CC BY
66
DOI: 10.12737/article_5a3cef5a94cab2.12952001 УДК 630. 165 (577.1)
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ГЕНОТИПОВ БЕРЁЗЫ НА ОСНОВЕ
ПОЛИМОРФИЗМА SSR-МАРКЕРОВ
доктор биологических наук Т.П. Федулова1 доктор биологических наук Ю.Н. Исаков1 кандидат биологических наук, доцент О.М. Корчагин1'2 кандидат сельскохозяйственных наук, доцент И.Ю. Исаков2 кандидат биологических наук А.М. Кондратьева1 младший научный сотрудник С.Г. Ржевский1
1 - ФГБУ «Всероссийский научно-исследовательский институт лесной генетики, селекции и биотехнологии» 2 - ФГБОУ ВО «Воронежский государственный лесотехнический университет имени Г.Ф. Морозова»
В статье обсуждается использование микросателлитных (SSR) маркеров для оценки генетических ресурсов берёзы. Показано, что ДНК-анализ с помощью 12 микросателлитов наиболее подходит для внутривидовой дифференциации селекционно-ценных генотипов данной породы деревьев. Выявлен генетический полиморфизм у изученных генотипов берёзы по исследованным SSR локусам. Составлены мультилокусные генетические паспорта для 31 исследованного образца березы, позволившие на основе наличия (1) / отсутствия (0) 36 аллелей идентифицировать исследованные образцы.
Ключевые слова: береза, Betula, генотипирование, микросателлиты, SSR, полиморфизм, ПЦР, паспортизация.
MOLECULAR-GENETIC DIFFERENTIATION OF GENOTYPES OF BIRCH ON THE BASIS OF SSR-
MARKERS POLYMORPHISM
DSc (Biology) T.P. Fedulova1, DSc (Biology) Y.N. Isakov1 PhD (Biology), Associate Professor O.M. Korchagin1' 2 PhD (Agriculture), Associate Professor I. Y. Isakov 2 PhD (Biology) A.M. Kondratyeva1 Junior Reseacher S.G. Rzhevskiy1
1 - FSBI «All-Russian Research Institute of Forest Genetics, Breeding and Biotechnology» 2 - FSBEI HE «Voronezh State University of Forestry and Technologies named after G.F. Morozov»
Abstract
The article discusses the use of microsatellite (SSR) markers for the estimation of genetic resources of birch. It is shown that DNA analysis using 12 microsatellites is most suitable for intraspecific differentiation of selectively valuable genotypes of this tree species. The genetic polymorphism in the studied birch genotypes was determined from the loci examined by SSR. Multilocus genetic passports were prepared for 31 samples of birch, which allowed (based on the presence (1) / absence (0) of 36 alleles) to identify the investigated samples.
Keywords: birch, Betula, genotyping, microsatellites, SSR, polymorphism, PCR, passportization.
Введение. В настоящее время методы молекулярной генетики всё шире применяются в лесном хозяйстве для оценки и мониторинга состояния лесных генетических ресурсов, управления процессами лесовосстановления, фитосанитарного мониторинга лесных насаждений и питомников, получения селекционного посадочного материала. Одной из основных задач лесного хозяйства является ле-совосстановление и лесоразведение. Быстрое и качественное лесовосстановление возможно только при выполнении ряда условий, таких как использование на плантациях улучшенного посадочного материала и его надежная идентификация, в том числе и с применением молекулярно-генетических методов.
При изучении генетического популяционно-го разнообразия всё чаще применяется микросател-литный метод (SSR) [1, 2], основанный на подборе эффективных маркеров, дающих большое число хорошо воспроизводимых ДНК-ампликонов. В настоящее время для исследования внутри- и межвидовой изменчивости данный метод считается наиболее информативным.
Целью исследования являлось выявление генетического полиморфизма и составление генетических паспортов селекционно-ценных образцов березы.
Обзор литературы. Микросателлитные маркеры широко применяются с целью изучения автополиплоидии и генетической структуры популяций различных видов берез [3-8]. Для вида Betula pendula разработана структура 23 пар праймеров, комплементарных микросателлитным локусам (L1.10, L2.2, L2.3, L2.7, L3.1, L3.3, L3.4, L4.4, L5.1, L5.4, L5.5, L7.1a, L7.3, L7.4, L7.8, L10.1, L11.1, L13.1, L021, L012, L022, L63, L52), с количеством аллелей на выходе ПЦР от 2 до 20 [9]. Из них 2 пары праймеров (для L5.4, L7.1a) были протестированы при амплификации у некоторых других видов березы (B. pubescens ssp. pubescens, B. pubescens ssp. czerepanovii, B. nana, B. fruticosa, B. maximowicziana, B. alleghaniensis) и ольхи серой (Alnus incana). При использовании разработанной пары праймеров для L5.4 амплификация прошла успешно у всех перечисленных видов березы и ольхи, а для L7.1a ПЦР-
продуктов не отметилось только у ольхи серой. Разработанные пары праймеров для локусов L1.10 и L3.1 опробованы на B. pubescens ssp. pubescens, B. pubescens ssp. czerepanovii и B. nana.
Для подвида березы пушистой B. pubescens ssp. tortuosa из трех популяционных линий разработаны и протестированы 9 пар праймеров, комплементарных микросателлитным высокополиморфным локусам (L2.3, L2.5, L3.1, L1.10, L5.4, L021, Bo.F394, Bo.F330, