России

115478, Россия, Москва, Каширское шоссе, 24.

Тел.: 8(499) 617-76-49.

Факс: 8(499) 617-10-27.

E-mail: mvpashenkov@yandex.ru

Образец цитирования:

Ю.А. Дагиль, Н.П. Арбатский, Б.И. Алхазова, В.Л. Львов, М.В. Пащенков «Структурные особенности селективных и неселективньк агонистов NOD-рецеnторов //Медицинская иммунология, 2017. Т. 19, № 6. С. 705-714. doi: 10.15789/1563-0625-2017-6-705-714 ©Дагиль Ю.А и соавт., 2017

Address for correspondence:

Pashenkov Mikhail V.

National Research Center "Institute of Immunology", Federal

Medical-Biological Agency of Russia

115478, Russian Federation, Moscow, Kashirskoe rd, 24.

Phone: 7(499) 617-76-49.

Fax: 7 (499) 617-10-27.

E-mail: mvpashenkov@yandex.ru

For citation:

Yu.A. Dagil, N.P. Arbatsky, B.I. Alkhazova, V.L. Lvov, M.V. Pashenkov "Structural features of selective and nonselective NOD receptor agonists", Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya, 2017, Vol. 19, no. 6, pp. 705-714. doi: 10.15789/1563-0625-2017-6-705-714

DOI: 10.15789/1563-0625-2017-6-705-714

Выводы: 1) охарактеризованы основные структурные особенности селективных агонистов NOD1 и NOD2, а также неселективных агонистов NOD-рецепторов; 2) показана значимость вновь полученных данных для регуляции врожденного иммунного ответа и создания новых иммуностимуляторов мурамилпептидной природы.

Ключевые слова: мурамилпептиды, NOD1, NOD2, мезо-диаминопимелиновая кислота, N-ацетилмурамовая кислота, хемилюминесценция, CRISPR/Cas9

STRUCTURAL FEATURES OF SELECTIVE AND NONSELECTIVE NOD RECEPTOR AGONISTS

Dagil Yu.A., Arbatsky N.P., Alkhazova B.I., Lvov V.L., Pashenkov M.V.

National Research Center "Institute of Immunology", Federal Medical-Biological Agency of Russia, Moscow, Russian Federation

Abstract. Muramyl peptides are fragments of bacterial peptidoglycan playing an important role in the activation of innate immune system. Core structure of muramyl peptides is composed of N-acetylmuramic acid residue (MurNAc) covalently bound to a peptide consisting of 2-5 amino acid residues. The first residue in the peptide chain is usually L-alanine, the 2nd is D-isoglutamine or D-isoglutamic acid, the 4th and 5th are D-alanines. The 3rd residue is most variable being represented by L-lysine or L-ornithine in Gram-positive bacteria, or by meso-diaminopimelic acid (meso-DAP) in Gram-negative bacteria. Muramyl peptides are potential immunostimulants and adjuvants. Two receptors, NOD1 and NOD2, are known to play a central role in muramyl peptide recognition. However, the data on NOD receptor specificity for several common muramyl peptides are not available or incomplete.

The goal of this study was to extend knowledge on possible relationships between structure of natural, or chemically modified muramyl peptides, and their selectivity towards NOD1 and NOD2 receptors.

We investigated ability of natural muramyl peptides and their derivatives to activate NOD1 and NOD2. To this end, we used a novel biological test system, which represents modified HEK293T cells with NF-KB-driven reporter gene (luciferase) expression and knock-outs of endogenous NOD1 and/or NOD2 genes. As a result, we have shown that NOD2 has a broader spectrum of natural agonists than previously thought. In particular, NOD2 recognizes muramyl peptides from Gram-negative bacteria containing a meso-DAP residue, which have been considered inactive towards NOD2. NOD1 recognizes only muramyl peptides containing a meso-DAP residue; however, this molecule should not be exposed as a terminal residue, as thought earlier, but it may also be present within the peptide chain. This data imply that natural muramyl peptides containing meso-DAP have a dual receptor specificity (NOD1 and NOD2), i.e. they are non-selective NOD receptor agonists. Destruction of the MurNAc residue eliminates ability of these muramyl peptides to activate NOD2, but has no effect on their NOD1 agonism. Hence, modified muramyl peptides containing meso-DAP and a destroyed MurNAc residue are selective NOD1 agonists. Natural muramyl peptides featuring an intact MurNAc and no meso-DAP are selective NOD2 agonists.

Conclusions: 1) we have characterized key structural features of selective NOD1 and NOD2 agonists as well as non-selective NOD receptors agonists; 2) we show the importance of these new data for understanding innate immune response regulation, and for development of novel muramyl peptide immunostimulants.

Keywords: muramyl peptides, NOD1, NOD2, meso-diaminopimelic acid, N-acetylmuramic acid, chemiluminescence, CRISPR/Cas9

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (РНФ), грант № 16-15-10314.

Введение

Мурамилпептиды — это иммуностимулирующие гликопептиды, представляющие собой низкомолекулярные фрагменты пептидогликана

(ПГ) бактерий. Мурамилпептиды вызывают интерес и как естественные активаторы врожденного иммунитета, и как лекарственные средства [2]. В Российской Федерации из этой группы препаратов наиболее известен «Ликопид» [1]. Знания о взаимосвязях между структурой и активностью мурамилпептидов важны при разработке новых препаратов этой группы.

