CC BY
47
© Коллектив авторов, 2019
Гапонов А.М.1' 2, Якушенко Е.В.1, Тутельян А.В.3, Писарев В.М.1' 2,
Александров И. А.1, Андронова Т.М.4, Козлов И.Г.1' 5
Производное мурамилдипептида (ГМДП-А) стимулирует цитотоксичность, экспрессию генов перфорина и рецептора ИЛ-18 НК-клеток
1 ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева» Минздрава России, 117198, г. Москва, Россия
2 ФГБНУ «Федеральный научно-клинический центр реаниматологии и реабилитологии», 127051, г. Москва, Россия
3 ФБУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора, 111123, г. Москва, Россия
4 АО «Пептек», 117997, г. Москва, Россия
5 ФГАОУ ВО «Балтийский федеральный университет им. И. Канта» Минобрнауки России, 236016, г. Калининград, Россия
Резюме. Сегодня поиск новых регуляторных факторов, способных активировать противоопухолевую защиту организма, - это флагманское направление развития имму-нофармакологии. Врожденный иммунный ответ и НК-клетки как его элемент играют жизненно важную роль в защите от опухолевых и инфицированных клеток. Мурамил-дипептиды (МДП), являясь структурным элементом клеточной стенки бактерий, взаимодействуют с цитоплазматическими рецепторами семейства NOD клеток человека, активируя врожденный и приобретенный иммунный ответ. ГМДП-А (глюкозаминилму-рамилдипептид) - полусинтетический аналог МДП, обладает рядом фармакологических характеристик, которые позволяют использовать его в клинике при лечении иммуно-дефицитных состояний, в том числе в онкологии. Известно, что НК-клетки периферической крови человека конститутивно экспрессируют мРНК NOD2 и продуцируют его протеин.
Цель данной работы - изучение влияния ГМДП-А на цитолитическую активность НК-клеток человека in vitro, а также на экспрессию генов факторов, вовлеченных в реализацию основных функций НК-клеток (перфорина, ИФН-у и его рецепторов, рецептора ИЛ-18). При изучении влияния ГМДП-А на цитолитическую активность НК-клеток в отношении опухолевой клеточной линии НТ-29 обнаружено 3-кратное увеличение цитолиза при соотношении клеток-мишеней и эффекторов 1:10. Кроме того, показано, что ГМДП-А стимулирует экспрессию генов перфорина и рецептора ИЛ-18 и не влияет на уровень экспрессии генов ИФН-у и его рецепторов в НК-клетках здоровых доноров. Таким образом, в результате проведенных исследований показана способность ГМДП-А активировать экспрессию генов эффекторных гуморальных факторов НК-клеток (перфорина, рецептора ИЛ-18), что в сочетании с существенным повышением под влиянием данного агента цитолитической активности НК-клеток позволяет рассматривать ГМДП-А как перспективный агент для контроля функциональной активности НК-клеток при лечении онкологических заболеваний.
Ключевые слова: ГМДП-А; мурамилдипептиды; НК-клетки; цитотоксичность; клеточная линия НТ-29; перфорин; ИФН-у; рецептор ИЛ-18
Статья поступила 16.07.2019. Принята в печать 16.08.2019.
Для цитирования: Гапонов А.М., Якушенко Е.В., Тутельян А.В., Писарев В.М., Александров И.А., Андронова Т.М., Козлов И.Г. Производное мурамилдипептида (ГМДП-А) стимулирует цитотоксичность, экспрессию генов перфорина и рецептора ИЛ-18 НК-клеток. Иммунология. 2019; 40 (5): 44-51. doi: 10.24411/0206-49522019-15005.
Для корреспонденции
Козлов Иван Генрихович -доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией экспериментальной и клинической фармакологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева» Минздрава России (Москва, Россия), профессор Центра иммунологии и клеточных технологий ФГАОУ ВО «Балитийский федеральный университет им. И. Канта» Минобрнауки России (Калининград, Россия) E-mail:
[email protected] https://orcid.org/0000-0002-9694-5687
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Gaponov A.M.1' 2, Yakushenko E.V.1, Tutelyan A.V.3, Pisarev V.M.1' 2, Alexandrov I.A.1, Andronova T.M.4, Kozlov I.G.1' 5
Muramyl dipeptide derivative (GMDP-A) stimulates NK-cell cytotoxicity, expression of perforin and IL-18 receptor
1 D. Rogachev National Medical Research Center for Pediatrics Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Health of Russian Federation, 117198, Moscow, Russia
2 Federal Scientific and Clinical Center for Reanimatology and Rehabilitation, 127051, Moscow, Russia
3 Federal Budget Institution of Science "Central Research Institute of Epidemiology", Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance, 111123, Moscow, Russia
4 JSC Peptek, 117997, Moscow, Russia
5 Immanuel Kant Baltic Federal University, Ministry of High Education and Science of Russian Federation, 236016, Kaliningrad, Russia
Abstract. The search for new regulatory factors capable of activating the antitumor defense is today the flagship trend in the development of immunopharmacology. The innate immunity and NK cells, as its element, play an important role in protecting against tumor and infected cells. Muramyl dipeptides (MDPs), as a structural element of the bacterial cell wall, interact with the cytoplasmic receptors of the NOD family of human cells thereby activating the innate and adoptive immune response. GMDP-A (glucosaminylmuramyl dipeptide) is a semisynthetic analogue of MDP, which has a number of pharmacological characteristics that can be used in the clinic for the treatment of immunodeficiency states, including oncology. It is known that NK cells of human peripheral blood constitutively express NOD2 mRNA and produce its protein. The purpose of this work is to study the effect of GMDP-A on the cytolytic activity of human NK cells in vitro, as well as on the expression of gene factors involved in the implementation of the main functions of NK cells (perforin, IFN-y and its receptors, IL-18 receptor). While studying the effect of GMDP-A on the cytolytic activity of NK cells in relation to the HT-29 tumor cell line, a 3-fold increase in cytolysis was observed with a ratio of target cells and effectors of 1:10. In addition, it was shown that GMDP-A stimulates the expression of the perforin and IL-18 receptor genes and does not affect the level of expression of the IFN-y genes and its receptors in NK cells of healthy donors. Thus, the ability of GMDP-A to activate the expression of the genes of perforin and IL-18 receptor of NK cells is shown, which combined with a significant increase in the cytolytic activity of NK cells under the influence of this agent, allows to consider GMDP-A as a promising agent to control the functional activity of NK cells in the treatment of cancer.
