МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ
С.П. Свитина, Ж.Ю. Сидорова, Ю.С. Дрижун, А.А. Жернякова, И.И. Кострома, С.И. Капустин, С.В. Грицаев
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ И АУТОЛОГИЧНАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК У БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ
МИЕЛОМОЙ
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии федерального медико-биологического агентства», г. Санкт-Петербург
Введение. Трансплантация аутологичных гемопоэтиче-ских стволовых клеток (ауто-ТГСК) у некоторых пациентов с множественной миеломой (ММ) не приводит к улучшению качества ответа, что может негативно отразиться на эффективности лечения. Участие некоторых цитокинов в регуляции кроветворения и иммунного ответа у больных ММ позволяет предположить их возможную роль в качестве негативных предикторов ответа на терапию.
Цель. Оценить влияние полиморфизма ряда генов иммунной системы (IL-6, TNF-A, IL-1B, IL-10) на эффективность ауто-ТГСК у пациентов с ММ.
Материалы и методы. В исследование включены 28 пациентов с Мм (15 мужчин и 13 женщин, средний возраст 53,7 ± 6,8 года), всем пациентам была проведена ауто-ТГСК. Улучшение качества ответа после первой ауто-ТГСК констатировано у 16 (57,1%) пациентов, тогда как у 12 (42,9%) больных улучшение качества ответа не наблюдалось. Генотипирование ал-лельного полиморфизма IL-6 -174G /С, TNF-A -308G/A, IL-1B -31T/C, IL-10 -592C/A проводили методом ПЦР-ПДРФ. Для выявления межгрупповых различий в распределении генотипов использовали точный метод Фишера, с определением коэффициента отношения шансов (OR - odds ratio) и р-значения.
Результаты. Частоты встречаемости генотипов Т№-А, 1В и ^-10 существенно не отличались в группах пациентов с или без улучшения качества ответа после ауто-ТГСК. Однако доля гомозигот по редкому аллелю -592А гена ^-10 была почти в 3 раза выше у пациентов с улучшением качества ответа, чем у пациентов без него (20,0% против 8,3% соответственно; р=0,12; OR=3,3). Частота встречаемости генотипа ^-1В -31ТТ также была увеличена в группе пациентов с эффективной ауто-ТГСК по сравнению с группой «без улучшения» (37,5% против 16,7%, соответственно; р=0,4; OR=3,0). Статистически значимое различие между группами пациентов было зафиксировано при оценке распределения генотипов ^-6. Доля носителей аллеля ^-6 -174С среди пациентов с улучшением качества ответа была почти в 2 раза выше (81,3% против 41,6% в группе без улучшения; р=0,05; OR=6,1).
Выводы. Результаты данного исследования позволили обнаружить возможную связь между полиморфизмом гена ^-6 -174G /С и эффективностью ауто-ТГСК у пациентов с ММ. Необходимы дальнейшие исследования, с расширением группы больных для уточнения значимости вариаций генов иммунной системы в прогнозировании эффективности ауто-ТГСК у пациентов с ММ.
Н.А. Северина, Ю.В. Сидорова, Б.В. Бидерман, Н.В. Рисинская, Е.Б. Ликольд, О.А. Глинщикова, А. С. Пшеничный,
А.Б. Судариков
СОПОСТАВЛЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДИК ВЫЯВЛЕНИЯ НЕСТАНДАРТНОЙ ВСТАВКИ ГЕНА NPM1 У БОЛЬНЫХ ОМЛ
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва
Введение. №М1 (нуклеофозмин 1) - онкоген, состоящий из 12 экзонов, расположен в локусе 5q35. Мутация гена №М1 - самое частое генетическое нарушение при острых миелоидных лейкозах (ОМЛ), выявляется в 25-30% ОМЛ. До 90% мутаций приходится на 4-х нуклеотидную вставку в положении 956-959 экзона. 75-80% мутаций имеют вставку типа "А" - ТСТО, 10-14% приходится на вставки типа и "В" - ССТО и САГС. «Золотой стандарт» исследования мутаций гена №М1 - метод фрагмент-ного анализа (ФА). Для более точного определения стандартных вставок используют метод аллель-специфичной ПЦР (АС-ПЦР). Однако, встречаются нестандартные вставки, отличающиеся по длине, нуклеотидной последовательности и месту расположения от стандартных. Такие образцы требуют проведения секве-нирования для уточнения данных о наличии вставки.
Цель. Сопоставление данных различных методик выявления нестандартной вставки гена ЫРМ1 у больных ОМЛ и анализа ее последовательности.
