CC BY
63
УДК 633.63:575.174.015.3
АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ СОРТОТИПОВ КОРНЕПЛОДНОЙ СВЕКЛЫ (BETA VULGARIS L.)
НА ОСНОВЕ ДНК - МАРКЕРОВ
© 2014 Т. П. Федулова1, Д. Н. Федорин2
1докт. биол. наук, зав. лабораторией,
2канд. биол. наук, доцент, м.н.с. e-mail: biotechnologiya@mail. ru
ФГБНУ «Всероссийский НИИ сахарной свёклы и сахара им. А.Л. Мазлумова»
ДНК-генотипирование сортотипов свёклы корнеплодной выявило высокую гомологию продуктов амплификации ДНК при использовании праймеров PawS 6 и PawS 16. В большинстве исследованных образцов свёклы присутствует ампликон около 850 и 550 п.н., что является характерным признаком идентификации при использовании праймера PawS 6, однако продукт длиной 550 п.н., отсутствует у сортов столовой свёклы Бордо и Цилиндра. Выявлены слабо выраженные продукты амплификации микросателлитного локусов: Вуу48 у столовой свёклы «Бордо» (210 п.н.) и Вуу53 - у кормовой свёклы «Эккендорфская желтая» (226 п.н.), что могут быть использовано в качестве молекулярногенетических маркеров в их селекции.
Ключевые слова: свёкла сахарная, столовая, кормовая, ДНК-маркеры, микросателлитные локусы
В последние годы в нашей стране и за рубежом все больше получают распространение сорта и гибриды полусахарной свеклы. Использование сортов такого типа позволяет механизированно проводить уборку корнеплодов, применяя машины сахарно-свекловичного уборочного комплекса. Поэтому перед селекционерами стоит задача по созданию новых сортов и гибридов полусахарной свеклы, адаптированных к возделыванию в разных регионах Российской Федерации. Кроме того, полусахарная, кормовая и столовая свекла используется в гибридизации с сахарной свеклой при создании гетерозисных гибридов с оптимальной формой корнеплода [Буренин 2007: 274]. Выявление генетического разнообразия данных сортотипов путем исследования полиморфизма молекулярно-генетических маркеров является важным направлением для сохранения генетической пластичности представителей культивируемых разновидностей свеклы. В решении этих задач важная роль принадлежит молекулярногенетическим маркерам. Наиболее широко для описания генофондов используют полиморфизм структурных генов (в частности, электрофоретические варианты белков) и полиморфизм анонимных последовательностей ДНК [Сулимова 2006]. Применение ДНК-маркеров открывает широкие возможности картирования хромосом, идентификации генов, контролирующих хозяйственно ценные признаки растений, их клонирования и генетического конструирования новых сортов и гибридов [Дрибноходова 2005]. Молекулярное маркирование геномов делает возможным установление видовой специфичности растений, а также определение филогенетических взаимоотношений между отдельными представителями таксонов и внутри различных систематических групп. В настоящее время всё шире применяются новые методы анализа селекционного материала, базирующиеся на явлении молекулярно-генетического полиморфизма. Одним из таких методов является микросателлитный анализ [Gong 2010; Silfverberg-Dilworth 2006; Loridon 2005; Smulders 2010]. ДНК-микросателлиты являются, как правило, высокополиморфными,
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
селективно нейтральными и наследуются по менделевскому типу, что позволяет использовать их в качестве генетических маркеров для работ в популяционной генетике, изучения эволюционных связей, определения достоверности происхождения и др.
В связи с этим целью исследований являлось установление молекулярногенетических особенностей различных сортотипов свёклы корнеплодной,
используемых в их направленной селекции.
В качестве материалов для исследований использовали проростки следующих разновидностей корнеплодной свёклы: сахарной, столовой, кормовой, полусахарной, предоставленные докторами сельскохозяйственных наук М.А. Богомоловым и А.В. Корниенко.
