CC BY
32НАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 633.63:575:632.52.577.1
тш
ПЦР-идентификация гена устойчивости к мучнистой росе в селекционном материале Beta vulgaris L.
A.A. НАЛБАНДЯН, канд. биолог. наук
ФГБНУ «Всероссийский НИИ сахарной свёклы и сахара им. А.Л. Мазлумова» (е-mail: [email protected])
ВВЕДЕНИЕ
Сахарная свёкла Beta vulgaris L. является ценнейшей сельскохозяйственной сахароносной культурой, которая обеспечивает более 50 % производства сахара в мире. Будучи главнейшим источником доходов для свеклосеющих хозяйств, сахарная свёкла имеет большое народнохозяйственное значение. В последнее время во многих регионах наблюдается снижение её урожайности. Причина этого — ощутимый рост болезней. Современные технологии выращивания сахарной свёклы предусматривают многократное использование химических средств защиты растений от сорняков, болезней и вредителей, что также приводит к угнетению защитных свойств культуры. Изучение генетики устойчивости линий и гибридов сахарной свёклы к болезням очень важно и актуально. Предлагаемая технология поиска и отбора устойчивых форм селекционных материалов направлена также на снижение количества применяемых пестицидов, повышение устойчивости растений к стрессовым факторам и, как следствие, повышение урожайности [1]. Почти во всех свеклосеющих областях сейчас встречается мучнистая роса сахарной свёклы, вызываемая грибком Erysiphe betae. Вред от поражений ею экономически весьма ощутим и может уменьшить выход сахара вплоть до 30 %. Болезнь характеризуется белыми пылеобразными колониями, которые распространяются по поверхности листа вслед за прорастанием переносимых ветром конидий. Для борьбы с ней в настоящее время применяют серу или фунгициды. В целях уменьшения или устранения потребности в химических средствах борьбы перед селекционерами стоит проблема поиска новых потенциальных источников устойчивости селекционного материала.
Впервые ген устойчивости к мучнистой росе был установлен у диких видов Beta v. ssp. maritima WB 97 и WB 242 и был обозначен как Pm. Устойчивость носила моногенный характер и успешно передавалась культурным видам при скрещивании [2]. Устойчивость, обусловленная экспрессией одного гена, была установлена и у других видов растений, в частности у культурных сортов пшеницы. И в данном случае до-
минантный ген был привнесён из диких форм злака [3, 4]. Однако при более детальном изучении процессов расщепления селекционного материала сахарной свёклы был установлен также полигенный (QTL) характер устойчивости к мучнистой росе [5]. Пять основных доминантных генов устойчивости идентифицированы и обозначены как Pm2, Pm3, Pm4, Pm5 и Pm6. Экспрессия одних генов обозначала полную устойчивость к мучнистой росе, проявление других обеспечивало частичную устойчивость. Изучение локализации и экспрессии этих генов позволило отобрать наиболее устойчивые материалы. При помощи SNP-картирования у сахарной свёклы выявлены доминантные гены, локализованные на двух и четырёх хромосомах, и к ним подобраны специфические SNP-маркеры [6].
Метод классического ПЦР позволяет проводить анализы для выявления доминантного R-гена Pm у сахарной свёклы. В связи с этим для первичного тестирования и отбора селекционных материалов сахарной свёклы на наличие генов устойчивости к мучнистой росе мы использовали специфический прай-мер, разработанный нами в системе BLAST на основе информации международной базы данных биологических публикаций PubMed (NCBI).
УСЛОВИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В качестве материала для исследований на наличие генов устойчивости к болезни использованы растения шести гибридов сахарной свёклы отечественной и зарубежной селекции (см. табл.).