Keywords: GMDP-A; muramyl dipeptide; NK cells; cytotoxicity; HT-29 cells; perforin; IFN-y; IL-18 receptor
Received 16.07.2019. Accepted 16.08.2019.
For citation: Gaponov A.M., Yakushenko E.V., Tutelyan A.V., Pisarev V.M., Alexandrov I.A., Andronova T.M., Kozlov I.G. Muramyl dipeptide derivative (GMDP-A) stimulates NK-cell cytoticity, expression of perforin and receptor IL-18. Immunologiya. 2019; 40 (5): 44-51. doi: 10.24411/0206-4952-2019-15005.
Funding. The study had no sponsor support.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
For correspondence
Kozlov Ivan G. - MD, PhD, Professor, Chief of Experimental and Clinical Pharmacology Department, D. Rogachev National Medical Research Center for Pediatrics Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Health of Russian Federation (Moscow, Russian), Professor of Immunology and Cell Technology Center, Immanuel Kant Baltic Federal University (Kaliningrad, Russia) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9694-5687
Введение
Изучение функционирования иммунной системы в условиях прогрессирования злокачественных новообразований позволяет разрабатывать новые подходы терапевтических стратегий. В настоящее время в качестве адъювантной терапии применяют различные способы стимуляции иммунокомпетентных клеток (ИКК). Активация врожденного иммунного ответа как первой линии защиты и фактора, инициирующего адаптивный ответ, имеет решающее значение в эффективности иммунитета против злокачественных клеток. Активная неспецифическая иммунотерапия с использованием нецитокиновых адъювантов направлена на инициацию
и повышение функций широкого спектра различных типов ИКК.
Мурамилдипептиды (МДП) - фрагменты пептидо-гликана клеточной стенки бактерий, обладающие им-муномодулирующей способностью. МДП относятся к патоген-ассоциированным молекулам (PAMP - pathogen-associated molecular patterns). Они являются ли-гандами образ-распознающих сигнальных рецепторов (PRR - pattern-recognition receptors) и, связываясь с внутриклеточными NOD-рецепторами, приводят к активации NF-kB сигнального пути и, как следствие, к синтезу провоспалительных цитокинов, которые активируют функции клеток противоопухолевой защиты. NOD2 экспрессируются многими типами клеток, в том числе
натуральными киллерными (НК) клетками, а также макрофагами, гранулоцитами, дендритными клетками и различными типами неиммунных клеток.
ГМДП (глюкозаминилмурамилдипептид, лекарственный препарат Ликопид®, АО «Пептек») - полусинтетический аналог МДП, дополненный остатком М-ацетилглюкозамина, имеет сходные с МДП биологические свойства, но при этом обладает рядом преимуществ: менее токсичен и проявляет более выраженную противоопухолевую и адъювантную активность. Аналог ГМДП - ГМДП-А (М-глюкозаминил-М-ацетилмурамил-Ь-аланил-Б-глутаминовая кислота) имеет еще менее выраженную пирогенность и увеличенный период полувыведения, что позволяет использовать его в виде инъекционной лекарственной формы и уменьшить кратность его назначения [1].
НК-клетки являются элементами первой линии защиты от появления и распространения опухолевых клеток в организме. Они реализуют ранние этапы формирования врожденного иммунного ответа на инфицированные и трансформированные злокачественные клетки [2, 3]. НК-клетки могут распознавать клетки-мишени, включая опухолевые, со сниженной экспрессией МНС класса I и идентифицировать молекулы, которые не экспрессируются в нормальных клетках, но активируются в трансформированных. НК-клетки разделяют на 2 субтипа: СБ56а'шСВ1б+ обладают цитотоксической активностью, индуцируя лизис опухолевых клеток через высвобождение перфорина и гранзимов, СБ56Ы8ИСБ16-продуцируют целый ряд цитокинов, таких как ИЛ-2, ИФН-а и ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-12, ИЛ-18, ГМ-КСФ, хемо-кины и др., что позволяет им модулировать функции других типов ИКК и являться связующим звеном с клетками адаптивного звена иммунного ответа [4].
Перфорин-зависимый цитолиз является ключевым механизмом цитотоксичности НК-клеток против опухолевых клеток. Показано, что перфорин предотвращает инициацию, рост и метастазирование опухолевых клеток [5-8]. НК-клетки конститутивно продуцируют ИФН-у, который, с одной стороны, стимулирует функции самих НК-клеток, с другой - играет центральную роль во врожденном и адаптивном иммунных ответах, а также является связующим звеном между НК- и другими ИКК [9]. Причем показано, что продукция перфорина и ИФН-у НК-клетками - это два независимых и одновременно потенцирующих друг друга механизма участия НК-клеток в борьбе против опухолевых клеток. Так, в модели спонтанно метастазирующей опухоли карциномы молочной железы БАЗ у мышей ВАЬВ/с показано, что у мышей, дефицитных по одному из генов перфорина или ИФН-у, количество метастазов в легких превышало количество таковых у дикого типа мышей, а дефицит обоих генов в НК-клетках приводил к максимальному количеству метастазов в легких, при этом у мышей дефицитных по Т- и НКТ-клеткам количество метастазов не увеличивалось [5]. В работе [10] показано, что снижение уровня продукции ИФН-у, генерация генетических дефектов факторов передачи сигнала
ИФН-у, включая полиморфизм его рецептора IFNGR2, является фактором риска и негативного прогноза для рака ободочной и прямой кишки. Связывание ИФН-у со своими рецепторами R1 и R2 на поверхности клеток ассоциировано с активацией JAK1 и JAK2, соответственно, что приводит к запуску каскада, включающего активацию протеинкиназ (MAPK), фосфорилирование и транслокацию STAT1 и STAT3 в ядро клетки, и связывание с ИФНу-активирующим сайтом (GAS), что вызывает инициацию транскрипции генов, вовлеченных в противоопухолевый иммунитет: МНС I класса, CD95, каспазы-1 и других генов, ассоциированных с подавлением опухолевого роста [11].
