CC BY
51УДК 633.63:575.2
http//doi.org/10.24411/2413-5518-2020-10302
Скрининг селекционных материалов сахарной свёклы на наличие генов устойчивости к засолению
А.А. НАЛБАНДЯН, канд. биолог. наук, зав. лабораторией (e-mail: arpnal@rambler.ru);
А.С. ХУССЕЙН, канд. биолог. наук, ст. научн. сотрудник; Т.П. ФЕДУЛОВА, д-р биолог. наук, вед. научн. сотрудник; И.В. ЧЕРЕПУХИНА, канд. биолог. наук, ст. научн. сотрудник; Т.И. КРЮКОВА, канд. с/х. наук, ст. научн. сотрудник; Т.С. РУДЕНКО, мл. научн. сотрудник; Н.Р. МИХЕЕВА, мл. научн. сотрудник; А.В. МОИСЕЕНКО, научн. сотрудник ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова»
Введение
Влияние абиотических стрессоров на растения сахарной свёклы крайне негативно сказывается на урожае данной культуры, что является большой проблемой для продовольственной безопасности. В ответ на изменения климата и ухудшение состояния окружающей среды растения инициируют молекулярные, клеточные и физиологические изменения, чтобы адаптироваться к различным типам абиотического стресса. Селекционно-ценными являются солеу-стойчивые растения и растения, толерантные к засухе и тяжёлым металлам. Засоление приводит к созданию в почве низкого (отрицательного) водного потенциала, поэтому поступление воды в растение сильно затруднено. Дефицит воды, засоление почвы, резкие колебания температур — главные факторы подавления роста растений сахарной свёклы и снижения их урожайности. Чтобы противостоять таким стрессам, растения отвечают программируемыми изменениями экспрессии генов на уровнях транскрипции, процес-синга и трансляции мРНК [4, 8, 9].
Одним из наиболее распространённых и ранних симптомов, связанных с этими стрессами, является нарушение гомеостаза растительной водной среды, которое регулируется группой белков, называемых аквапоринами. Это небольшое семейство белков, адекватная работа которых ведёт к повышению устойчивости растений к абиотическому стрессу. Для сахарной свёклы были идентифицированы 28 аква-поринов (BvAQPs), расположенных по всему геному [6, 7].
Одной из важных задач в селекции сахарной свёклы является идентификация генов устойчивости к абиотическому фактору — засолению. Большой успех в решении проблемы адаптации растений к засолению достигнут с развитием методов молекулярной генетики, что позволило идентифицировать многие гены, активирующиеся при засолении. Так, выявлено, что
в ответ на повышение концентрации NaCl увеличивается уровень экспрессии генов, контролирующих белки семейства NHX-антипортеров. Всего выявлено пять предполагаемых генов NHX на четырёх хромосомах у сахарной свёклы. Филогенетический анализ показал, что эти гены сгруппированы в три основных класса, а именно: вакуолярные (Vac: BvNHXl, BvNHX2 и BvNHX3), эндосомальные (Endo: BvNHX4) и плазмалеммарные (PM-класс: BvNHX5) [1, 11].
В процессе эволюции перед высшими растениями возникла необходимость регулировать дальний транспорт Na+, т. е. транспорт Na+ в системе целого растения. В частности, выявлено, что в ответ на повышение концентрации NaCl повышается уровень экспрессии генов, кодирующих белки семейства NHX-антипортеров. Показано, что некоторые из белков переносят ионы Na+ и К+ из цитоплазмы в вакуоль в обмен на ионы Н+. Компартментация избытка Na+ в вакуоли — стратегия, используемая многими растениями для выживания при засолении, и соле-устойчивость растения при этом зависит от эффективности работы вакуолярного NHX-антипортера. Работа другой части белков направлена на ограничение накопления Na+ в побеге путём торможения его транспорта из корней в побег, особенно в листья, рециркуляции Na+ из побега в корни и хранения его в вакуолях клеток корня или стебля [2, 3, 10].
В связи с вышеизложенным цель исследований заключалась в проведении молекулярно-генетического скрининга селекционных материалов сахарной свёклы на наличие генов устойчивости к засолению.
Материалы и методы исследований
Научные исследования выполнены на базе лаборатории маркер-ориентированной селекции с использованием методов молекулярного маркирования на основе ПЦР-анализа. В качестве материалов для экспериментов были использованы проростки
селекционных материалов сахарной свеклы, предоставленные доктором сельскохозяйственных наук В.П. Ошевневым и кандидатом сельскохозяйственных наук Н.П. Грибановой, а также гибриды фирмы «Lion Seeds» (Италия).
Выделение геномной ДНК из растительной ткани осуществляли при помощи 20 % SDS и 3,5М ацетата аммония [5]. Качество выделенной ДНК было определено путем электрофореза в 1,5%-м агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Полученная ДНК растворялась в 10 мМ трис-НС1-буфера, рН 8,0, содержащем 0,1 мМ ЭДТА и использовалась для ПЦР-анализа. ПЦР была проведена на амплификаторе «Genius» (Великобритнаия). В работе использованы следующие праймеры к генам, связанным с устойчивостью к засолению (NHX5.1, NHX5) [11].
Заключение
В результате проведённых экспериментов нами создан праймер NHX5.1 для гена NHX5 из семейства антипортеров NHX для отбора генотипов с генами устойчивости к засолению. С данным праймером почти у всех изученных генотипов получен ожидаемый ПЦР-продукт длиной 700 п. н. При использовании праймера NHX5 во всех изученных образцах выявлен ДНК-фрагмент длиной 480 п. н., что свидетельствует о наличии у них данного гена.