Таблица 1
Характеристика сортообразцов свёклы по принадлежности их к разным сортотипам
№№ п/п Наименование сортообразца Сортотип
1 №119 Кормовая белая
2 РО 117 Сахарная
3 №239 Кормовая белая
4 МС KWS №334 Сахарная
5 Дарина Кормовая красная
6 Рекорд поли Кормовая красная
7 Сахарно-столовый гибрид Сахарно-столовый гибрид
8 №363 Столовая
9 Рак роуз Кормовая красная
10 Рак жеуз Кормовая жёлтая
11 №51 Кормовой гибрид
12 №52 Кормовой гибрид
13 Золеа №1006 Сахарная
14 Золеа №1007 Сахарная
15 Кормовая белая Кормовая белая
16 МС KWS х ОП 15202 Сахарная
17 РМС - 70 Сахарная
18 Витязь Сахарная
19 Бордо Столовая
20 Эккендорфская жёлтая Кормовая жёлтая
21 Цилиндра Столовая
Выделение геномной ДНК осуществлялось из 0,2 г зеленых листьев растений свеклы с помощью фенол-хлороформного метода с использованием СТАВ [Chomczynski 1987]. Полученную ДНК растворяли в 10 мМ Трис-НС1, рН 8,0, содержащих 0,1 мМ ЭДТА, и использовали для ПЦР-анализа. В качестве праймеров использовали умеренно повторяющиеся последовательности нуклеотидов PawS 5, PawS 6, PawS 16 к семейству ретротранспозонов [Rogers 1985], а также праймеры к микросателлитным локусам: Bvv48, Bvv51, Bvv53, Bvv 54 [Rogovsky 1992], синтезированные в ЗАО «Синтол» (г. Москва).
ПЦР-анализ проводили в амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Параметры амплификации с праймерами PAW 5, 6 и 16 были следующие: предварительная денатурация при 94°С в течение 5 минут, затем 3 цикла: 94°С - 120 с, 45°С - 20 с, 72°С - 70 с, далее 40 циклов 95°С - 10 c., 57°С - 10 с., 72°С - 70 с. и финальный этап элонгации цепи 72°С - 5 мин.
Параметры амплификации c праймерами к микросателлитам Bvv были следующие: предварительная денатурация при 94°С - 120 с, далее 40 циклов 94°С -
Auditorium: электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014. № 4
Федулова Т. П., Федорин Д. Н. Анализ генетического разнообразия сортотипов корнеплодной свеклы (Beta vulgaris L.) на основе ДНК-маркеров
30 c., 50оС (Bvv48), 510С (для Bvv51 и Bvv53) и 520С (для Bvv54) - 30 с., 72 оС - 60 с. и финальный этап элонгации цепи 720С - 5 мин.
Проведенный ПЦР-анализ геномной ДНК родительских форм сахарной, столовой, кормовой свёклы и гибридов с их участием с праймерами к умеренно повторяющимся последовательностям ДНК не выявил существенных отличий в составе и структуре исследованных образцов. В результате амплификации геномных ДНК растений с праймерами для локуса PawS 5, было установлено, что во всех исследованных образцах наблюдалось сходство продукта амплификации длиной 700 п.н. Только три образца (кормовая белая №119, сахарно-столовый гибрид, столовая №363) имели характерные продукты амплификации длиной около 400 п.н. (рис. 1). В большинстве исследованных образцов присутствует ампликон около 850 п.н., что может являться характерным признаком идентификации при использовании праймеров к локусу PawS 5.