Интерлейкин-18 (ИЛ-18) - провоспалительный цито-кин, изначально был описан как ИФНу-индуцирующий фактор (IGIF) [12]. Однако впоследствии было показано, что ИЛ-18 вовлечен в целый ряд процессов, влияющих на различные этапы и механизмы функционирования многих типов клеток, в том числе и НК-клеток. Так, ИЛ-18 активирует пролиферацию, созревание и цитоток-сичность НК-клеток, индуцируя транскрипцию генов и синтез протеинов, вовлеченных в этот процесс, а также выживаемость клеток и процесс аутофагии [13]. Цито-литическая активность ИЛ-18 опосредована через активацию продукции ИФН-у и перфорина НК-клетками [14]. В эксперименте на мышах с нокаутом гена ИЛ-18 показано, что в присутствии ИЛ-18 увеличивается грануляция и размер НК-клеток, что является интегральным показателем их активации, в том числе усиления продукции рибосомальных протеинов, пролиферации (старт G2/M фазы клеточного цикла) [15], а также увеличения экспрессии различных поверхностных молекул (CD69, c-kit, IL-2R, факторов аутофагии: ATG5, LC3-II, p62) [13, 16]. Кроме того, снижая активность апопто-тических митохондриальных каспазы-3 и каспазы-9, а также индуцируя продукцию ФНО и, соответственно, с-апопототического ингибитора 2 (cIAP2) и фактора 1, ассоциированного с рецептором ФНО (TRAF1), ИЛ-18 защищает НК-клетки от аутодеструкции, инициирующейся в процессе цитотоксичности этих клеток [17]. Все описанные эффекты ИЛ-18 осуществляются через связывание с а- и ß-цепями рецептора ИЛ-18 на поверхности НК-клеток и последующую активацию MyD88 и NF-kB. Кроме того, ИЛ-18 вызывает увеличение экспрессии рецептора ИЛ-2 (особенно CD25), передачи сигнала на STAT3/STAT5 и инициацию пролиферации клеток [18].
Иммуносупрессия, индуцированная злокачественным процессом, отражается на функции всех ИКК, в том числе на активности НК-клеток. Например, показано, что у пациентов с раком легкого в Т-, НК-и НКТ-клетках, инфильтрирующих опухоль, снижена экспрессия перфорина, гранзима В и ИФН-у [19]. Существует несколько механизмов и причин супрессии НК-клеток. Так, микроокружение опухоли состоит из опухолеассоциированной стромы и иммунных клеток, взаимодействующих с опухолью [опухоль-ассоцииро-ванные макрофаги, толерогенные дендритные клетки
и Т-регуляторные лимфоциты (Трег)]. Эти клетки способны продуцировать растворимые лиганды, супрес-сорные молекулы и цитокины, которые негативно влияют на созревание и активность НК-клеток. Так, Трег продуцируют противовоспалительные факторы ТФР-Р и ИЛ-10, что приводит к снижению активности НК-клеток [20]. НК-клетки экспрессируют множество рецепторов, которые модулируют их функции, в частности цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам. К ним относятся НК-специфические рецепторы, называемые рецепторами естественной цитотоксичности (NCRs), представленные NKp30, NKp44 и NKp46. NCR действуют совместно с другими активирующими распознавание МНС-1 на стрессированных клетках рецепторами, такими как NKG2D и DNAM-1. Эти лиганды активируются при опухолевой трансформации клеток и во время вирусной инфекции [21]. Некоторые типы опухолевых клеток способны продуцировать растворимый рецептор NKG2D, что также негативно отражается на функции НК-клеток, снижая их цитотоксическую активность [22, 23]. Кроме того, некоторые химиотера-певтические и антинеопластические препараты также угнетают функцию НК-клеток. Так, 5-фторурацил (5-fluo-rouracil), цисплатин, 5-аза-2'-деоксицитидин, трихоста-тин A, бриостатин-1 повышают экспрессию NKG2DL в опухолевых клетках [24]. Поэтому одной из перспективных стратегий элиминации опухолевых клеток и активации противоопухолевого иммунного ответа в настоящее время служит активизация функционирования НК-клеток.
Цель данного исследования - изучение влияния ГМДП-А на функциональную активность НК-клеток, в частности, на экспрессию генов перфорина, ИФН-у и его рецепторов, рецептора ИЛ-18, а также на цитоток-сическую активность НК-клеток в отношении опухолевой клеточной линии колоректальной аденокарциномы человека НТ-29 in vitro.
Материал и методы
Характеристика исследуемого агента
ГМДП-А - №ацетилглюкозаминил-М-ацетилмурамил^-аланил-Э-глутаминовая кислота (производитель - ЗАО «Пептек», Москва, Россия). ГМДП-А использовали в дозах 1 и 5 мкг/мл.
Характеристика клеточной линии
Клетки колоректальной аденокарциномы человека НТ-29 (код АТСС - НТВ38) были получены из коллекции клеточных линий ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева» Минздрава России.
Подготовка клеток-мишеней
Клетки HT-29 культивировали в полной среде DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone, США), 1 мг/мл глутамина (ПанЭко, Россия), 50 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептоми-
цина (ПанЭко, Россия) при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СО2. После достижения монослоя клетки промывали раствором Версена и открепляли от пластика трипсином (0,25% в растворе Версена). Количество клеток подсчитывали с использованием камеры Горяева и рассевали клетки исходя из расчета 100 тыс. клеток на 1 см2. За 48 ч до проведения эксперимента клетки НТ-29, достигшие монослоя, отделяли от подложки, как описано выше, и рассевали в полной среде БМБМ, содержащей 0,1 мкКюри метил-3Н-тимидина, при плотности 100 тыс. клеток на 1 см2. Клетки культивировали 2 суток, до достижения 80-90% плотности монослоя, затем отделяли от подложки 0,25% трипсином в растворе Версена. После подсчета клеток последние рассевали в лунки 96-луночного планшета (8РЬ Ы1е8с1епсе8, Южная Корея) в количестве 8000 клеток на лунку и культивировали 4-6 ч до проведения эксперимента при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СО2.