Строение мурамилпептидов обусловлено строением ПГ, фрагментами которого они являются. Как известно, основу бактериального ПГ составляют полисахаридные цепи, образованные чередующимися остатками N-ацетилглюкоза-мина (GlcNAc) и N-ацетилмурамовой кислоты (MurNAc), которые соединены между собой ß1^4-гликозидными связями [19]. С лактоиль-ными группами остатков MurNAc ковалентно связаны короткие пептиды, состоящие, как правило, из 2-5 аминокислотных остатков. В 1-м положении в пептидах обычно находится L-аланин, во 2-м — D-изоглутамин или D-изоглутаминовая кислота, в 4-м и 5-м — D-аланин. Наиболее вариабельным является 3-е положение, в котором у грамположительных бактерий чаще всего присутствует L-лизин или L-орнитин, а у грамотри-цательных — мезо-диаминопимелиновая кислота (meso-DAP) [19]. Отходящие от соседних поли-сахаридных цепей пептиды могут образовывать между собой ковалентные сшивки, придающие жесткость молекуле ПГ. У грамположительных бактерий такие сшивки образуются, например, путем пентаглициновых мостиков между концевым D-аланином одного пептида и свободной е-аминогруппой L-лизина другого пептида. У грамотрицательных бактерий сшивки чаще осуществляются путем прямой амидной связи между концевой COOH-группой одной пептидной цепи и свободной ю -аминогруппой остатка meso-DAP другой цепи [19].

Основной путь образования естественных му-рамилпептидов — расщепление ПГ лизоцимом (мурамидазой) и некоторыми бактериальными аутолизинами [7, 13]. Эти ферменты разрывают связи MurNAc—GlcNAc, в результате чего образуются мурамилпептиды вида GlcNAc— MurNAc—пептид. Благодаря наличию межпептидных сшивок получаются также димерные мурамилпептиды вида GlcNAc-MurNAc—пеп-тид—пептид—MurNAc—GlcNAc. Кроме того, в ходе биосинтеза ПГ в бактериях образуются мурамилпептиды вида MurNAc—пептид [21]. Наличие остатка GlcNAc принципиально не влияет на биологическую активность мурамилпепти-дов [12, 13].

Основную роль в распознавании мурамил-пептидов играют два рецептора врожденной иммунной системы — NOD1 и NOD2, находящиеся в цитозоле клеток [10, 12, 17]. Сигнальные пути от обоих рецепторов ведут к активации фактора транскрипции NF-kB и далее к транскрипции генов иммунного ответа [4, 20]. По данным литературы, спектры агонистов NOD1 и NOD2 не перекрываются. NOD1 избирательно распознает

мурамилпептиды грамотрицательных бактерий, оканчивающиеся остатком meso-DAP или ее ближайших стерических аналогов [12]. NOD2 распознает мурамилпептиды грамположительных бактерий с концевым остатком L-лизина или L-орнитина, а также мурамилдипептид MurNAc - L-Ala - D-isoGln (МДП), который является структурным элементом ПГ всех бактерий [12]. Однако перечисленные агонисты NOD1 и NOD2, имеющие 2-3 аминокислотных остатка в пептидной цепи, составляют лишь небольшую часть естественного пула мурамилпептидов [8, 19]. Гораздо чаще встречаются мурамилпептиды с 4-5 аминокислотными остатками, а также димеры [19]. Считается, что эти виды мурамилпептидов не активируют NOD1 и NOD2 человека [10, 15]. Однако работы, в которых изучалась рецепторная специфичность мурамилпептидов, обладали рядом недостатков: 1) мурамилпептиды использовались в наномолярных концентрациях, тогда как микромолярный диапазон практически не был исследован; 2) использовались клеточные модели, в которых искусственно создавали нефизиологично высокую экспрессию NOD1 и NOD2, что затрудняет интерпретацию результатов [12].

Недавно нами была создана новая экспериментальная модель для оценки биологической активности мурамилпептидов in vitro [6]. Ее основу составляет клеточная линия 293Luc, полученная из широко известной линии HEK293T путем стабильной интеграции в ее геном репортерно-го гена (люциферазы) под контролем NF-kB-зависимого промотера. Благодаря естественной экспрессии генов NOD1 и NOD2 линия 293Luc отвечает на стимуляцию мурамилпептидами, что выражается в повышении экспрессии люцифера-зы. С помощью технологии CRISPR-Cas9 на основе клеток 293Luc были получены три клеточных клона с нокаутами генов NOD1, NOD2 и с двойным нокаутом. Эти клоны позволяют оценить специфичность мурамилпептидов в отношении NOD1 и NOD2. Целью настоящей работы было изучение активности расширенной панели мурамилпептидов и их производных, взятых в микромолярных концентрациях, по отношению к рецепторам NOD1 и NOD2.

