CC BY
8
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVII, № 2, 2021
НМИЦ гематологии в период с сентября 2015 года по декабрь 2020 года. Все пациенты были в первой полной морфологической ремиссии перед алло-ТГСК. Медиана наблюдения за пациентами составила 16,8 (1-55) месяцев. С целью определения МОБ всем пациентам было выполнено иммунофеноти-пическое исследование образцов костного мозга с помощью 6-цветной МПЦ (BD FACS Canto II, США) непосредственно перед алло-ТГСК. МОБ методом МПЦ выявляли с помощью сочетания двух подходов: метод «пустых мест» и поиск клеток с лейкоз-ассоциированным иммунофенотипом. У 46 пациентов из 103 в дебюте заболевание выявлялись молекулярные маркеры, такие как NPM1, FLT3, RUNX1-RUNX1T1, MLL и CBF0-MYH11, что позволило определить МОБ-статус у этих пациентов с помощью ПЦР. Общую (ОВ) и безрецидивной выживаемость (БРВ), а также вероятность развития рецидива (ВРР) рассчитывали по методу Каплана-Майера. Сравнение показателей выживаемости в группах выполняли при помощи logrank теста. Статистически значимыми считали различия при p <0,05.
Результаты. С помощью МПЦ из 103 пациентов у 19 (18,4%) был определен МОБ-позитивный статус (МОБ+). Из 42 пациентов, имевших молекулярные маркеры, МОБ методом ПЦР была выявлена у 12 (28,6%) пациентов. У 9 пациентов МОБ выявлялась при МПЦ и ПЦР исследовании (МОБ+/+), 3 пациента были МОБ-позитивны только при ПЦР (МОБ ПЦР+МПЦ-), 10 пациентов были МОБ+ только методом МПЦ (МОБ МПЦ+) из них 1 больная имела молекулярный маркер и была МОБ- методом ПЦР, 33 пациента были МОБ-негативны двумя методами (МОБ -/-), 48 пациентов были МОБ- только
методом МПЦ (МОБ МПЦ-), ПЦР исследование им не проводилось. Мы объединили в одну группу всех МОБ+ пациентов, вне зависимости от метода исследования, и сравнили результаты алло-ТГСК МОБ+ пациентов, МОБ МПЦ- и МОБ -/-: у пациентов с МОБ+ статусом была достоверно худшая ОВ (44% против 58% против 92%, р=0,0035), БРВ (30% против 52% против 92%, р<0,0001) и более высокую ВРР (67% против 16% против 0%, р<0,0001). Кроме того, необходимо отметить, что МОБ-/-пациенты имели достоверно лучшую БРВ по сравнению с МОБ МПЦ- пациентами (92% против 52%, р=0,009б). Мы проанализировал результаты алло-ТГСК у МОБ+ и МОБ- пациентов в зависимости от метода детекции МОБ и получили схожие данные, статистический анализ выявил значимые различия между МОБ+ и МОБ-негативными пациентами, вне зависимости от метода исследования: у пациентов с МОБ+ статусом была худшая ОВ (МПЦ: 35% против 67%, р=0,0003; ПЦР: 59% против 92%, р=0,0059), БРВ (МПЦ: 20% против 63%, р<0,0001; ПЦР: 40% против 88%, <0,0001) и более высокую ВРР (МПЦ: 77% против 11%, р<0,0001; ПЦР: 56% против 5%, <0,0001).
Выводы. Детектируемая перед алло-ТГСК МОБ - прогностический фактор риска развития рецидива, оказывающий влияние на ОВ и БРВ, вне зависимости от метода определения (МПЦ или ПЦР). Исследование МОБ у пациентов с ОМЛ непосредственно перед выполнением трансплантации аллогенно-го костного мозга может использоваться для стратификации риска алло-ТГСК и выявления пациентов, которым необходимо проведение профилактической посттрансплантационной терапии с целью предотвращения рецидива заболевания.