Подготовка клеток-эффекторов
В качестве клеток-эффекторов использовали моно-нуклеарные клетки (МНК) периферической крови 25 здоровых доноров мужского пола, в возрасте от 24 до 35 лет. Венозную кровь, стабилизированную К3ЭДТА, смешивали с равным объемом фосфатно-соле-вого буфера, наслаивали на градиент плотности фиколл-верографина (1,077) и центрифугировали 25 мин при 1000g. После окончания центрифугирования клетки, собранные на границе градиента плотности, ресуспен-зировали в среде ИРМ1-1640 без сыворотки и центрифугировали 8 мин при 200g. Эту процедуру повторяли еще дважды. Выделенные и отмытые МНК ресуспен-дировали в среде ИРМ1-1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина, подсчитывали в камере Горяева.
Выделенные клетки помещали в лунки 24-луночного планшета (8РЬ П1е8с1епсе8, Южная Корея) при плотности 2 млн/мл в объеме 1 мл полной среды КРМ1-1640. В опытные лунки вносили ГМДП-А в концентрации 1 и 5 мкг/мл. В контрольные лунки вносили эквивалентный объем питательной среды. После внесения препарата клетки инкубировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СО2, в течение 12 ч.
Определение цитотоксической активности
Для оценки цитотоксической активности НК клетки опухолевой линии НТ-29 предварительно метили 3Н-тимидином (1 мКю/лунку) в течение 18 ч, отмывали и культивировали в 96-луночных планшетах (104/лунку). Эффекторные клетки (МНК) добавляли в соотношении 20:1 и 10:1. В опытные лунки вносили ГМДП-А в концентрации 1 и 5 мкг/мл. В контрольные лунки вносили эквивалентный объем питательной среды. После внесения препарата клетки инкубировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СО2, в течение 12 ч. Затем клетки переносили на фильтры и оценивали радиоактивность на р-счетчике (ЯаскЪе1а, США). На каждую экспериментальную точку использовали по 3-4 лунки. Контролем служили лунки с мечеными 3Н-тимидином
НТ-29, культивируемые в отсутствии МНК. Результаты выражали в виде индекса цитотоксичности (ИЦ) в процентах (%). Расчет ИЦ проводился по формуле:
ИЦ = (1 -
Число импульсов в опытной тест-ячейке Число импульсов в контрольной тест-ячейке
)х100%
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы IBM SPPS.
Выделение субпопуляции НК-клеток
Выделение НК-клеток осуществляли из клеток периферической крови 5 здоровых доноров мужского пола в возрасте от 24 до 35 лет методом магнитной сепарации с использованием набора #130-092-657 и оборудования производства компании Miltenyi Biotec (Германия), согласно прилагаемому к набору протоколу. По данным цитофлюориметрического анализа чистота выделенной популяции НК-клеток (CD3CD19CD56+) составляла 93-97%.
Выделенные клетки помещали в лунки 24-луноч-ного планшета (SPL Lifesciences, Южная Корея) при плотности 1 млн/мл в полной среде RPMI-1640. В опытные лунки вносили ГМДП-А в концентрации 10 мкг/мл. В контрольные лунки вносили эквивалентный объем питательной среды. После внесения препарата клетки инкубировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СО2, в течение 6 и 16 ч.
Выделение РНК и реакция обратной транскрипции (ОТ-ПЦР)
По окончании культивирования НК-клеток из лунок осторожно удаляли 0,4 мл среды культивирования и добавляли 0,8 мл Trizol Reagent (Invitrogen, США). Далее следовали протоколу производителя. Сразу после выделения суммарной РНК проводили реакцию обратной транскрипции с использованием набора Ambion TotalPrep cRNA Amplification Kit (Invitrogen, США), согласно протоколу, прилагаемому к набору. Уровень экспрессии генов исследовали с использованием набора Illumina HumanHT-12v4 Expression BeadChip (Illumina, США) на приборе Illumina iScan (Illumina, США) согласно протоколу производителя. Полученные данные обрабатывали с помощью пакета прикладных программ Genome Studio Software (v 2011.1, Illumina).
Результаты
Влияние ГМДП-А на цитолитическую активность НК-клеток в отношении клеток опухолевой линии HT-29
Исследовали образцы МНК, выделенные из периферической крови 25 здоровых доноров мужского пола в возрасте от 24 до 35 лет. В качестве клеток-мишеней использовали клеточную линию аденокарциномы толстой кишки человека НТ-29, чувствительную к ци-
толитической активности НК-клеток. Клетки-мишени и клетки-эффекторы использовали в соотношении 1:10 и 1:20. ГМДП-А использовали в качестве стимулятора функциональной активности клеток фракции МНК в дозах 1 и 5 мкг/мл.
Показано, что добавление ГМДП-А к клеткам, культивированным в соотношении 1:10 в дозах 1 и 5 мкг/мл, приводит к увеличению выраженности цитолиза НТ-29 с 19,7 ± 1,5% в группе сравнения до 48,8 ± 2,01 и 57,1 ± 4,7% в опытной группе соответственно (табл. 1). При культивировании клеток НТ-29 и МНК в соотношении 1:20 показатель индекса цитотоксичности на фоне добавления ГМДП-А (в дозах 1 и 5 мкг/мл) увеличился, но был выражен несколько меньше (52,4 ± 4,1 и 56,1 ± 3,9% соответственно) по сравнению с группой, где соотношение клеток 1:10, что, видимо, связано со сравнительно высоким уровнем цитолиза в группе сравнения без дополнительной стимуляции (38,5 ± 3,2%). Иными словами, культивирование МНК здоровых доноров в присутствии ГМДП-А приводит к значительному увеличению их функциональной активности и цитоток-сической активности НК-клеток в отношении клеток НТ-29.