Материалы и методы

Реагенты

Упрощенные формулы мурамилпептидов и их производных, использованных в работе, приведены на рисунке 1. Нативные мурамилпептиды МтриДАП (MurNAc - L-Ala - D-isoGlu -meso-DAP), МДП (MurNAc - L-Ala - D-isoGln)

и МтриЛИЗ (MurNAc - L-Ala - D-isoGln -L-Lys), которые являются полными синтетическими аналогами природных мурамилпептидов, были закуплены у Invivogen (США). Нативные мурамилпептиды ГМтри (GlcNAc — MurNAc — L-Ala — D-isoGlu — meso-DAP), ГМтетра (GlcNAc - MurNAc - L-Ala - D-isoGlu - meso-DAP — D-Ala) и диГМтетра (димер ГМтетра, в котором мономеры связаны путем амидной связи между D-Ala одного мономера и meso-DAP другого) были получены из ПГ грамотрицатель-ной бактерии Salmonella typhi путем гидролиза ПГ лизоцимом, как описано ранее [6, 16]. Восстановленные производные ГМтри и ГМтетра (ГМтри-в и ГМтетра-в) получали путем обработки нативных мурамилпептидов боргидридом натрия [3, 6]. Лактоильные производные ГМтри, ГМтетра и диГМтетра (ЛАКтри, ЛАКтетра и ди-ЛАКтетра) получали в реакции бета-элиминации путем обработки нативных мурамилпептидов ги-дроксидом аммония [12, 16]. Молекулярные массы и чистота всех полученных соединений были подтверждены с помощью масс-спектрометрии ESI-TOF. Дипептид D-isoGlu — meso-DAP (iE-DAP) был куплен у Invivogen, рекомбинантный фактор некроза опухолей (TNF) человека — у Life Technologies (Великобритания).

Культивирование и стимуляция клеточной линии 293Luc и ее производных

Получение клеточной линии 293Luc и ее производных клонов 293Luc-ANOD1, 293Luc-ANOD2 и 293Luc-ANOD1/2 с нокаутами NOD1, NOD2 и с двойным нокаутом подробно описано ранее [6]. Все клетки вели в среде DMEM (Па-нэко, Россия) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma, США), 10% фетальной телячьей сыворотки (GE Healthcare, США) и 200 мкг/мл гигроми-цина B (Life Technologies). Клетки пассировали каждые 3-4 дня. За 2 сут. до стимуляции клетки переносили в 96-луночные плоскодонные планшеты (SPL Life Sciences, Корея) в количестве 10 тыс. на 100 мкл культуральной среды. Стимуляцию клеток мурамилпептидами и их производными делали в дублях или триплетах. В лунки отрицательного контроля добавляли DMEM, в лунки положительного контроля — TNF до конечной концентрации 100 нг/мл. Через 24 ч. во все лунки добавляли лизирующий раствор с люцигенином (BrightGlo, Promega, США). Лизаты переносили в планшеты из белого пластика и анализировали на планшетном хемилюминометре Lucy II (Anthos, Австрия). Первичные данные выражали в относительных световых единицах. Чтобы корректно сопоставить четыре типа клеток, использованных в работе, ответы каждого типа клеток

на исследуемые вещества пересчитывали по отношению к ответу этих же клеток на TNF (который принимали за 100%) и без стимуляции (0%). Каждое вещество тестировали минимум в 3 независимых опытах.

Статистика

Результаты представляли в виде M±a. Статистический анализ проводили с помощью t-теста Стьюдента в программе GraphPad InStat (GraphPad Software, США).

Результаты

Контролями во всех опытах служили iE-DAP (наименьший по размеру агонист NOD1 [5]), МДП (наименьший по размеру агонист NOD2 [11]) и TNF (положительный контроль). Клеточная линия 293Luc отвечала все три агониста (рис. 2А, Б). Клетки 293Luc-ANOD1 не отвечали на iE-DAP при сохранном ответе на МДП и TNF. Клетки 293Luc-ANOD2 не отвечали на МДП при сохранном ответе на iE-DAP и TNF. Клетки 293Luc-ANOD1/2 отвечали только на TNF. Таким образом, в клетках 293Luc функционируют и NOD1, и NOD2, в клетках 293Luc-ANOD1 — только NOD2, в клетках 293Luc-ANOD2 — только NOD1, а в клетках 293Luc-ANOD1/2 — ни NOD1, ни NOD2.

Далее, используя линию 293Luc, исследовали активность 6 нативных мурамилпептидов: МтриДАП, ГМтри, ГМтетра, диГМтетра, МтриЛИЗ и МДП (рис. 1). Из них первые 4 характерны для грамотрицательных бактерий и содержат остаток meso-DAP; при этом МтриДАП и ГМтри, содержащие meso-DAP в концевом положении, рассматриваются как специфические агонисты NOD1, а ГМтетра и диГМтетра считаются неактивными по отношению к NOD1 и NOD2 человека [10, 12, 15]. МтриЛИЗ и МДП характерны, соответственно, для грамположительных бактерий и для всех бактерий; оба не содержат meso-DAP и считаются специфическими агонистами NOD2 [12]. Как видно из рисунка 3А, все перечисленные мурамилпептиды, взятые в микромолярных концентрациях, индуцировали экспрессию люциферазы в клетках 293Luc. Ни один из этих мурамилпептидов, взятых в наивысшей концентрации (50 мкМ), не индуцировал люци-феразу в клетках 293Luc-ANOD1/2 (данные не показаны). Таким образом, все исследованные мурамилпептиды, в том числе ГМтетра и диГМтетра, активируют NOD1 и/или NOD2.