Материалы и методы. Для анализа наличия и типа мутации гена ЫРМ1 исследовали ДНК пациентов с ОМЛ, наблюдавшихся в "НМИЦ Гематологии" в 2020г. При первичной диагностике методом ФА выявляли наличие вставки в 12 экзоне гена ЫРМ1. При отсутствии вставки выявляется 1 продукт длиной 330 пар нуклеотидов (нп), при наличии вставки выявляются 2 продукта, имеющих длину 330 и 334 нп, соответственно. ФА проводили в трех повторах для оценки воспроизводимости результатов и исключения артефактов. АС-ПЦР подтверждали наличие или отсутствие стандартной вставки. Если вставка не подтверждалась АС-ПЦР, данные образцы анализировались
методами секвенирования по Сэнгеру и/или следующего поколения (NGS).
Результаты. За 2020 г. после проведения ФА и АС-ПЦР было выявлено 15 случаев, когда по данным ФА был определен дополнительный продукт, но по результатам АС-ПЦР вставка не подтверждалась: 3 образца с мутантным пиком, отличающимся на 1 нуклеотид (+/-1нп) от дикого, 1 образец со вставкой +2 нп, 1 образец с делецией 4 нп, 10 пациентов со вставкой +4 нп. У всех 10 пациентов со стандартной картиной ФА (+4 нп) было подтверждено наличие вставки в 12 экзоне секвениро-ванием по Сэнгеру. При этом вставка имела либо нестандартную нуклеотидную последовательность, либо нестандартное расположение. В двух случаях из этих 10 было невозможно точно установить нуклеотидную последовательность вставки с помощью секвенирования по Сэнгеру из-за гетерогенности ПЦР-продукта. Наличие поли-Т фрагмента в интроне, близко расположенном к экзону гена №М1, затрудняет прочтение последовательности в обе стороны. У этих 2-х пациентов с помощью NGS выявили сложный характер изменений в 12 экзоне гена №М1 (вставка + делеция + нуклеотидные замены). В остальных 5 образцах при секвенировании по Сэнгеру и NGS не выявили вставок /делеций в экзоне. В одном образце была выявлена делеция 4-х нуклеотидов в интроне (в области поли-Т), которая могла привести к ложноположительной картине на ФА со смещением дикого и мутантого пиков относительно референсных значений. В 4х образцах с короткой вставкой/ делецией (1-2 нп) были выявлены нуклеотидные замены в интроне. Возможно, они приводили к изменению электрофо-
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVII, № 2, 2021
ретической подвижности продуктов при ФА, создавая картину наличия мутантного пика при исследовании гена ОТМ1.
Заключение. При проведении анализа гена №М1 требуется комплексный подход. При выявлении нестандартной картины ФА (вставка меньшей длины, смещение пиков) обязательно требуется подтверждение наличия мутации методом
секвенирования, так как значительная часть этих случаев может оказаться артефактами. Метод секвенирования по Сэнгеру не всегда, в отличие от NGS, позволяет уточнить характер изменений в гене ОТМ1. Кроме того, метод NGS обладает большей чувствительностью, что может быть принципиальным при анализе мутаций с небольшой аллельной нагрузкой.
Н.А. Северина, Е.С. Нестерова, Б.В. Бидерман, Е. Б. Ликольд, А.Б. Судариков, Т.Н. Обухова, А.М. Ковригина, С.К. Кравченко,
Э.Г. Гемджян, В.Г. Савченко
МУТАЦИИ ГЕНА EZH2 И РЕАРАНЖИРОВКА ГЕНА BCL-2 ПРИ ФОЛИКУЛЯРНОЙ
ЛИМФОМЕ
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва
Введение. Фолликулярная лимфома (ФЛ) - это вторая по частоте встречаемости В-клеточная неходжкинская лимфома, составляющая 25% от всех впервые диагностированных лим-фом в России. Клиническое течение заболевания вариабельно и ассоциировано с морфологией опухоли: прогноз при 1-2 и ЗА цитологическом типе благоприятнее, чем при ЗВ типе и в случае трансформации ФЛ в агрессивные В-клеточные лимфомы. Гетерогенность ФЛ наблюдается и среди случаев индолент-ной ФЛ (1-2 и ЗА цитологический тип). Вариабельность заболевания может объясняться различными патогенетическими механизмами („линейный" и дивергентный пути) развития опухолевых клеток, что характеризуется определенными генетическими маркерами. BCL-2 и EZH2 - ранние маркеры ФЛ, и изменения, связанные с ними, подтверждают «линейный» путь развития опухолевых клеток. Исследование интронных полиморфизмов гена EZH2 показало, что rs_207240 ассоциирован с риском развития солидных опухолей (рака желудка).