Экспрессия генов перфорина, ИФН-у, рецепторов ИФН-у (К1, Я2) и ИЛ-18 в НК-клетках
Исследование экспрессии генов перфорина, ИФН-у и его рецепторов Я1 и Я2, а также рецептора ИЛ-18 проводили в чистой фракции НК-клеток (93-97%), полученных от здоровых доноров, без дополнительной стимуляции (группа сравнения) и под влиянием стимуляции ГМДП-А (10 мгк/мл) в течение 6 или 16 ч культивирования.
Анализ тестируемого транскриптома НК-клеток продемонстрировал статистически значимое увеличение уровня экспрессии перфорина у всех 5 доноров через 16 ч культивирования в присутствии ГМДП-А и у 2 доноров из 5 наблюдалось увеличение экспрессии гена перфорина через 6 ч культивирования. При изучении влияния ГМДП-А на экспрессию генов ИФН-у и его рецепторов 1-го и 2-го типов в чистой фракции НК-клеток здоровых доноров было показано, что в данной экспериментальной модели ГМДП-А не изменяет их уровень. При этом обнаружено значительное увеличение экспрессии рецептора ИЛ-18 на НК-клетках в присутствии ГМДП-А, причем более значительное увеличение наблюдалось на ранних сроках культивирования (через 6 ч) у всех 5 доноров (табл. 2).
Обсуждение
МДП и их синтетические производные (ГМДП и ГМДП-А) как иммуноактивные гликопептиды бактериальной природы реализуют свои эффекты через связывание с рецептором ЛПС - СБ14, рецепторами 5-НТ и ТЬЯ, а также через специфические для них цитоплаз-матические рецепторы N001 и 2 [25, 26]. МДП и его синтетические аналоги стимулируют различные функции иммунных клеток, повышая продукцию провоспа-
Таблица 1. Влияние ГМДП-А на цитотоксическую активность МНК доноров в отношении клеток линии НТ-29
Соотношение мишень/ эффектор Концентрация ГМДП-А, мкг/мл
0 1 5
1:10 19,2 ± 1,5 48,8 ± 2,01* 57 1 ± 47* **
1:20 38,5 ± 3,2 52,4 ± 4,1* 56,1 ± 3,9*
Примечание. Представлены значения ИЦ (%) (М ± т; п = 25); * - р < 0,05 по отношению к группе сравнения (МНК, не обработанные ГМДП-А); ** - р < 0,05 между МНК, инкубированных с различными концентрациями ГМДП-А.
лительных цитокинов (ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН, ИЛ-12), оксида азота N0, С-реактивного белка и молекул адгезии [27]. Показано, что НК-клетки конститутивно экспрессируют рецептор N002 и их стимуляция с помощью МДП приводит к усилению экспрессии рецепторов ТЬЯ2 и ТЬЯ5, продукции ИФН-у и активации их функций [28]. Причем, что интересно, НК-клетки ин-тернализируют МДП без участия белков-транспортеров, как это происходит, например, в макрофагах и эпителиальных клетках кишечника. При хроническом язвенном колите и болезни Крона в эпителии кишечника начинает продуцироваться транспортный белок №ерТ1, с помощью которого осуществляется транспорт МДП в клетку [29]. Отсутствие этого механизма в НК-клетках приводит к прямой интернализации МДП и быстрому ответу на присутствие грам-позитивных и грам-негативных бактерий. Более того, для передачи сигнала от МДП к N002, локализованному во внутриклеточных везикулах, лизосомальное окисление не требуется, что также ускоряет ответ НК-клеток на МДП [28]. Однако в работе [28], показано, что культивирование чистой фракции НК-клеток в присутствии МДП приводит к незначительному увеличению уровня продукции ИФН-у и количества клеток, экспрессирующих С069 (в 1,52,7 раза по отношению к группе сравнения и при этом не у всех доноров: 5 из 15 образцов), а также незначительному увеличению цитотоксичности. Вместе с тем костимуляция в субоптимальной дозе ИФН-а или ИЛ-12 индуцирует высокий уровень продукции ИФН-у и экспрессии С069 НК-клетками.
Полученные нами данные об отсутствии стимулирующего влияния ГМДП-А на экспрессию генов ИФН-у и его рецепторов НК-клетками здоровых доноров согласуются с приведенным выше исследованием. При этом
следует отметить, что существуют данные о способности ГМДП нормализовать измененный уровень ИФН-у. Так, в работе [30] показано, что у детей с выявленной предрасположенностью к бактериальным инфекциям и инфицированных вирусом Эпштейна-Барр, получавших иммунотропную терапию ликопидом (ГМДП) для предотвращения иммунологической дисфункции и негладкого течения периода реконвалесценции, отмечались достоверное снижение содержания атипичных мононуклеаров в крови (с 9,1 ± 1,2 до 1,0 ± 0,5%) и нормализация уровня ИФН-у (снижение в 1,4 раза). С другой стороны, в работе [31] показано, что культивирование мононуклеарых клеток пациентов с ато-пической бронхиальной астмой в присутствии ГМДП приводит к значительному усилению секреции ИФН-у (более чем в 3 раза при концентрации 5 мкг/мл - со 150 до 500 пг/мл), что свидетельствует о его влиянии на изменение баланса ТЫЛЪ2 в сторону повышения активности ТЫ. При этом у здоровых доноров такой эффект ГМДП отсутствовал.
