CC BY
62УДК 633.63:575.2
шт
www. nt-prom. ru
Перспективы использования SSR -маркеров для генотипирования сахарной свёклы
A.A. НАЛБАНДЯН, канд. биолог. наук A.C. ХУССЕЙН, канд. биолог. наук Т.П. ФЕДУЛОВА, д-р биолог. наук И.В. ЧЕРЕПУХИНА, канд. биолог. наук Т.И. КРЮКОВА, канд. с/х. наук Т.С. РУДЕНКО, мл. научн. сотрудник
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова» (e-mail: biotechnologiya@mail.ru)
Введение
Успех селекционных программ по сахарной свёкле во многом зависит от генетического разнообразия используемых для гибридизации исходных форм. В мировой практике для изучения особенностей генома близкородственных материалов, которыми являются сорта и линии культурных растений, применяют методы молекулярного маркирования на основе микросателлитных локусов. Большинство идентифицированных микросателлитных локусов являются вариабельными по длине, что обусловлено различным количеством тандемных повторяющихся последовательностей. Анализ длины микросателлитов позволяет выявить значительное количество аллельных вариантов, а их распространённость по всему геному — охватить значительную его часть. Молекулярные маркеры являются очень ценным инструментом для создания генетических карт. Особенно актуально использование ДНК-маркеров при идентификации генов устойчивости к заболеваниям, так как оно отменяет необходимость проведения фитопатологической оценки образцов [2]. ДНК-маркеры могут быть применены как для идентификации целевых генов, так и при изучении генетического разно-
образия сахарной свёклы. В этих целях эффективны микросател-литные маркеры, что обусловлено их локус-специфичностью и значительной аллельной изменчивостью. Чаще всего микросателлит-ные маркеры используют для дифференцирования растений внутри вида, идентификации сортов и гибридов, составления генетических карт и в маркерной селекции, а также в работах по изучению генетического разнообразия и идентификации генов хозяйственно-ценных признаков [4, 5, 7, 9—11].
Как и во многих других культурах, селекция сахарной свёклы (Beta vulgaris L.) всё больше поддерживается применением таких генетических маркеров. Полиморфизм одиночных нуклеотидов (SNP) имеет высокий потенциал для автоматизированного анализа и высокопроизводительного генотипирования [6]. Применение ДНК-технологий в селекции и генетике сахарной свёклы позволяет значительно расширить область научных исследований: от изучения генетического разнообразия, вопросов паспортизации линий и гибридов, определения их генетической чистоты до защиты авторских прав селекционеров.
В последние годы проведён ряд исследований, посвящённых вариабельным по длине микроса-
теллитным последовательностям в геноме сахарной свёклы, а также разработаны маркеры, позволяющие исследовать их аллельное состояние, в частности маркеры GZM [1]. Авторы отмечают, что обнаруженные аллели могут служить для создания генетических профилей, характеризующих генетическое многообразие сортов и гибридов сахарной свёклы. Определены генетические дистанции между генотипами в выборке, характеризующие степень сходства исследованных форм.
Высокая комбинационная способность исходных линий часто связана со степенью их генетической дивергенции. Ранее отбор таких линий проводился с помощью анализа фенотипических признаков, в настоящее время — с помощью молекулярно-гене-тических маркеров полиморфизма различных участков ДНК [3]. Генетические данные были использованы для прогнозирования гетерозиса. Кроме того, авторы указанной работы описывают возможный молекулярный подход для ускоренного отбора в селекции растений.
Z. Abbasi c коллегами [4] осуществлена оценка генетического разнообразия 168 генотипов сахарной свёклы (Beta vulgaris L.) (8 опылителей и 4 ЦМС-линий),
За то, что наша жизнь не баёкаа,
мы говорим: спасибо, свёкла!
36 САХАР № 11 • 2019
ш
FLORIMOND
DESPREZ
121248, Москва, Кутузовский проспект, дои 7/4. корпус 1, офис 171 +7 (495) 974-62-51 ¡nfoSflorimonrt-desprei.ru www.florimond-desprei.com
СОВРЕМЕННЫЙ ИНЖИНИРИНГ В ПРОИЗВОДСТВЕ САХАРА
www.nt-prom.ru
различающихся по устойчивости к засолению и засухе, с использованием агроморфологических признаков и 18 микросателлит-ных маркеров. Результаты показали, что SSR-маркеры являются эффективными и надёжными для оценки генетического разнообразия сахарной свёклы.