Д.В. Курочкин1, Т.Н. Субботина12, Е.А. Дунаева3, К.О. Миронов3, А.С. Хазиева4, Е.В. Васильев4
СКРИНИНГ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ CALR С ПОМОЩЬЮ
HRM-АНАЛИЗА
1Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский федеральный
университет», г.Красноярск 2Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный Сибирский научно-клинический центр
Федерального медико-биологического агентства», г. Красноярск 3Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, г. Москва
4Краевое государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Краевая клиническая больница», г. Красноярск
Введение. В соответствии с клиническими рекомендациями ВОЗ, анализ соматических мутаций в гене CALR, а также мутаций в генах JAK2 и MPL включен в список критериев диагностики Ph-миелопролиферативных новообразований (Ph-МПН). В гене CALR было обнаружено более 50 различных вариантов мутации, среди которых наиболее частыми являются делеция 52 п.н. (p.L367fs * 46), также называемая типом 1, и вставка 5 п.н. (p.K385fs * 47), также называемая типом 2 (88%). Остальные 12% - это менее частые вставки, делеции или их комбинации. Поэтому важно разработать недорогой скрининговый тест, который может обнаружить любые мутации в анализируемом фрагменте ДНК гена CALR.
Цель. Целью этого исследования был скрининг CALR мутаций с помощью HRM-анализа с использованием термо-циклера CFX96 и программного обеспечения Precision Melt Analysis (Bio-Rad, США) у пациентов с Ph-МПН.
Материалы и методы. В исследование были включены 12 CALR«+» образцов ДНК с различными вариантами мутаций от пациентов с диагнозом Ph-МПН. Уровень аллельной нагрузки находился в диапазоне 27 - 50%. HRM-анализ выполняли с использованием набора реагентов Precision Melt Supermix в присутствии красителя Eva Green (Bio-Rad, США). ПЦР с дополнительной стадией плавления с высоким разрешением проводили на приборе CFX96 (Bio-Rad, США) по следующей программе: денатурация при 95° C в течение 2 минут, затем 40 циклов при 95° C в течение 10 секунд, 57° C
в течение 30 секунд и 72° C в течение 30 секунд. Программа плавления с высоким разрешением состояла из денатурации при 95° C в течение 30 секунд, ренатурации при 60° C в течение 1 минуты и плавления при 60-95° C с градиентом 0,2° C в 10 секунд. Для наиболее распространенных вариантов CALR мутаций (c.1092_1143del и c.1154_1155insTTGTC) был проанализирован порог обнаружения мутантного ал-леля. Для этого было выполнено разведение заклониро-ванных образцов дикого типа и с мутацией для получения проб с различными уровнями аллельных нагрузок 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13% несущих выявленные ранее мутации.
Результаты. По результатам анализа CALR «+» образцов в программе «Precision Melt Analysis» все кривые плавления продуктов амплификации четко разделены на 3 кластера относительно образцов без мутаций. В частности, три CALR«+» образца с классической мутацией типа 2 (c.1154_1155insTTGTC) и образец с мутацией (c.1154_1155insGTGTC) были отнесены в единый кластер №1. Шесть других образцов с мутацией типа 1 (c.1092_1143del) и образец с мутацией (с.1111_114^еЦ также были отнесены к одному кластеру №2. Образец с сочетанными мутациями (cmB^minsCTTTGCTT и c.1131_1133delAGA) был отнесен к отдельному кластеру №3. Порог обнаружения в случае анализа мутаций c.1092_1143del и c.1154_1155insTTGTC составил 12,5% наличия мутантного аллеля в образце.
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ
Выводы. Используемый метод позволил выявить все варианты мутаций в гене CALR. Таким образом, HRM-анализ, проведенный на CFX96, позволяет проводить скрининг высокоспецифичных мутаций в 9 экзоне гена CALR для диагно-
стики Р^МПН. Включение такого скринингового исследования в алгоритм лабораторного тестирования повышает эффективность и доступность молекулярно-генетических технологий в диагностике Р^МПН.
О.В. Лазарева1, Е.С. Малолеткина1, В.Н. Двирнык1, Т.Ц. Гармаева1,2, В.Г. Савченко1
ДОСТУПНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ (ЦГ) И МОЛЕКУЛЯРНО-
ГЕНЕТИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ (МГТ) НА ЭТАПАХ ОКАЗАНИЯ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОЙ, В ТОМ ЧИСЛЕ ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНОЙ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ (СМП И ВМП) ПРИ ГЕМОБЛАСТОЗАХ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ВЫЕЗДНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ В 80 СУБЪЕКТАХ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр
гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва 2Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов», г. Москва
Введение. В рамках проведения выездных мероприятий (ВМ) с целью организационно-методического и научно-методического руководства медицинскими организациями (МО) субъектов РФ по повышению качества, эффективности и доступности оказания СМП и ВМП по профилю «гематология/ онкология» осуществлена оценка использования ЦГ и МГТ в диагностике, определении тактики лечения и прогноза, мониторинге минимальной остаточной болезни (МОБ) при гемобластозах в соответствии с актуальными клиническими рекомендациями.