Активацию NOD2 изучали на клетках 293Luc-ANOD1. Активаторами NOD2 оказались все 6 нативных мурамилпептидов (рис. 3А), в том числе 4 мурамилпептида, содержащие остаток meso-

Остаток MurNAc (MurNAc residue)

Нативный (пиранозное кольцо) Native (pyranose ring)

Линейный Linearized

Отсутствует Absent

CH2OH

Г

I OCCH3

СП2ОП

CH2OH

OH

NH I

OCCH

CH2OH OH

NH I

OCCH

NH I

OCCH3

HCCH3 I 3 CO I

L-Ala I

D-soGlN

I

meso-DAP

МтриДАП

MtriDAP

HCCH3 I 3 CO I

L-Ala I

D-soGlN

I

meso-DAP

ГМтри

GMtri

HCCH3 I 3 CO I

L-Ala I

D-soGlN

I

meso-DAP

ГМтри-в

GMtri reduced

OH I

HCCH3 I 3 CO I

L-Ala I

D-soGlN

I

meso-DAP

ЛАКтри

LACtri

D-soGlN

I

meso-DAP

iE-DAP

Q_

A

Q

<

О со CD S

к о т а

CH2OH

CH2OH

CH2OH ■OH

NH NH

I I

OCCH3 OCCH3 HCCH3 I 3 CO I

L-Ala I

D-soGlN

I

meso-DAP I

D-Ala

ГМтетра

GMtetra

NH NH

NH I

OCCH

NH I

OCCH3

HCCH3 I 3 CO I

L-Ala I

D-soGlN

I

meso-DAP I

D-Ala

ГМтетра-в

GMtetra reduced

I

I

H3 I OCCH3

диГМтетра

diGMtetra

OCCH3

HCCH3 I 3

CO

I

L-Ala I

D-soGlN

I

meso-DAP D-Ala

I I

D-Ala—meso-DAP I

D-soGlN

I

L-Ala I

CO

I

HCCH3

с

CH2OH I CH2OH

NH I

OCCH3

NH I

OCCH3

OH I

HCCH3 I 3 CO I

L-Ala I

D-soGlN I

meso-DAP I

D-Ala

ЛАКтетра

LACtetra

OH I

HCCH3 I 3 CO I

L-Ala I

D-soGlN I

meso-DAP D-Ala I I

D-Ala—meso-DAP I

D-soGlN I

L-Ala I

CO I

HCCH3 I 3

OH

диЛАКтетра

diLACtetra

CD

вув

О £

t T3 О <

О

CH2OH

NH

OCCH3

HCCH3 I 3 CO I

L-Ala I

D-soGln

МДП

MDP

CH2OH

NH

OCCH3

HCCH3

I 3

CO

I

L-Ala I

D-soGln I

L-Lys

МтриЛИЗ

MtriLYS

OH

OH

OH

Рисунок 1. Упрощенные формулы мурамилпептидов и их производных, использованных в работе

Примечание. GlcNAc - ^ацетил^-глюкозамин, MurNAc - ^ацетил^-мурамовая кислота, L-Ala и D-Ala - L- и D-аланин, D-isoGlu -D-изоглутаминовая кислота, D-isoGln - D-изоглутамин, L-Lys - L-лизин, meso-DAP - мезо-диаминопимелиновая кислота.

Figure 1. Simplified formulas of muramyl peptides and their derivatives used in this study

Note. GlcNAc, N-acetyl-D-glucosamine; MurNAc, N-acetyl-D-muramic acid; L-Ala and D-Ala, L- and D-alanin; D-isoGlu, D-isoglutaminic acid; D-isoGln, D-isoglutamine; L-Lys, L-Lysine; meso-DAP, Mesodiaminopimelic acid.

А (А)

CD 05

400

300 -

200 -

о

I—

CD

% 100 -\ cc

Б (B)

40000

ja 30000 -

z ^ 20000 -

о

I—

CD

cc

10000 -

□ Без стимуляции □ iE-DAP □ МДП No stimulation MDP

Рисунок 2. Типовой опыт, демонстрирующий индукцию люциферазы в клетках 293Luc, 293Luc-ANOD1, 293Luc-ANOD2 и 293Luc-ANOD1/2 при стимуляции специфическими агонистами NOD1 и NOD2 (А) и TNF (Б)

Примечание. iE-DAP использовали в концентрации 300 мкМ, МДП - 1 мкМ, TNF - 100 нг/мл. Показаны значения М±ст триплетов.

Figure 2. Typical experiment showing luciferase activity in 293 Luc, 293Luc-ANOD1, 293Luc-ANOD2, or 293Luc-ANOD1/2 cells induced by specific NOD1 and NOD2 agonists (А), or by TNF (B)

Note. iE-DAP was used at a concentration of 300 |iM, MDP, at 1 |iM, TNF, at 100 ng/mL. M±ct values are shown for the triplets.

DAP (МтриДАП, ГМтри, ГМтетра и диГМтетра). Однако мурамилпептиды с meso-DAP активировали NOD2 только при достаточно высоких концентрациях (10 мкМ и выше), тогда как мурамилпептиды, не содержащие meso-DAP (МДП, МтриЛИЗ), были активны уже в концентрации 1 мкМ (рис. 3Б) и ниже (данные не показаны). Длина пептидной цепи, очевидно, не накладывает существенных ограничений на активность в отношении NOD2, поскольку может варьировать по крайней мере от 2 до 8 аминокислотных остатков (у МДП и диГМтетра соответственно).