1 2345678М
Рис. 1. Амплификация геномной ДНК свеклы PAWS 5: 1 - кормовая белая №119; 2 - РО 117; 3 -кормовая белая №239; 4 - МС KWS №334; 5 - кормовая красная Дарина; 6 - кормовая красная Рекорд поли; 7 - сахарно-столовый гибрид; 8 - столовая №363; 9 - Рак роуз (кормовая красная); 10 - Рак жеуз (кормовая желтая); 11 - кормовой гибрид №51; 12 - кормовой гибрид №52; 13 - Золеа №1006; 14 - Золеа №1007; 15 - кормовая белая одн.; 16 - МС KWS х ОП15202; 17 - РМС -70; 18 - Витязь
Результаты амплификации геномных ДНК растений с праймерами PawS 6 указывают на то, что в составе генома всех исследованных организмов обнаруживаются общие продукты амплификации с длинами около 850 п.н.; исключение составляет только образец кормовой свёклы Эккендорфская желтая (рис. 2). Общим для всех генотипов также является продукт длиной 550 п.н., однако его не наблюдается у сортов столовой свёклы Бордо и Цилиндра, что свидетельствует о потери данного локуса у данных сортообразцов.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
1 2 3 4 5678М
Рис. 2. Амплификация геномной ДНК свеклы праймерами PAWS 6: 1 - Кормовая белая №119; 2 - РО 117; 3 - кормовая белая №239; 4 - МС KWS №334; 5 - кормовая красная Дарина; 6 - кормовая красная Рекорд поли; 7 - сахарно-столовый гибрид; 8 - столовая №363; 9 - Рак роуз (кормовая красная); 10 - Рак жеуз (кормовая желтая); 11 - кормовой гибрид №51; 12 - кормовой гибрид №52; 13 - Золеа №1006; 14 - Золеа №1007; 15 - кормовая белая одн.; 16 - МС KWS х ОП15202; 17 - РМС-70; 18 - Витязь
В результате ПЦР-анализа геномной ДНК с праймерами PawS 16 установлено, что во всех исследованных образцах свеклы не обнаруживается отличий в продуктах амплификации с данными праймерами. Во всех вариантах ампликоны соответствуют длине около 450 п.н. На основании результатов можно заключить, что использование праймера PawS 16 не позволяет проводить анализ видового разнообразия генетического материала свеклы. Анализ полученных электрофореграмм свидетельствует, что в геноме изученных образцов свеклы наблюдается высокая гомология продуктов амплификации при использовании праймеров PawS6 и PawS 16. Наибольшее разнообразие ампликонов наблюдается с праймером РawS 5, что дает возможность использовать его для анализа генетического материала исследуемых образцов для выявления разнообразия их генетического материала по характерному профилю ПЦР-продуктов.
В результате амплификации геномных ДНК растений с праймерами для микросателлитного локуса Bvv48 (нуклеотидная последовательность (GT)24), было установлено, что только образец «Бордо» не имеет продукта амплификации. Во всех
Auditorium: электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014. № 4
Федулова Т. П., Федорин Д. Н. Анализ генетического разнообразия сортотипов корнеплодной свеклы (Beta vulgaris L.) на основе ДНК-маркеров
остальных исследованных образцах наблюдалось сходство продуктов амплификации, соответствующее теоретическим значениям (около 210 п.н.).
Таблица 2
Спектр ампликонов при использовании праймеров к микросателлитам Bvv
Образцы Микросателлиты
Bvv48 Bvv51 Bvv53 Bvv54
Ампликоны, п.н
210 270 550 226 300
Кормовая белая №119 + + + + +
РО 117 + + + + +
Кормовая белая №239 + + + + +
МС KWS №334 + + + + +
Кормовая красная Дарина + + + + +
Кормовая красная Рекорд поли + + + + +
Сахарно-столовый гибрид + + + + +
Столовая №363 + + + + +
Рак роуз (кормовая красная) + + + + +
Рак жеуз (кормовая желтая) + + + + +
Кормовой гибрид №51 + + + + +
Кормовой гибрид №52 + + + + +
Золеа №1006 + + + + +
Золеа №1007 + + + + +
Кормовая белая одн. + + + + +
МС KWS х ОП15202 + + + + +
РМС-70 + + + + +
Витязь + + + + +
Бордо - + + + +
Эккендорфская желтая + + + - +
Цилиндра + + + + +
В результате амплификации геномных ДНК растений с праймерами Bvv51 (нуклеотидная последовательность (TG)9(AG)32-i) выявлено, что в составе генома всех исследованных организмов обнаруживаются общие продукты амплификации с длинами около 270 и 550 п.н. Единообразие ПЦР-продуктов при амплификации с генспецифическими праймерами к микросателите Bvv51 указывает на сходство их генетического материала. Кроме того, проведенный ПЦР-анализ свидетельствует о двойственной локализации микросателлиты Bvv51 в геноме растений. При этом одна из аллелей представляет собой дуплекс (теоретическая длина составляет 272 п.н.). При амплификации геномной ДНК с праймерами Bvv53 (нуклеотидная последовательность (GT)17(GA)35) показано, что во всех исследованных образцах свеклы не обнаруживается отличий в продуктах амплификации с данными праймерами. Во всех вариантах ампликоны соответствуют теоретическим значениям - около 226 п.н. В образце «Эккендорфская желтая» не наблюдается продуктов амплификации исследуемой микросателлиты, что можно будет считать характерным признаком для идентификации данного сортотипа.