Происхождение изучаемых сортообразцов сахарной свёклы
№ Образец Происхождение
1 H7581 (гибрид) Швеция
2 БО32 4Х (Белоцерковская односемянная 32 тетраплоид) Украина
3 P1537 (Рамонский, сахаристый сортотип) Россия
4 Z67-Z тип (сахаристый сортотип) Германия
5 Poli (церкоспороустойчивый сортотип) Болгария
6 4НН25(гибрид) США
46 САХАР № 2 . 2018
За то, что наша жизнь не блёкла, [жД рюшмопо
мы говорим: спасибо, свёкла! ^¡Г ОЕБРНЕг
121248, Москва, Кутузовский проспект, дом 7/4, корпус 1, офис 171 +7 (495) 974-62-51 \пРоЭАоптопd-desprez.ru www.florimond-desprez.com
КОМПЛЕКСНАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ САХйРНЫХ ЗйКОДОК
НАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для проведения экспериментов осуществлялась экстракция суммарной ДНК из растительной ткани, с применением 8М ацетата аммония и 20 % SDS [7, 8]. Качество выделенной ДНК определялось электрофорезом в 1,5 %-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Полученная ДНК, растворённая в 10мМ трис-НС1-буфере, содержащем 0,1мМ ЭДТА, использовалась для ПЦР-анализа. Полиме-разно-цепная реакция проводилась на амплифика-торе «Genius» (Великобритания).
Для проведения ПЦР-анализа были подобраны следующие параметры амплификации:
— предварительная денатурация: 94 оС в течение 5 мин;
— 30 циклов: 94 оС — 30 с, температура отжига (58 оС) - 30 с, 72 оС - 60 с;
— финальный этап элонгации цепи: 72 оС — 5 мин.
Визуализация ПЦР-продуктов происходила под
УФ-лучами в трансиллюминаторе.
Идентификация гена устойчивости Pm к мучнистой росе осуществлялась при помощи следующей пары праймеров:
Pm36 F: 5/-GGCACTTACAAGATACCGAACT-3/
Pm36R: 5/-ACTTAGCAGGCATTACCGCA-3/
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ АНАЛИЗ
Для проведения молекулярно-генетических исследований была экстрагирована суммарная ДНК из листового аппарата растений сахарной свёклы. Визуально качество выделенной ДНК оценивалась на электрофореграмме (рис. 1).
Полученная относительно чистая, не деградированная ДНК была использована в дальнейшей работе.
Тестирование растений сахарной свёклы на наличие гена устойчивости к мучнистой росе проводилось с использованием праймера Рт36 F/R. Проведение полимеразно-цепной реакции с данным молекулярным маркером позволило чётко выявить локусы с характерной для них ДНК-фрагментами молекулярной массой в 1000 п.н. у трёх образцов сахарной свёклы (1 -Н7581, Швеция; 2 - БО32 4Х, Украина; 3 - Р1537, Россия) (рис. 2).
ВЫВОДЫ
В результате проведённых молекулярно-генетиче-ских исследований создан и апробирован специфический праймер (Рт36 F/R) для выявления доминантного гена устойчивости Рт к мучнистой росе. Отобраны три образца растений сахарной свёклы (происхождение — Украина, Россия, Швеция), несущие в своем геноме искомый локус. Применяемый подход при скрининге гибридов сахарной свёклы на устойчивость к мучнистой росе с использованием специфического праймера может успешно использоваться в селекционной практике.
Данные генотипы классифицируются как относительно устойчивые и могут быть рекомендованы к использованию в качестве исходного материала при селекции на устойчивость к мучнистой росе. Для более детального тестирования изучаемых материалов и определения их как абсолютно устойчивых необходимо углубление молекулярно-генетических исследо-
1 2 3 4 5 6
Рис. 1 Электрофореграмма образцов ДНК сахарной свёклы. Дорожки (образцы сахарной свёклы): 1 — Н7581, Швеция; 2 — БО32 4Х, Украина; 3 — Р1537, Россия; 4 — Z67-Z-mun, Германия; 5 — Болгария Poli;
6 — 4HH25, США. К— отрицательный контроль (ПЦР-смесь без ДНК). М — маркер молекулярных масс (Сибэнзим) 100-3 000п.н.