В настоящее время на основе транскриптома сахарной свёклы, полученного от экспрессии генов листовой и корневой тканей, американскими учёными [6] были созданы 43 пары SSR-маркеров для Unigenes, которые выявляли полиморфизм и эффективно различали генетическое разнообразие среди генотипов культуры. Данные локусы охарактеризованы как связанные с различными метаболическими процессами и вносящими потенциальный вклад в защитные механизмы растений свёклы. Основываясь на представленных результатах, мы использовали 5 полиморфных Unigene-маркеров для тестирования 26 перспективных генотипов сахарной свёклы. Необходимость изучения микро-сателлитных локусов сахарной свёклы обусловлена в первую очередь актуальностью работ по выявлению полиморфных маркеров для участков хромосом, определяющих хозяйственно ценные признаки.
Цель исследований — провести молекулярно-генетический скрининг исходных материалов сахарной свёклы и отобрать перспективные формы для гибридизации.
Материалы и методы
исследований
Научные исследования выполнены на базе лаборатории маркер-ориентированной селекции с применением методов молекулярного маркирования на основе SSR-анализа. В качестве материалов для исследования послужили проростки МС-линий сахарной свёклы, сростноплодных опыли-тей и гибридов на их основе, пре-
доставленные доктором сельскохозяйственных наук В.П. Ошевне-вым и кандидатом сельскохозяйственных наук Н.П. Грибановой.
Для проведения экспериментов осуществлялась экстракция тотальной ДНК из растительной ткани с применением 7М ацетата аммония, протеиназы К и 20 % SDS [8]. Качество выделенной ДНК определялось электрофорезом в 1,2%-м агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Полученная ДНК, растворённая в 10 мМтрис-НС1-буфере, содержащем 0,1 мМ ЭДТА, использовалась для ПЦР-анализа. Полиме-разно-цепная реакция проводилась на амплификаторе «Genius» (Великобритания).
Для проведения амплификации были подобраны следующие параметры:
— предварительная денатурация: 95 оС в течение 5 мин;
— 33 цикла: 94 оС — 30 с; отжиг — 30 с; 72 оС - 60 с;
— финальный этап элонгации цепи: 72 оС - 7 мин.
Визуализация ПЦР-фрагментов происходила под УФ-лучами в трансиллюминаторе Vilber. В работе были применены праймеры к микросателлитным локусам ге-
нома: Unigene 24552, Unigene 2305, Unigene 17623, Unigene 14805, Unigene 62524 [6].
Результаты исследований
и их обсуждение
В результате ПЦР-анализа исходных родительских линий сахарной свёклы (МС-форм, сростноплодных опылителей) и их гибридов выявлено генетическое разнообразие и высокий полиморфизм. Установлено, что диапазон длин полученных ДНК-фрагментов составляет от 100 до 3000 п. н. Каждый из праймеров обеспечил стабильную амплификацию полиморфных фрагментов ДНК. Наибольший уровень полиморфного обеспечения (PIC) установлен для локусов, определённых с использованием праймеров Unigene 17623 (PIC = 0,87), Unigene 2305 (PIC = 0,83), Unigene 14805 (PIC = 0,87), что дало возможность дифференцировать селекционный материал сахарной свёклы. Данные праймеры позволили ампли-фицировать до 11 полиморфных полос на генотип. По SSR-локусу Unigene 17623 установлено от 2 до 11 ПЦР-продуктов длиной 150— 3000 п. н. (рис. 1). Всего выявлено 82 ДНК-ампликона. Величина
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 к- м 14 15 1617181920212223303132k-м
Рис. 1. Электрофоретическоеразделение ПЦР-продуктов, полученных с праймерами к SSR-локусу Unigene 17623
Обозначения: 1 - F118084, 2 - Оп 18085, 3 - МС17070, 4 - F118082,
5 - Оп 18094, 6 - F118093, 7- МС 16058, 8 -18103, 9 - Оп 18105,
10 - F118104, 11 - МС 18002, 12 - F118106, 13 - Оп 18108, К-(ПЦР-смесь без
ДНК), 14 - МС 18039, 15 - F118107, 16 - МС 11017, 17 - F118073,
18 - Оп 18075, 19 - МС 18007, 20 - F118074, 21 - МС 18053, 22 - F118109,
23 - F118110, 30 - МС 1 (ВИР), 31 - МС 2 (ВИР), 32 - П (пистиллодий),
М - маркер молекулярных масс ДНК Оепе^иЫг™ (ThermoScientific, США)
№ 11 • 2019 САХАР
37
m
flor1mon ü ЗА то, что наша жизнь не блёкла, DESPREZ мы говорим: спасибо, свёкла!
121248. Москва, Кутузовский проспект, дом 7/4, корпус 1, офис 171 +7 (495) 974-62-51 ¡nfoSflorimond-cleEprsz.ru wwiu.florimond-desprei.coiTi
шт
www.nt-prom.ru
информационного полиморфизма (Р1С) составляет 0,87.
С помощью SSR-маркера Unigene 24552 в изученных образцах выявлено от 1 до 5 ДНК-ампликонов размером 200—600 п. н. Полиморфизм по данному SSR-локусу составил 0,73.