Амплификация геномной ДНК растений свеклы с праймерами к микросателлите Bvv54 (нуклеотидная последовательность (TC)12(AC)12) также не показала отличия в характере ампликонов, длина которых составила 300 п.н. Анализ полученных электрофореграмм свидетельствует, что в геноме изученных образцов свеклы наблюдается единообразие состава исследуемых микросателлитных ДНК, за исключением слабо выраженной амплификации Bvv48 у образца «Бордо» и Bvv53 у образца «Эккендорфская желтая», что может свидетельствовать об отличии структуры их генетического материала от остальных сортов свеклы.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Полученные результаты исследования показали, что в геноме образцов сахарной, кормовой, столовой и полусахарной свёклы выявлена высокая гомология в организации генетического материала. Наиболее сходными по содержанию и структуре в составе геномной ДНК являются умеренно повторяющиеся последовательности PawS 6 и PawS 16, относящиеся к семейству ретротранспозонов. Вероятно, данные генетические элементы, имеющие одинаковый уровень амплификации у всех исследованных образцов, не принимают участия в формировании генетического разнообразия при образовании гибридов. Наибольшее разнообразие в составе геномной ДНК исследуемых образцов свеклы наблюдалось для PawS 5, что, вероятно, связано с его высокой активностью как ретроэлемента. Общим для всех сортообразцов при использовании праймеров к PawS 6 является продукт длиной 550 п.н., отсутствующий, однако, у сортов столовой свёклы Бордо и Цилиндра. Данный факт может быть использован при генотипировании и сортовой идентификации этих образцов с применением соответствующих праймеров [Loridon 2005; Smulders 2010].
Результаты исследования геномной ДНК разных сортообразцов свеклы на микросателлиты показали слабо выраженный полиморфизм продуктов амплификации. Микросателлитный анализ локуса Вvv48 может быть использован как метод идентификации столовой свёклы Бордо, для которой характерно отсутствие продукта амплификации [Goulao 2001]. Кроме того, микросателлита Вvv53 может быть использована в селекции в качестве молекулярно-генетического маркера у кормовой свёклы «Эккендорфская желтая», поскольку в ее геноме отсутствует данный локус.
Библиографический список
Буренин В.И. Генетические ресурсы рода Beta L. (свёкла). СПб., 2007. 274 c.
Дрибноходова О.П., Кокаева З.Г., Гостимский С.А. Идентификация сортов, линий и мутантов гороха посевного с помощью RAPD-маркеров //
Сельскохозяйственная биология. 2005. №5. С. 61-66.
Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Зинченко В.В. Анализ полиморфизма ДНК с использованием метода полимеразной цепной реакции. М.: Макс-пресс, 2006. 76 с.
Chomczynski P., Sacchi N. Single-Step Metod of DNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extration // Anal. Biochem. 1987. V. 162. P. 156-159.
Gong Y., Xu S., Mao W., Hu Q., Zhang G., Ding J., Li Y. Developing new SSR markers from ESTs of pea (Pisum sativum L.) // J Zhejiang Univ Sci B. 2010. V. 11, №. 9. P. 702-707.
Goulao L., Oliveira C.M. Molecular characterization of cultivars of apple (Malus domestica Borkh.) using microsatellite (SSR and ISSR) markers // Euphytica. 2001. V. 122. P. 81-89.
Loridon K., McPhee K., Morin J., Dubreuil P., Pilet-NayelM.L., Aubert G., Rameau C., Baranger A., Coyne C., Lejeune-Henaut I., Burstin J. Microsatellite marker polymorphism and mapping in pea (Pisum sativum L.) // Theor Appl Genet. 2005. V. 111, №. 6. P. 1022-1031.
Rogers S.O., Bendich A.J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Molecular Biologi. 1985. V. 5. P. 69-76.
Rogovsky P. M., Sherpherd K. W., Langridge P. Polymerase chain reaction based mapping of rye involving repeated DNA seguences // Genome. 1992. V. 35, №4. P. 621-626.
Silfverberg-Dilworth E. Microsatellite markers spanning the apple (Malus domestica Borkh.) genome // Tree Genetics & Genomes. 2006. V. 2. P. 202-224.
Smulders M., Esselink G., Everaert I., Riek J., Vosman B. Characterisation of sugar beet (Beta vulgaris L. ssp. vulgaris) varieties using microsatellite markers // BMC Genetics. 2010. 11-41.
Auditorium: электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014. № 4