Анализ транскриптома НК-клеток, культивируемых в присутствии ГДМП-А, свидетельствует, что в клетках усиливается транскрипция генов, продукты которых участвуют в цитолитической активности НК-клеток (перфорин), а также влияют на функциональную активность этих клеток (рецепторы ИЛ-18) и на активацию других ИКК, что влечет за собой стимуляцию всех звеньев иммунной защиты. Эти данные, вероятно, свидетельствуют о том, что ГМДП-А стимулирует оба субтипа НК-клеток, поскольку продукцию перфорина и, соответственно, цитотоксическую активность НК-клеток осуществляет субтип С056ашС016+, а клетки с фенотипом С056Ы8ИС016- характеризуются преимущественно цитокин-продуцирующей функцией [4]. Уве -
Таблица 2. Экспрессия генов в НК-клетках под влиянием ГМДП-А (10 мкг/мл)
Условные обозначения генов Образец
1 2 3 4 5
Время инкубации с ГМД П-А, ч
6 16 6 16 6 16 6 16 6 16
PRF1 (Перфорин) 1,01* 1,84* 0,98 1,83* 1,04 1,85* 1,03 1,86* 1,01 1,80*
IFNG (ИФН-у) 1,06 1,19 1,06 1,12 1,11 1,13 1,23 1,20 1,06 0,95
IFNGR1 (ИФН-у R1) 1,05 1,21 0,93 1,17 0,98 1,19 1,16 1,28 0,87 1,08
IFNGR2 (ИФН-у R2) 0,78 0,87 0,45 0,56 0,61 0,82 0,50 0,61 0,49 0,58
IL18R (Rn-18R) 1,55* 0,43* 1,48* 0,38* 1,74* 0,43* 1,59* 0,44* 1,50* 0,31*
Примечание. Значения отношения 1пА/1пК, где 1пА представляет натуральный логарифм нормализованного значения сигнала в опытной пробе (с ГМПД-А), 1пК- то же самое для контрольной пробы (инкубация клеток в отсутствие ГМПД-А). *р<0,05 по отношению к группе сравнения.
личение уровня экспрессии гена рецептора ИЛ-18 свидетельствует о готовности НК-клеток к запуску каскада событий, связанных с активацией транскрипционных факторов NF-kB, рецептора ИЛ-2 и обусловленной им активации киназ STAT3 и STAT5, что в свою очередь индуцирует экспрессию генов и продукцию факторов, запускающих каскад событий, приводящий к формированию эффективного иммунного ответа на инфекционные и опухолевые антигены [18]. Вероятно, в ситуации in vivo или in vitro в присутствии широкого спектра ИКК и гуморальных факторов, в том числе ИЛ-18, продуцирующегося многими типами иммунных и неиммунных клеток, целесообразность увеличения экспрессии гена рецептора ИЛ-18 будет более очевидна. Эти данные свидетельствуют о том, что для реализации цитотокси-ческой активности НК-клеток в ответ на присутствие МДП требуется участие других типов иммунных клеток, продуцирующих костимулирующие факторы.
В нашей модели клетки-мишени линии НТ-29 (аде-нокарцинома толстой кишки человека), чувствительной к НК-цитотоксичности, культивировали с клетками-эффекторами мононуклеарной фракции периферической крови здоровых доноров, в которой присутствуют,
■ Литература
1. Немцова Е.Р, Безбородова О.А., Морозова Н.Б., Воронцова М.С. и др. Эффективность сочетанного лечения экспериментальных опухолей цитостатическими препаратами и ГМДП-А. Рос. биотерапевт. журн. 2017; 16 (2): 13-22.
2. Cooper M.A., Fehniger T.A., Caligiuri M.A. The biology of human natural killer-cell subsets. Trends Immunol. 2001; 22 (11): 633-40.
3. Lin S.J., Kuo M.L. Cytotoxic function of umbilical cord blood natural killer cells: relevance to adoptive immunotherapy. Pediatr. He-matol. Oncol. 2011; 28 (8): 640-6.
4. Cooper M.A., Fehniger T.A., Turner S.C., Chen K.S. et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56 (bright) subset. Blood. 2001; 97 (10): 3146-51.
5. Street S.E., Cretney E., Smyth M.J. Perforin and interferon-gam-ma activities independently control tumor initiation, growth, and metastasis. Blood. 2001; 97 (1): 192-7.
6. van den Broek M.E., Kagi D., Ossendorp F., Toes R. et al. Decreased tumor surveillance in perforin-deficient mice. J. Exp. Med. 1996; 184: 1781-90.
7. Smyth M.J., Kelly J.M., Baxter A.G., Korner H. et al. An essential role for tumor necrosis factor in natural killer cell-mediated tumor rejection in the peritoneum. J. Exp. Med. 1998; 188 (9): 1611-9.
8. Smyth M.J., Thia K.Y., Cretney E., Kelly J.M. et al. Perforin is a major contributor to NK cell control of tumor metastasis. J. Immunol. 1999; 162 (11): 6658-62.
9. Trinchieri G. Natural killer cells wear different hats: effector cells of innate resistance and regulatory cells of adaptive immunity and of hematopoiesis. Semin. Immunol. 1995; 7 (2): 83-8.
10. Slattery M.L., Lundgreen A., Bondurant K.L., Wolff R.K. Inter-feron-signaling pathway: associations with colon and rectal cancer risk and subsequent survival. Carcinogenesis. 2011; 32 (11): 1660-7.
11. Platanias L.C. Mechanisms of type-I- and type-II-interferonmediated signaling. Nat. Rev. Immunol. 2005; 5 (5): 375-86.
12. Okamura H., Tsutsi H., Komatsu T., Yutsudo M. et al Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells. Na-ture.1995; 378: 88-91.
13. El-Darawish Y., Li W., Yamanishi K., Pencheva M. et al. Frontline Science: IL-18 primes murine NK cells for proliferation by promoting protein synthesis, survival, and autophagy. J. Leukoc. Biol. 2018; 104 (2): 253-64.
14. Micallef M.J., Tanimoto T., Kohno K., Ikeda M. et al. Interleu-kin 18 induces the sequential activation of natural killer cells and cyto-toxic T lymphocytes to protect syngeneic mice from transplantation with Meth A sarcoma. Cancer Res. 1997; 57: 4557-63.
кроме НК-клеток, другие типы ИКК, которые, вероятно, и продуцируют костимулирующие цитокины (ИФН-а, ИЛ-12, ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-18 и др.) в ответ на присутствие ГМДП-А. В результате цитотоксическая активность НК-клеток в отношении клеток-мишеней НТ-29 возрастала в присутствии ГМДП-А (5 мкг/мл) при соотношении клеток мишень/эффектор 1:10 и в 3 раза превышала соответствующий показатель в группе сравнения (с 19,2 ± 1,5 до 57,1 ± 4,7), что свидетельствует об эффективности ГМДП-А в отношении стимуляции функциональной активности и НК-клеток, и клеток-продуцентов костимуляторов.