Всего по пяти микросателлит-ным локусам обнаружено 38 аллелей в 27 селекционных номерах. Число различных аллелей для каждой пары праймеров варьировало от 1 до 11. Основная зона распределения фрагментов ДНК находится в диапазоне 100—1300 п. н. Все праймеры выявили у исследованных генотипов уникальные фрагменты ДНК. При использовании праймеров для SSR-маркера Unigene 2305 отмечено формирование от 2 до 8 ДНК-фрагментов длиной от 100 до 750 п. н. Полиморфизм по данному локу-су составил 0,83. По праймерам для SSR-маркера Unigene 62524 в изученных селекционных образцах выявлено от 1 до 7 ПЦР-продуктов длиной 250—1000 п. н. Полиморфизм составляет 0,7. При использовании праймеров для SSR-локуса Unigene 14805 обнаружено от 1 до 9 ампликонов длиной 200—1300 п. н. (рис. 2). Уровень полиморфизма составил 0,82.
Из приведённых в таблице данных видно, что все включённые в анализ ядерные микросателлит-ные локусы у изученных образцов
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 м
Характеристика использованныхмикросателлитныхлокусов
SSR-локус Мотив Число аллелей Размер фрагментов, п. н. PIC
Unigene 24552 (CTT)14 6 200-600 0,73
Unigene 2305 (TCA)7 9 100-800 0,83
Unigene 17623 (CAA)13 11 150-3000 0,87
Unigene 14805 (TCA)7 9 200-1300 0,82
Unigene 62524 (CAA)7 8 250-1000 0,71
сахарной свёклы обнаруживают генетическую изменчивость. Наибольшее аллельное разнообразие наблюдается в локусах Unigene 2305, 17623,14805.
На основе изученной молеку-лярно-генетической структуры исходных родительских линий сахарной свёклы осуществлена их дифференциация методом кластерного анализа (рис. 3).
Результаты ПЦР-анализа с 5 SSR-праймерами позволили разделить образцы сахарной свёклы на 7 дивергентных кластеров в соответствии с алгоритмом Past. Выявленный уровень генетической дифференциации изученных генотипов наглядно иллюстрирует их расположение на дендрограм-ме, полученной при многомерном шкалировании матрицы корреляционного сходства. Образцы, имеющие сходную генетическую структуру по изученным микроса-
14 15 16 1718 19 20 2122 2330 3132 k- м
Рис. 2. Электрофоретическоеразделение ПЦР-продуктов, полученных с праймерами к SSR-локусу Unigene 14805
теллитным локусам ядерной ДНК, располагаются в непосредственной близости друг от друга. Линии № 14 (МС 18039), 17 (F: 18073), 23 (Fj 18110), 30 (МС 1, ВИР),
11 (МС 18002), 31 (МС 2, ВИР),
12 (Fj 18106), 3 (МС 17070), 22 (Fj 18109) не вошли ни в один из выявленных кластеров, что свидетельствует об их генетическом отличии по изученным локусам от всех генотипов. Данные селекционные номера предпочтительнее всего использовать для гибридизации. Образцы, объединённые в отдельные кластеры, характеризуются наибольшим родством и не рекомендуются для скрещиваний. На некотором удалении от них находятся предоставленные из коллекции ВИР образцы муж-скостерильных форм иностранного происхождения № 30, 31. Более значительно разобщены пространственно как друг от друга, так и от остальных МС-формы и гибриды на их основе, что свидетельствует об их генетическом отличии от других изученных генотипов.
Заключение
В результате проведённых молекулярных исследований установлено, что праймеры Unigene 24552, Unigene 2305, Unigene 17623, Unigene 14805, Unigene 62524 характеризуются высоким уровнем генетического полиморфизма (PIC) от 0,71 до 0,87. Это
за то, что наша жизнь не баёкаа,
мы говорим: спасибо, свёкла!
38 САХАР № 11 • 2019
m
FLO R I M О N D
DESPREZ
« 121248, Москва, Кутузовский проспект, дои 7/4. корпус 1, офис 171 +7 (495) 974-62-51 ¡nfoSflorimond-desprei.ru www.florimond-deFprez.com
СОВРЕМЕННЫЙ ИНЖИНИРИНГ В ПРОИЗВОДСТВЕ САХАРА
www.nt-prom.ru
^ so»»*- «Si^ ^ «Sj «Ni
xJ
U
CO
0.90 1 0.75 0.60 0.45 0.30 0.15 H 0.00
Рис. 3. Генетические взаимоотношения селекционных образцов на основе корреляционных связей
свидетельствует о том, что они могут использоваться для геноти-пирования и паспортизации линий и гибридов сахарной свёклы. Полученные данные о генетической удалённости селекционных образцов могут быть использованы для более обоснованного подбора родительских пар при гибридизации. Изученные микро-сателлитные маркеры рекомендованы для использования при генотипировании селекционных материалов. По результатам молекулярного анализа составлены мультилокусные генетические паспорта исследованных родительских форм и их гибридов, что позволило идентифицировать их для использования в селекционном процессе.