1 2 3 4 5 6 К- М
Рис. 2. Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов с использованием праймера Pm36F/R Дорожки (образцы сахарной свёклы): 1 - Н7581, Швеция; 2 — БО32 4Х, Украина; 3 — Р1537, Россия; 4 — Z67-Z- тип, Германия; 5 — Болгария Poli; 6 — 4HH25, США. К—отрицательный контроль (ПЦР-смесь без ДНК). М — маркер молекулярных масс (Сибэнзим) 100—3 000 п.н.
№ 2 . 2018 САХАР 47
т
FLGRIM0N0 ЗА ТО, ЧТО НАША ЖИЗНЬ НЕ БЛЁКЛА,
DESPREZ МЫ ГОВОРИМ: СПАСИБО, СВЁКЛА!
121248,. Москва, Кутузовский проспект» дом 7/4, корпус 1, офис 171 +7 (495) 974-62-51 tnfoíDflorimond-desprez.nj www.floriinoncl-despre7.com .-¿¡ir
Журнал
• Теперь в Facebook:
fhtipt|||w
Общайтесь,
комментируйте,
задавайте вопросы экспертам!
Теперь на журнал «Сахар» можно подписаться в любой момент в электронном каталоге «Почта России»: по индексу П6305 или по названию «Сахар»:
ваний с использованием большого количества SNP-маркеров и ПЦР в реальном времени.
Список литературы
1. Налбандян, А. Тестирование гибридов сахарной свёклы на наличие генов устойчивости к ризомании / А. Налбандян [и др.] // Сахарная свёкла. — 2016. — № 2. - С. 16-18.
2. Lewellen, R. Inheritance of Powdery Mildew Resistance in Sugar Beet Derived from Beta vulgaris subsp. maritima / R. Lewellen, J. Schrandt // Plant Disease. — 2001. — V. 85. — № 6. — P. 627—631.
3. Blanco, A. Molekular mapping of the novel powdery mildew resistance gene Pm36 introgressed from Triticum turgidum var. dicoccoides in durum wheat / A. Blanco [and oth.] // Theor Appl Genet. — 2008. — V. 117. — P. 135—142.
4. Petersen, S. Mapping of powdery mildew resistance gene Pm53 introgressed from Aegilops speltoides into soft red winter wheat / S. Petersen [and oth.] // Theor Appl Genet. — 2015. — V. 128 (2). — P. 303—312.
5. Janssen, J. Mapping of Resistance Genes to Powdery Mildew (Erysiphe betae) in Sugar beet / J. Janssen, M. Nihlgard, Th. Kraft // 1 joint IIRB-ASSBT Congress. — 2003. — USA. — P. 175—180.
6. Grimmer, M.K. Mapping of five resistance genes to sugar-beet powdery mildew using AFLP and anchored SNP markers / M.K. Grimmer, M.R. Bean, M.J.C. Asher // Theor. Appl. Genet. - 2007. - V. 115. - 67-75.
7. Hussein, A.S. Efficient and nontoxic DNA isolation method for PCR analysis / A.S. Hussein [and oth.] // Russian Agricultural Sciences. - 2014. - V. 40. - Issue 3.
- P. 177-178.
8. Rogers, S. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues / S. Rogers, A. Bendich // Plant Molecular Biologi. - 1985.
- V. 5. - P. 67-69.
Аннотация. В работе представлены результаты разработки и апробирования специфической пары праймеров, эффективной для идентификации гена устойчивости к мучнистой росе Pm в селекционном материале сахарной свёклы.
Ключевые слова: полимеразно-цепная реакция (ПЦР), праймер, мучнистая роса, сахарная свёкла. Summary. In the work, the results of development and approbation of the specific primers pair that is effective to identify the Pm gene of resistance to powdery mildew in sugar beer breeding material are presented.
Keywords: polymerase chain reaction (PCR), primer, powdery mildew, sugar beet.
48 САХАР № 2 • 2018