Таким образом, проведенное исследование свидетельствует о том, что ГМДП-А в дальнейшем можно рассматривать как кандидат для адъювантной неспецифической иммунотерапии злокачественных новообразований, поскольку в наших экспериментах этот агент позитивно влиял на функции НК-клеток, в частности активировал цитотоксическую активность, стимулируя экспрессию гена перфорина, а также был эффективен в отношении цитокин-продуцирующей способности НК-клеток, увеличивая уровень экспрессии рецептора ИЛ-18.
15. Chandrasekar B., Mummidi S., Claycomb W.C., Mestril R. et al. Interleukin-18 is a pro-hypertrophic cytokine that acts through a phos-phatidylinositol 3-kinase-phosphoinositide-dependent kinase-1-Akt-GATA4 signaling pathway in cardiomyocytes. J. Biol. Chem. 2005; 280 (6): 4553-67.
16. Colucci F., Di Santo J.P. The receptor tyrosine kinase c-kit provides a critical signal for survival, expansion, and maturation of mouse natural killer cells. Blood. 2000; 95 (3): 984-91.
17. Hodge D.L., Subleski J.J., Reynolds D.A., Buschman M.D. et al The proinflammatory cytokine interleukin-18 alters multiple signaling pathways to inhibit natural killer cell death. J. Interferon Cytokine Res. 2006; 26 (10): 706-18.
18. Tomura M., Zhou X.Y., Maruo S., Ahn H.J. et al. A critical role for IL-18 in the proliferation and activation of NK1.1 + CD3- cells. J. Immunol. 1998; 160 (10): 4738-46.
19. Hodge G., Barnawi J., Jurisevic C., Moffat D. et al. Lung cancer is associated with decreased expression of perforin, granzyme B and interferon (IFN)-y by infiltrating lung tissue T cells, natural killer (NK) T-like and NK cells. Clin. Exp. Immunol. 2014; 178 (1): 79-85.
20. Geller M.A., Miller J.S. Use of allogeneic NK cells for cancer immunotherapy. Immunotherapy. 2011; 3: 1445-59.
21. Biassoni R., Ugolotti E., De Maria A. NK cell receptors and their interactions with MHC. Curr. Pharm. Des. 2009; 15 (28): 3301-10.
22. Raffaghello L., Prigione I., Airoldi I., Camoriano M. et al. Downregulation and/or release of NKG2D ligands as immune evasion strategy of human neuroblastoma. Neoplasia. 2004; 6: 558-68.
23. Song H., Kim J., Cosman D., Choi I. Soluble ULBP suppresses natural killer cell activity via down-regulating NKG2D expression. Cell. Immunol. 2006; 239: 22-30.
24. Rohner A., Langenkamp U., Siegler U., Kalberer C.P. et al. Differentiation promoting drugs up-regulate NKG2D ligand expression and enhance the susceptibility of acute myeloid leukemia cells to natural killer cell-mediated lysis. Leuk. Res. 2007; 31: 393-402.
25. Girardin S.E., Travassos L.H., Hervé M., Blanot D. et al. Pep-tidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and NOD-2. J. Biol. Chem. 2003; 278 (43): 41 702-8.
26. Inohara N., Ogura Y., Fontalba A., Gutierrez O. et al. Host recognition of bacterial muramyl dipeptide mediated through NOD2. Implications for Crohn's disease. J. Biol. Chem. 2003; 278 (8): 5509-12.
27. van der Meer J.H., Netea M.G., Dinarello C.A. Modulation of muramyl dipeptide stimulation of cytokine production by blood components. Clin. Exp. Immunol. 2009; 156 (3): 428-33.
28. Athie-Morales V., O'Connor G.M., Gardiner C.M. Activation of human NK cells by the bacterial pathogen-associated molecular pattern muramyl di-peptide. J. Immunol. 2008; 180 (6): 4082-9.
29. Vavricka S.R., Musch M.W., Chang J.E., Nakagawa Y. et al. hPepTl transports muramyl dipeptide, activating NF-kappaB and stimulating IL-8 secretion in human colonic Caco2/bbe cells. Gastroenterology. 2004; 127 (5): 1401-9.
30. Колесникова Н.В., Андронова Т.М. Клинико-иммуноло-гическая эффективность и целесообразность использования им-
■ References
1. Nemtsova E.R., Bezborodova O.A., Morozova N.B., Voront-sova M.S., et al. Efficiency of combined treatment of experimental tumors with cytostatic drugs and GMDP-A. Rossiyskiy bioterapevtiches-kiy zhurnal. 2017; 16 (2): 13-22. (in Russian)
2. Cooper M.A., Fehniger T.A., Caligiuri M.A. The biology of human natural killer-cell subsets. Trends Immunol. 2001; 22 (11): 633-40.
3. Lin S.J., Kuo M.L. Cytotoxic function of umbilical cord blood natural killer cells: relevance to adoptive immunotherapy. Pediatr. He-matol. Oncol. 2011; 28 (8): 640-6.
4. Cooper M.A., Fehniger T.A., Turner S.C., Chen K.S., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56 (bright) subset. Blood. 2001; 97 (10): 3146-51.
5. Street S.E., Cretney E., Smyth M.J. Perforin and interferon-gam-ma activities independently control tumor initiation, growth, and metastasis. Blood. 2001; 97 (1): 192-7.
6. van den Broek M.E., Kagi D., Ossendorp F., Toes R., et al. Decreased tumor surveillance in perforin-deficient mice. J. Exp. Med. 1996; 184: 1781-90.
7. Smyth M.J., Kelly J.M., Baxter A.G., Körner H., et al. An essential role for tumor necrosis factor in natural killer cell-mediated tumor rejection in the peritoneum. J. Exp. Med. 1998; 188 (9): 1611-9.
8. Smyth M.J., Thia K.Y., Cretney E., Kelly J.M., et al. Perforin is a major contributor to NK cell control of tumor metastasis. J. Immunol. 1999; 162 (11): 6658-62.
9. Trinchieri G. Natural killer cells wear different hats: effector cells of innate resistance and regulatory cells of adaptive immunity and of hematopoiesis. Semin. Immunol. 1995; 7 (2): 83-8.