В полном соответствии с литературными данными [12], ключевой структурной особенностью агонистов NOD2 является нативная конформация остатка MurNAc (D-пираноза). Так, восстановленные производные ГМтри-в и ГМтетра-в отличаются от нативных аналогов тем, что у них свободная альдегидная группа (-COH) в остатке MurNAc восстановлена до -CH2OH, что делает невозможным образование пиранозно-го кольца (рис. 1). У лактоильных производных (ЛАКтри, ЛАКтетра, диЛАКтетра) полностью отщеплена углеводная часть и сохранена только лактоильная группа остатка MurNAc (рис. 1). Как восстановленные, так и лактоильные производные мурамилпептидов в концентрациях 50 мкМ не активируют NOD2 (рис. 3В). Дипеп-тид iE-DAP не активирует NOD2 даже в концентрации 300 мкМ (рис. 2А).

Активацию рецептора NOD1 изучали на клетках 293Luc-ANOD2. Как видно из рисунка 3Г, активаторами NOD1 являются только мурамилпеп-

тиды, содержащие остаток meso-DAP, поскольку мурамилпептиды без meso-DAP (МДП и МтриЛИЗ) не активируют NOD1 даже в концентрации 50 мкМ. Однако остаток meso-DAP не обязательно должен быть экспонирован на конце молекулы, как считалось ранее [12, 15], поскольку активностью в отношении NOD1 обладают также ГМтетра и диГМтетра (рис. 3Г). Тем не менее, видно, что ГМтетра и диГМтетра являются менее мощными агонистами NOD1, чем ГМтри и МтриДАП, в которых meso-DAP занимает концевое положение.

В отличие от NOD2, рецептор NOD1 распознает производные мурамилпептидов с разрушенной или полностью удаленной углеводной частью (рис. 3Д). Так, ГМтри-в активирует NOD1 даже несколько сильнее, чем ГМтри или МтриДАП. ЛАКтри, ЛАКтетра и диЛАКтетра тоже в целом сопоставимы, соответственно, с ГМтри, ГМте-тра и диГМтетра по способности активировать NOD1 (рис. 3Д).

Для наглядности сравнительная активность всех исследованных соединений показана на двумерном графике (рис. 3Е), где можно выделить 3 группы веществ. Первую группу составляют производные мурамилпептидов с измененным/отсутствующим остатком Ми^Ас и с наличием остатка meso-DAP (ГМтри-в, ЛАКтри, ГМтетра-в, ЛАКтетра и диЛАКтетра). Это селективные агонисты NOD1. Вещества, в которых meso-DAP находится в концевом положении (ГМтри-в, ЛАКтри), более активны, чем остальные представители этой группы. Вторую

0

0

А (А)

15 -I 10 5 0

Б (B)

В (С)

293Luc

1 |JM

10 мкМ 10 jm

* 2 * *

50 50 jm

15 - 293Luc-ANOD1

10 -5 -0

Ji_n.

1 jM

10 мкМ 10 jm

50 50 jm

TNF 15 в 10

s

espon 5

re

P 0

1 jM

К графикам А-В

□ МтриДАП (MtriDAP)

□ ГМтри (GMtri)

□ ГМтетра (GMtetra)

10 мкМ 10 jm

50 50 jm

Г (D)

CD

ГО СО

I— с

CD О

со а.

t «

О CD

Д (Е)

а to

1 CD

а s

I- £

CD О

СП О.

I— со

О CD

о о О 5 о <

Я CN

я °

^ гч

(Л ^

Q

о

□ диГМтетра (diGMtetra)

□ МтриЛИЗ (MtriLYS) ■ МДП (MDP)

У4

25 20 15 10 -5 -0

Е(F) 20

15 -10 -5: 0

►ГМтри-в (GMtri reduced)

■ ГМтри (GMtri) ЛАКтри (LACtri) I ГМтетра-в (GMtetra reduced) >/ ЛАКтетра (LACtetra) >/ диЛАКтетра (diLACtetra) /у ■ ГМтетра (GMtetra)

/ ■дД3 мДП (mdp)

МтриДАП

0

2

МтриЛИЗ (MtriLYS)

"I-•-

4

Активация NOD2 (% TNF в 293Luc-ANOD1)

NOD2 activation (% response to TNF in 293Luc-ANOD1)

6

Рисунок 3. Активность нативных мурамилпептидов и их производных по отношению к рецепторам NOD1 и NOD2 человека

Примечание. А-В - клетки 293Luc, 293Luc-ANOD1 и 293Luc-ANOD2 стимулировали указанными нативными мурамилпептидами

в 3 различных концентрациях в течение 24 ч., после чего измеряли активность люциферазы.

Г и Д - сопоставление активности нативных и модифицированных мурамилпептидов (все в концентрации 50 мкМ)

по отношению к рецепторам NOD2 (Г) и NOD1 (Д).

На графиках А-Д показаны М±а, от 3 до 10 экспериментов на точку.

* - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001 при сравнении с нестимулированными клетками t-тестом Стьюдента для одного образца. Согласно методике расчета, ответ нестимулированных клеток всегда составлял 0%, ответ на TNF - 100%.

Е - активность исследованных соединений по отношению к NOD1 и NOD2 показана на двумерном графике (пояснения - см. в тексте), использованы средние значения из рисунка 3Г и 3Д, все агонисты в концентрации 50 мкМ.