Цель. Оценить возможности применения ЦГ и МГТ в диагностике и мониторинге терапии больных гемобластозами в 80 субъектах РФ по результатам ВМ.
Материалы и методы. Организация проведения ВМ осуществлялась в соответствии с регламентами Минздрава России. Участниками ВМ проведена экспертная оценка качества оказания и организации гематологической службы в регионе, в том числе на основе разработанных чек-листов, опросников, данных федеральной статистической отчетности, анализа медицинской документации, обсуждений основных проблем диагностики сложных случаев, контроля выполнения рекомендаций экспертов НМИц гематологии по заключениям телемедицинских консультаций в части лабораторно-диагностических возможностей, а также оснащенности, инфраструктуры лабораторных служб МО субъектов РФ, маршрутизации профильных и смежных пациентов и логистике их биологических образцов для верификации диагноза, выбора программной терапии, мониторинга МОБ, эффективности терапии во время визитов во все профильные и смежные подразделения всех МО гематологической и смежных служб субъектов РФ.
Всего посетили 80 субъектов РФ, 90 городов и городских округа, 3 филиала НМИц гематологии - Алтайский (г. Барнаул), Красноярский (г. Красноярск) и Северный (г. Архангельск).
Результаты. За 2019-2020 годы проведено 96 ВМ, из них в профильные МО 3 уровня (областные, краевые, республиканские, окружные больницы) - 80, МО 2 уровня (городские больницы) - 26, МО 1 уровня (поликлиники) - 36, онкологические диспансеры - 52, учреждения переливания крови - 85, федеральные центры и клиники - 5 (гг. Чебоксары, Уфа, Саратов, Благовещенск, Чита). По предварительной оценке возможностей лабораторно-диагностических служб 80 субъектов РФ показано: цитологические исследования, включая анализ признаков дисплазии ростков кроветворения, выполняют в полном объеме в 31 из 80 субъектов РФ (39%); цитохимические исследования в полном объеме - в 35 (44%), вообще не проводят эти исследования в Чукотском
АО, Республике Ингушетия; иммунохимические исследования сыворотки крови и мочи в полном объеме - в 28 (35%), лекарственный мониторинг с определением концентраций метотрексата, циклоспорина - в 21 (26%), в 14 из 21 (66,7%) выполняют только один из указанных тестов); проточная цитофлуориметрия по чек-листам внедрена в 52 субъектах РФ, однако, только в половине из них присутствуют необходимое оборудование и обученный персонал. ЦГ и МГ исследования больным гемобластозами возможно выполнить в 21 из 80 субъектов РФ (26%), но в половине из них определяют только единичные маркеры хронических миелопролифера-тивных заболеваний. При анализе маршрутизации профильных пациентов и биоматериала выявлено, что большинство МО 80 субъектов РФ направляют на ЦГ и МГ исследования в федеральные центры гг. Москва и Санкт-Петербург. Ключевым вопросом доступности диагностики и охвата ЦГ и МГТ больных на всех этапах оказания СМП и ВМП в регионах, включая определение МОБ при гемобластозах, является финансирование оплаты исследований. В ряде субъектов РФ частично решают эти вопросы, заключая договоры на выполнение ЦГ и МГ методов исследований в центрах Москвы и СПб, исключительно на момент диагностики заболевания. Для большинства же пациентов (65% субъектов РФ, где данные вопросы не решены), финансирование возможности/необходимости выполнения и транспортировки биообразцов на ЦГ и МГ исследования происходит за счет собственных средств больного и родственников, включая оценку эффективности лечения и мониторинга МОБ.
Выводы. При описательном анализе данных возможностей современной лабораторно-диагностической службы субъектов РФ по определению МОБ больным гемобласто-зами с помощью ЦГ и МГТ представлен довольно низкий уровень доступности выполнения высокотехнологичных методов исследований на этапах оказания СМП и ВМП, что, несомненно, влияет на качество оказания медицинской помощи профильным больным в субъектах РФ.