Таким образом, результаты молекулярно-генети-ческих исследований позволили установить наличие гена NHX5 во всех изученных образцах свёклы. Уровень экспрессии генов, ответственных за устойчивость к засолению, будет в дальнейшем изучен методом ПЦР в реальном времени.
Результаты исследований и их обсуждение
Для гена NHX5 из семейства указанных антипортеров на базе данных NCBI (Primer Blast) нами создан специфический праймер NHX5.1, который был использован при отборе генотипов с генами устойчивости к засолению. В результате молекулярно-гене-тических исследований с данным праймером почти у всех изученных генотипов получен ожидаемый ПЦР-продукт длиной 700 п. н., за исключением образцов № 25 и 30 (рис. 1).
Выделенные селекционные материалы могут быть использованы в селекционном процессе в качестве источников устойчивости к засолению.
При использовании праймера NHX5 на этот же ген NHX5 во всех изученных образцах выявлен ДНК-фрагмент длиной 480 п. н. (рис. 2), что свидетельствует о наличии у них данного гена.
Список литературы
1. Adler, G. The sugar beet gene encoding the sodium/ proton exchanger 1 (BvNHX1) is regulated by a MYB transcription factor / G. Adler, E. Blumwald, D. Bar-Zvi // Planta. - 2010. - V. 232. - P. 187-195.
2. Almeida, D. Regulation of Na+ and K+ homeostasis in plants: towards improved salt stress tolerance in crop plants / D. Almeida, M. Oliveira, N. Saibo // Genetics and Molecular Biology. - 2017. - V. 40. - P. 326345.
3. Blumwald, E. Sodium transport and salt tolerance in plants / E. Blumwald // Current Opinion in Cell Biology // Review. - 2000. - V. 12. - Issue 4. - P. 431-434.
4. Gui, G. Transcriptome Analysis of Salt-Sensitive and Tolerant Genotypes Reveals Salt-Tolerance Metabolic Pathways in Sugar Beet / G. Gui [and oth.] // International Journal of Molecular Sciences. - 2019. - V. 20(23): 5910.
5. Hussein, A.S. Efficient and nontoxic DNA isolation method for PCR analysis / A.S. Hussein, A.A. Nalbandyan,
Рис. 1. Электорофоретическоеразделение ПЦР-ампликонов, полученных с праймером NHX5.1 Обозначения образцов: 1 - Р}18084, 2 - 0п18085, 18 -0п18075, 22 - Р118109, 23 - Г¿8110, 24 - Шаннон, 25-Гранате, 26 - Хамбер, 30 - МС 1(ВИР), 31 - МС 2(ВИР), 32 - Пистиллодий, К- (ПЦР-смесь без ДНК), К- - (ПЦР-смесь без ДНК), К+ - (ПЦР-смесь с ДНК), М - маркер молекулярных масс ДНК Оет^и1ег™ (ThermoSaentific, США)
Рис. 2. Электорофоретическое разделение ПЦР-ампликонов, полученных с праймером NHX5
26 САХАР № 3 • 2020
T.P. Fedulova, N.N. Bogacheva // Russian Agricultural Sciences. - 2014. - V. 40. - Issue 3. - P. 177-178.
6. Kong, W. Genome-wide identification and characterization of aquaporin gene family in Beta vulgaris / W. Kong [and oth.] // PeerJ. - 2017. - DOI 10.7717/ peerj.3747.
7. Porcel, R. BvCOLD1: A novel aquaporin from sugar beet (Beta vulgaris L.) involved in boron homeostasis and abiotic stress / R. Porcel [and oth.] // Plant Cell Environ. - 2018. - V. 41(12). - P. 2844-2857.
8. Skorupa, M. Salt stress vs. salt shock - the case of sugar beet and its halophytic ancestor / M. Skorupa [and oth.] // BMC Plant Biology. - 2019. - 19:57.
9. Taranto, F. Biotechnological and Digital Revolution for Climate-Smart Plant Breeding / F. Taranto, A. Nicolia, S. Pavan // Agronomy. - 2018. - V. 8(12): 277.
10. Wang, Y. The physiological and metabolic changes in sugar beet seedlings under different levels of salt stress / Y. Wang [and oth.] // J Plant Res. - 2017. - V. 130(6). -P. 1079-1093.
11. Wu, G. Genome-Wide Identification of Na+/H+ Antiporter (NHX) Genes in Sugar Beet (Beta vulgaris L.)
and Their Regulated Expression under Salt Stress / G. Wu, J. Wang, S. Li // Genes. - 2019. - V. 10: 401.
Аннотация. Выполнен молекулярно-генетический анализ селекционных материалов сахарной свёклы на наличие генов к группе белков-антипортеров NHX, связанных с засолением. В процессе исследований создан специфический праймер NHX5.1 для гена NHX5 из семейства данных антипортеров для отбора генотипов с генами устойчивости к засолению. Выделены и отобраны генотипы, несущие в своём геноме гены устойчивости к этому признаку. Рекомендовано использовать в селекционном процессе выделенные образцы в качестве источников устойчивости к засолению. Ключевые слова: сахарная свёкла, специфические праймеры, белки-антипортеры, засоление, гены устойчивости, ПЦР-анализ.
Summary. Molecular genetic analysis of sugar beet breeding materials for the presence of NHX antiporter-coding genes associated with salinity was performed. A specific primer NHX5.1 was created for NHX5 (one of antiporter-coding genes) to differentiate the salinity resistance genotypes. Cultivars carrying genes of resistance trait in their genome were isolated. Using of selected materials in the breeding processes as a sources of salinity resistance were recommended. Keywords: sugar beet, NHX5, antiporter-coding gene, salinity resistance, PCR analysis.