Цель. Исследовать частоту мутаций в 16 экзоне и интрон-ный полиморфизм rs_2072407 гена EZH2 и реаранжировку гена BCL-2 у пациентов с индолентной ФЛ, сравнить полученные результаты с иммуноморфологическими характеристиками опухоли; определить прогностическую значимость выявленных изменений.
Материалы и методы. В проспективное исследование, проведённое c января 2017 г. по декабрь 2020 г., включено 58 больных (23 мужчин и 25 женщин, с медианой возраста 53 года) с впервые диагностированной ФЛ. В биоптатах лимфатических узлов, взятых до начала терапии, был исследован мутационный статус гена EZH2 (16 экзон и интронный полиморфизм rs_2072407) и реаранжировка гена BCL-2 (кариотипирование или FISH исследование). Всем пациентам проводилась иммуно-химиотерапия антрациклин-содержащими режимами с ритук-симабом (R-CHOP/R-EPOCH).
Результаты. К ФЛ 1-2 типа были отнесены 27/58 (47%) больных, 3А типа - 31/58(53%). Реаранжировка гена BCL-2 выявлена у 40/58 (67%): при 1-2 цитологическом - 22/40 (57%) случаях, при ЗА типе - в 17/40 (43%). Реаранжировка не выявлены у 18/58 (31%) больных: 4/18 (22%) - при 1-2 цитологическом типе, 14/18 (78%) - при 3А типе. Неблагоприятные события (ранний рецидив/прогрессия/смерть от прогрессии)
зарегистрированы у 13/18 (72%) больных при отсутствии ре-аранжировки гена Б^-2, и у 5/40 (13%) - при наличии реаран-жировки гена Б^-2. Наличие реаранжировки гена Б^-2 ассо-цировано с благоприятным прогнозом (р <0,001 по критерию Пирсона).
Мутации в гене EZH2 У646 (тШ^7Н2) обнаружены у 10/58 (17%) пациентов, у одного пациента было выявлено одновременно 2 мутации: К639N и У646№ В группе тШ^7Н2 1-2 цитологический тип ФЛ диагностирован в 4/10 (40%) случаях, ЗА - 6/10 (60%). Неблагоприятные события наблюдались у 4/10(40%) пациентов с mutEZH2 без реаранжировки гена Б^-2 (2/4). В группе и с реаранжировкой гена Б^-2 не-
благоприятные события - 2/6 (летальных исходов, связанных с прогрессией, не было). Дикий тип EZH2 (wEZH2) диагностирован у 48/58 (83%) пациентов. В этой группе 1-2 цитологический тип ФЛ был диагностирован в 23/48 (46%) случаях, ЗА
- 25/48 (52%). Реаранжировка гена Б^-2 определялась у 34/48 (71%): при 1-2 цитологическом типе в 20/34 (59%), при 3А типе
- в 14/34 (35%). Неблагоприятные события в группе wEZH2 наблюдались у 15/48(25%) пациентов: у 11/15 (73%) при отсутствии реаранжировки гена Б^-2 и 4/15 (27%) при наличии реаранжировки. Аллель 00 в ^_2072407 представлен в 18/58 (31%) случаях, АО - у 25/58 (43%) АА у 15/58(26%). Частоты встречаемости аллелей в Европейской популяции 00 - 42%, АО - 0,48% и АА-11%. Вариант аллеля 00 ассоциирован с наличием реаранжировки гена Б^-2 15/15, wEZH2 14/15(93%) и отсутствием неблагоприятных событий 15/15 (р <0,001 по критерию Пирсона).
Выводы. Мутации в гене EZH2 встречаются в 17% случаев, как при 1-2, так и 3А цитологическом типе ФЛ. Случаи mutEZH2 с реаранжировкой Б^-2 характеризуются длительным, но постоянно рецидивирующим течением. Случаи wEZH2 типа без реаранжировки Б^-2 имеют высокий риск трансформации в ДВККЛ и высокую вероятность летального исхода.
Наиболее значимым фактором, ассоциированным с благоприятным прогнозом, является сочетание реаранжировка Б^-2 с гаплотипом 00 ге_2072407 гена EZH2 (р <0,001). Результаты данного исследования планируется подтвердить на большей выборке пациентов и сопоставить с данными различных контрольных групп.