10. Slattery M.L., Lundgreen A., Bondurant K.L., Wolff R.K. Inter-feron-signaling pathway: associations with colon and rectal cancer risk and subsequent survival. Carcinogenesis. 2011; 32 (11): 1660-7.
11. Platanias L.C. Mechanisms of type-I- and type-II-interferonmediated signaling. Nat. Rev. Immunol. 2005; 5 (5): 375-86.
12. Okamura H., Tsutsi H., Komatsu T., Yutsudo M., et al Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells. Na-ture.1995; 378: 88-91.
13. El-Darawish Y., Li W., Yamanishi K., Pencheva M., et al. Frontline Science: IL-18 primes murine NK cells for proliferation by promoting protein synthesis, survival, and autophagy. J. Leukoc. Biol. 2018; 104 (2): 253-64.
14. Micallef M.J., Tanimoto T., Kohno K., Ikeda M., et al. Interleu-kin 18 induces the sequential activation of natural killer cells and cyto-toxic T lymphocytes to protect syngeneic mice from transplantation with Meth A sarcoma. Cancer Res. 1997; 57: 4557-63.
15. Chandrasekar B., Mummidi S., Claycomb W.C., Mestril R., et al. Interleukin-18 is a pro-hypertrophic cytokine that acts through a phosphatidylinositol 3-kinase-phosphoinositide-dependent kinase-1-Akt-GATA4 signaling pathway in cardiomyocytes. J. Biol. Chem. 2005; 280 (6): 4553-67.
16. Colucci F., Di Santo J.P. The receptor tyrosine kinase c-kit provides a critical signal for survival, expansion, and maturation of mouse natural killer cells. Blood. 2000; 95 (3): 984-91.
мунотропной терапии при герпетической инфекции у детей. Эффективная фармакотер. 2016; 2 (21). URL: http://umedp.ru/articles/ klinikoimmunologicheskaya_effektivnost_i_tselesoobraznost_ispol-zovaniya_immunotropnoy_terapii_pri_ge.html.
31. Козлов И.Г., Колесникова Н.В., Воронина Е.В., Гурьянова С.В. и др. Глюкозаминилмурамилдипептид и другие агонисты рецепторов врожденного иммунитета в патогенетической терапии аллергических заболеваний. Аллергология и иммунология. 2013; 14 (4): 281-7.
17. Hodge D.L., Subleski J.J., Reynolds D.A., Buschman M.D., et al. The proinflammatory cytokine interleukin-18 alters multiple signaling pathways to inhibit natural killer cell death. J. Interferon Cytokine Res. 2006; 26 (10): 706-18.
18. Tomura M., Zhou X.Y., Maruo S., Ahn H.J., et al. A critical role for IL-18 in the proliferation and activation of NK1.1+ CD3- cells. J. Immunol. 1998; 160 (10): 4738-46.
19. Hodge G., Barnawi J., Jurisevic C., Moffat D., et al. Lung cancer is associated with decreased expression of perforin, granzyme B and interferon (IFN)-y by infiltrating lung tissue T cells, natural killer (NK) T-like and NK cells. Clin. Exp. Immunol. 2014; 178 (1): 79-85.
20. Geller M.A., Miller J.S. Use of allogeneic NK cells for cancer immunotherapy. Immunotherapy. 2011; 3: 1445-59.
21. Biassoni R., Ugolotti E., De Maria A. NK cell receptors and their interactions with MHC. Curr. Pharm. Des. 2009; 15 (28): 3301-10.
22. Raffaghello L., Prigione I., Airoldi I., Camoriano M., et al. Downregulation and/or release of NKG2D ligands as immune evasion strategy of human neuroblastoma. Neoplasia. 2004; 6: 558-68.
23. Song H., Kim J., Cosman D., Choi I. Soluble ULBP suppresses natural killer cell activity via down-regulating NKG2D expression. Cell. Immunol. 2006; 239: 22-30.
24. Rohner A., Langenkamp U., Siegler U., Kalberer C.P., et al. Differentiation promoting drugs up-regulate NKG2D ligand expression and enhance the susceptibility of acute myeloid leukemia cells to natural killer cell-mediated lysis. Leuk. Res. 2007; 31: 393-402.
25. Girardin S.E., Travassos L.H., Hervé M., Blanot D., et al. Pep-tidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and NOD-2. J. Biol. Chem. 2003; 278 (43): 41 702-8.
26. Inohara N., Ogura Y., Fontalba A., Gutierrez O., et al. Host recognition of bacterial muramyl dipeptide mediated through NOD2. Implications for Crohn's disease. J. Biol. Chem. 2003; 278 (8): 5509-12.
27. van der Meer J.H., Netea M.G., Dinarello C.A. Modulation of muramyl dipeptide stimulation of cytokine production by blood components. Clin. Exp. Immunol. 2009; 156 (3): 428-33.
28. Athié-Morales V., O'Connor G.M., Gardiner C.M. Activation of human NK cells by the bacterial pathogen-associated molecular pattern muramyl di-peptide. J. Immunol. 2008; 180 (6): 4082-9.
29. Vavricka S.R., Musch M.W., Chang J.E., Nakagawa Y., et al. hPepT1 transports muramyl dipeptide, activating NF-kappaB and stimulating IL-8 secretion in human colonic Caco2/bbe cells. Gastroenterology. 2004; 127 (5): 1401-9.
30. Kolesnikova N.V., Andronova T.M. Clinical and immunologi-cal efficacy and expediency of using immunotropic therapy for herpes infection in children. Effektivnaya farmakoterapiya. 2016; 2 (21). URL: http://umedp.ru/articles/klinikoimmunologicheskaya_effektivnost_i_ tselesoobraznost_ispolzovaniya_immunotropnoy_terapii_pri_ge.html. (in Russian)
31. Kozlov I.G., Kolesnikova N.V., Voronina E.V., Guryanova S.V., et al. Glucosaminylmuramyldipeptide and other agonists of innate immunity receptors in the pathogenetic treatment of allergic diseases. Allergologiya i immunologiya. 2013; 14 (4): 281-7. (in Russian)