Селективные агонисты NOD1 обозначены ромбами, селективные агонисты NOD2 - кружками, двойные агонисты - квадратами.

Figure 3. Activity of native muramyl peptides and their derivatives for human NOD1 and NOD2 receptors

Note. Plots A to С, 293 Luc cells, 293Luc-ANOD1 or 293Luc-ANOD2 cells stimulated by native muramyl peptides at 3 different concentrations for

24 hours, followed by measuring luciferase activity.

D and E, comparative activity for native and modified muramyl peptides (at a concentration of 50 цМ) for NOD2 (D) и NOD1 (E). At the graphs А to

E, М±ст values are shown (3 to 10 independent experiments per data point).

* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, compared with non-stimulated cells by Student t test for a single sample.

According to the calculation approach, response of non-stimulated cells was taken as 0%, TNF-induced response was 100%.

F, activity for NOD1 and NOD2 of the compounds studied is shown at the 2-dimensional graph (for explanations, see text). Mean values from the 3D и 3E are used , all agonists are applied at the concentration of 50 цМ.

Selective NOD1 agonists are indicated as rhombi; selective NOD2 agonists, circles; double agonists are shown by squares.

группу составляют мурамилпептиды с натив-ным остатком MurNAc и без meso-DAP (МДП, МтриЛИЗ). Это селективные агонисты NOD2. Третью группу составляют мурамилпептиды с на-тивным остатком MurNAc и с наличием остатка meso-DAP. Это вещества с двойным агонизмом (NOD1+NOD2). При этом, как и в первой группе, активность в отношении NOD1 выше у мурамилпептидов с концевым положением meso-DAP (ГМтри, МтриДАП).

Обсуждение

В отличие от предшествующих работ по ре-цепторной специфичности мурамилпепти-дов, в настоящей работе использована клеточная модель с естественной экспрессией NOD1 и NOD2, а также исследованы микромолярные концентрации мурамилпептидов. Важно, что Kd-связывание рецептора NOD1 с агонистами лежит именно в микромолярном диапазоне [14] (для NOD2 данные о Kd пока отсутствуют).

Полученные данные несколько видоизменяют существующие представления о рецепторной специфичности мурамилпептидов. Так, активаторами NOD2 являются различные нативные мурамилпептиды, независимо от наличия/отсутствия остатка meso-DAP и от длины пептидной цепи. Ключевым условием для активации NOD2 является наличие пиранозного кольца в остатке MurNAc. Таким образом, NOD2 является универсальным сенсором ПГ не только потому, что узнает МДП — общий структурный мотив всех ПГ [11], но и потому, что способен распознавать разнообразные — возможно, любые — нативные мурамилпептиды грамположительных и грам-отрицательных бактерий.

Активаторами рецептора NOD1 являются только мурамилпептиды с остатком meso-DAP. Однако, по нашим данным, активностью в отношении NOD1 обладают все meso-DAP-содержащие мурамилпептиды, а не только те, у которых meso-DAP экспонирован на конце молекулы (хотя последние более активны). Наличие остатка MurNAc и нативность его структуры не являются обязательными свойствами агони-стов NOD1, что согласуется с данными литературы [5, 12].

Полученные данные показывают, что рецептор NOD2 играет незаменимую роль в распознавании мурамилпептидов, тогда как NOD1 в известной степени избыточен. NOD2 абсолютно необходим для распознавания мурамилпептидов грамположительных бактерий, таких как Мтри-ЛИЗ, поскольку такие мурамилпептиды даже в высоких концентрациях не активируют NOD1. С другой стороны, meso-DAP-содержащие мура-

милпептиды грамотрицательных бактерий, являющиеся агонистами NOD1, могут активировать и NOD2, хотя и с меньшей эффективностью. Возможно, именно поэтому инактивирующие мутации NOD2 проявляются фенотипически в виде воспалительных заболеваний кишечника [17], тогда как мутации NOD1 не имеют четких клинических проявлений.

Продемонстрированная в работе связь между ключевыми химическими особенностями мурамилпептидов и их активностью (рис. 3Е) имеет значение и для разработки иммуностимуляторов мурамилпептидной природы. Хотя сигнальные пути NOD1 и NOD2 весьма схожи [4], распределение этих двух рецепторов в клетках и тканях существенно различается, что следует учитывать при прогнозировании биологических эффектов. NOD2 высоко экспрессируется в клетках Пане-та подвздошной кишки и в моноцитах крови, где значительно преобладает над NOD1 [6, 9]. NOD1 широко представлен в различных эпителиальных и мезенхимальных клетках, где NOD2 практически отсутствует [22]. Ряд клеток врожденной иммунной системы, в частности макрофаги и дендритные клетки, экспрессируют в равной степени и NOD1, и NOD2 [6, 9]. Таким образом, клетки-мишени NOD1-агонистов находятся в основном на тканевом уровне, тогда как мишени NOD2-агонистов — как в тканях, так и в системной циркуляции. Нативные meso-DAP-содержащие мурамилпептиды грамотрицательных бактерий, являясь веществами с двойной рецепторной специфичностью (NOD1+NOD2), вероятно, будут оказывать более мощное и генерализованное действие на иммунную систему, чем другие мурамилпептидные препараты. Однако, учитывая возможные побочные эффекты активации NOD1, в частности индукцию резистентности к инсулину [18], следует отдавать предпочтение местному применению таких мурамилпептидов с целью повышения антимикробных свойств эпителиальных клеток. При необходимости meso-DAP-содержащие мурамилпептиды могут быть конвертированы в специфические агонисты NOD1 путем восстановления или элиминации остатка MurNAc. Для системного применения, вероятно, более безопасны специфические аго-нисты NOD2, действие которых сфокусировано на «профессиональных» клетках врожденного иммунитета — моноцитах, макрофагах, дендритных клетках.