Список литературы
1. Кляченко О.Л. Изучение ал-лельного состояния микросател-литных локусов сахарной свёклы (Beta vulgaris L.) / О.Л. Кляченко, Л.М. Присяжнюк // Живые и биокосные системы. — 2014. — № 8. - 7 с.
2. Корниенко, А.В. Молекулярная селекция сахарной свёклы / А.В. Корниенко, А.К. Буторина // Сахарная свёкла. — 2014. — № 1. — С. 12—15.
3. Свирщевская, А.М. Использование микросателлитных ДНК-маркеров для молекулярной идентификации линий и гибридов сахарной свёклы / А.М. Свирщевская [и др.] // Инновации в свеклосахарном производстве // Сб. науч. трудов, посв. 90-летию ГНУ ВНИИСС Россельхозакадемии. — Воронеж, 2012. — С. 52—59.
4. Abbasi1, Z. Evaluation of Genetic Diversity of Sugar Beet (Beta vulgaris L.). Crossing Parents Using Agro-morphological Traits and Molecular Markers / Z. Abbasi1, A. Arzani, M.M. Majidi // J. Agr. Sci. Tech. (2014). — Vol. 16. — Р. 1397—1411.
5. Taski-Ajdukovic, K.. Estimation of genetic diversity and relationship in sugar beet pollinators based on SSR markers / K. Taski-Ajdukovic, N. Nagl, Z. Curcic, M. Zoric // Electronic Journal of Biotechnology. — 2017. — № 27. — Р. 1—7.
6. Fugate, K.. Generation and Characterization of a Sugarbeet Transcriptome and Transcript-Based SSR Markers / K. Fugate [and oth.] // The Plant Genome. — 2014. — V. 7. — № 2. — P. 1—13.
7. Holtgrawe, D. Reliable in silico Identification of Sequence Poly-
morphisms and Their Application for Extending the Genetic Map of Sugar Beet (Beta vulgaris) / D. Holtgrawe [and oth.] // PLOS ONE. - October, 2014. - Vol. 9. -Issue 10. - P. 1-10.
8. Hussein, A.S. Efficient and nontoxic DNA isolation method for PCR analysis / A.S. Hussein, A.A. Nalban-dyan, T.P. Fedulova, N.N. Bogacheva // Russian Agricultural Sciences. -2014. - V. 40. - Issue 3. - P. 177178.
9. Richards, C.M. Polymorphic microsatellite markers for inferring diversity in wild and domesticated sugar beet (Beta vulgaris) / C.M. Richards, M. Brownson, S.E. Mitchell, S. Kresovich, L. Panella // Mol Ecol Notes. - 2004. -№ 4. -P. 243-245.
10. Srivastava, S. Genetic diversity of sugar beet genotypes evaluated by microsatellite DNA markers / S. Srivastava, A.D. Pathak, R. Kumar, B.B. Joshi // Journal of Environmental Biology. - 2017. - Vol. 38. -P. 777-783.
11. Surinder K. Sandhu. Profiling of sugar beet genotypes for agronomical, sugar quality and forage traits and their genetic diversity analysis using SSR markers / Surinder K Sand-hu // Electronic Journal of Plant Breeding. - Vol. 7. - No 2. -2015. -P. 253-266. DOI: 10.5958/0975-928X.2016.00033.8.
Аннотация. В статье представлены результаты исследований по использованию микросателлитных маркеров для Unigene при генотипировании сортообразцов сахарной свёклы. Для каждого генотипа выявлены уникальные ДНК-ампликоны. Установлен уровень полиморфного обеспечения PIC по пяти изученным SSR-локусам. На основе вычисленных корреляционных связей построена дендрограмма генетического родства образцов свёклы.
Ключевые слова: сахарная свёкла, SSR-локус, Unigene, PIC, ампликон, генотипирование, кластерный анализ.
Summary. Investigations of Unigene microsatellite markers for sugar beet genotyping are presented. Unique DNA-amplicons have been revealed for every genotype. PIC for the five studied SSR-loci has been determined. A dendrogram of genetical relationship among beet samples has been constructed.
Keywords: sugar beet, SSR-locus, Unigene, PIC, amplicon, genotyping, cluster analysis.
№ 11 • 2019 САХАР
39
#
FLORIMOND за то, что наша жизнь не блёкла,
DESPREZ мы говорим: спасибо, свёкла!
121248. Москва. Кутузовский проспект, дои 7/4, корпус 1, офис 171 +7 (495) 974-62-51 ¡nfoSflorimond-deEprsz.ru wwiu.florimond-desprei.coni