Таким образом, в работе получены новые данные о рецепторной специфичности мурамилпеп-тидов, которые имеют значение для понимания роли NOD1 и NOD2 во врожденном иммунитете, а также механизмов действия мурамилпептидных иммуностимуляторов.

Список литературы / References

1. Винницкий Л.И., Бунятян К.А., Пинегин Б.В., Миронова Е.В., Швец Л.И., Волков А.А., Инвия-ева Е.В., Андронова Т.М., Хаитов Р.М. Отечественный иммуномодулятор нового поколения Ликопид в комплексном лечении и профилактике инфекционных осложнений в хирургической клинике // Вестник Российской академии медицинских наук, 1997. № 11. С. 46-49. [Vinnitsky L.I., Buniatian K.A., Pinegin B.V., Mironova E.V., Shvets L.I., Volkov A.A., Inviyaeva E.V., Andronova T.M., Khaitov RM. Domestic immunomodulator of a new generation, Licopid, in the comprehensive therapy and prevention of infectious complications in surgery. Vestnik rossiyskoy akademii meditsinskikh nauk = Annals of the Russian Academy of Medical Sciences, 1997, no. 11, pp. 46-49. (In Russ].

2. Ando K., Mori K., Corradini N., Redini F., Heymann D. Mifamurtide for the treatment of nonmetastatic osteosarcoma. Expert Opin. Pharmacother., 2011, Vol. 12, pp. 285-292.

3. Beranova-Giorgianni S., Desiderio D.M., Pabst M.J. Structures of biologically active muramyl peptides from peptidoglycan of Streptococcus sanguis. J. Mass Spectrom., 1998, Vol. 33, pp. 1182-1191.

4. Boyle J.P., Parkhouse R., Monie T.P. Insights into the molecular basis of the NOD2 signalling pathway. Open Biol., 2014, Vol. 4, 140178. doi: 10.1098/rsob.140178.

5. Chamaillard M., Hashimoto M., Horie Y., Masumoto J., Qiu S., Saab L., Ogura Y., Kawasaki A., Fukase K., Kusumoto S., Valvano M.A., Foster S.J., Mak T.W., Nunez G., Inohara N. An essential role for NOD1 in host recognition of bacterial peptidoglycan containing diaminopimelic acid. Nat. Immunol., 2003, Vol. 4, pp. 702-707.

6. Dagil Y.A., Arbatsky N.P., Alkhazova B.I., L'vov V.L., Mazurov D.V., Pashenkov M.V. The Dual NOD1/ NOD2 Agonism of Muropeptides Containing a Meso-Diaminopimelic Acid Residue. PLoS One, 2016, Vol. 11, e0160784. doi: 10.1371/journal.pone.0160784.

7. Davis K.M., Nakamura S., Weiser J.N. Nod2 sensing of lysozyme-digested peptidoglycan promotes macrophage recruitment and clearance of S. pneumoniae colonization in mice. J. Clin. Invest., 2011, Vol. 121, pp. 3666-3676.

8. Ellouz F., Adam A., Ciorbaru R., Lederer E. Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1974, Vol. 59, pp. 1317-1325.

9. Fritz J.H., Girardin S.E., Fitting C., Werts C., Mengin-Lecreulx D., Caroff M., Cavaillon J.M., Philpott D.J., Adib-Conquy M. Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1-and NOD2-activating agonists. Eur. J. Immunol., 2005, Vol. 35, pp. 2459-2470.

10. Girardin S.E., Boneca I.G., Carneiro L.A., Antignac A., Jehanno M., Viala J., Tedin K., Taha M.K., Labigne A., Zahringer U., Coyle A.J., DiStefano P.S., Bertin J., Sansonetti P.J., Philpott D.J. Nod1 detects a unique muropeptide from gram-negative bacterial peptidoglycan. Science, 2003, Vol. 300, pp. 1584-1587.

11. Girardin S.E., Boneca I.G., Viala J., Chamaillard M., Labigne A., Thomas G., Philpott D.J., Sansonetti P.J. Nod2 is a general sensor of peptidoglycan through muramyl dipeptide (MDP) detection. J. Biol. Chem., 2003, Vol. 278, pp. 8869-8872.

12. Girardin S.E., Travassos L.H., Herve M., Blanot D., Boneca I.G., Philpott D.J., Sansonetti P.J., Mengin-Lecreulx D. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2. J. Biol. Chem., 2003, Vol. 278, pp. 41702-41708.

13. Inohara N., Ogura Y., Fontalba A., Gutierrez O., Pons F., Crespo J., Fukase K., Inamura S., Kusumoto S., Hashimoto M., Foster S.J., Moran A.P., Fernandez-Luna J.L., Nunez G. Host recognition of bacterial muramyl dipeptide mediated through NOD2. Implications for Crohn's disease. J. Biol. Chem., 2003, Vol. 278, pp. 5509-5512.

14. Laroui H., Yan Y., Narui Y., Ingersoll S.A., Ayyadurai S., Charania M.A., Zhou F., Wang B., Salaita K., Sitaraman S.V., Merlin D. L-Ala-gamma-D-Glu-meso-diaminopimelic acid (DAP) interacts directly with leucine-rich region domain of nucleotide-binding oligomerization domain 1, increasing phosphorylation activity of receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2 and its interaction with nucleotide-binding oligomerization domain 1. J. Biol. Chem., 2011, Vol. 286, pp. 31003-31013.

15. Magalhaes J.G., Philpott D.J., Nahori M.A., Jehanno M., Fritz J., Le Bourhis L., Viala J., Hugot J.P., Giovannini M., Bertin J., Lepoivre M., Mengin-Lecreulx D., Sansonetti P.J., Girardin S.E. Murine Nod1 but not its human orthologue mediates innate immune detection of tracheal cytotoxin. EMBO Rep., 2005, Vol. 6, pp. 1201-1207.

16. Pashenkov M.V., Popilyuk S.F., Alkhazova B.I., L'vov V.L., Murugin V.V., Fedenko E.S., Khaitov R.M., Pinegin B.V. Muropeptides trigger distinct activation profiles in macrophages and dendritic cells. Int. Immunopharmacol., 2010, Vol. 10, pp. 875-882.

17. Philpott D.J., Sorbara M.T., Robertson S.J., Croitoru K., Girardin S.E. NOD proteins: regulators of inflammation in health and disease. Nat Rev Immunol, 2013, Vol. 14, pp. 9-23.

18. Schertzer J.D., Tamrakar A.K., Magalhaes J.G., Pereira S., Bilan P.J., Fullerton M.D., Liu Z., Steinberg G.R., Giacca A., Philpott D.J., Klip A. NOD1 activators link innate immunity to insulin resistance. Diabetes, 2011, Vol. 60, pp. 2206-2215.

19. Schleifer K.H., Kandler O. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications. Bacteriol. Rev., 1972, Vol. 36, pp. 407-477.

20. Tukhvatulin A.I., Logunov D.Y., Gitlin I.I., Shmarov M.M., Kudan P.V., Adzhieva C.A., Moroz A.F., Kostyukova N.N., Burdelya L.G., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L., Gudkov A.V. A In Vitro and In Vivo Study of the Ability of NOD1 Ligands to Activate the Transcriptional Factor NF-kB. Acta Naturae, 2011, Vol. 3, pp. 77-84.

21. Vollmer W., Bertsche U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 2008, Vol. 1778, pp. 1714-1734.

22. Watanabe T., Asano N., Fichtner-Feigl S., Gorelick P.L., Tsuji Y., Matsumoto Y., Chiba T., Fuss I.J., Kitani A., Strober W. NOD1 contributes to mouse host defense against Helicobacter pylori via induction of type I IFN and activation of the ISGF3 signaling pathway. J. Clin. Invest., 2010, Vol. 120, pp. 1645-1662.

Авторы:

Дагиль Ю.А. — аспирант, лаборатория клинической иммунологии ФГБУ «Государственный научный центр „Институт иммунологии"» ФМБА России, Москва, Россия

Арбатский Н.П. — к.х.н., научный сотрудник, лаборатория клинической иммунологии ФГБУ «Государственный научный центр „Институт иммунологии"» ФМБА России, Москва, Россия

Алхазова Б.И. — младший научный сотрудник, лаборатория препаративной биохимии ФГБУ «Государственный научный центр „Институт иммунологии"» ФМБА России, Москва, Россия Львов В.Л. — к.х.н., заведующий лабораторией препаративной биохимии ФГБУ «Государственный научный центр „Институт иммунологии"» ФМБА России, Москва, Россия

Пащенков М.В. — д.м.н., ведущий научный сотрудник, лаборатория клинической иммунологии ФГБУ «Государственный научный центр „Институт иммунологии"» ФМБА России, Москва, Россия

Поступила 07.04.2017 Принята к печати 02.05.2017

Authors:

Dagil Yu.A., Postgraduate Student, Laboratory of Clinical Immunology, National Research Center "Institute of Immunology", Federal Medical-Biological Agency of Russia, Moscow, Russian Federation

Arbatsky N.P., PhD (Chemistry), Research Associate, Laboratory of Clinical Immunology, National Research Center "Institute of Immunology", Federal Medical-Biological Agency of Russia, Moscow, Russian Federation

Alkhazova B.I., Junior Research Associate, Laboratory of Preparative Biochemistry, National Research Center "Institute of Immunology", Federal Medical-Biological Agency of Russia, Moscow, Russian Federation

Lvov V.L., PhD (Chemistry), Head, Laboratory of Preparative Biochemistry, National Research Center "Institute of Immunology", Federal Medical-Biological Agency of Russia, Moscow, Russian Federation

Pashenkov M.V., PhD, MD (Medicine), Leading Research Associate, Laboratory of Clinical Immunology, National Research Center "Institute of Immunology", Federal Medical-Biological Agency of Russia, Moscow, Russian Federation

Received 07.04.2017 Accepted 02.05.2017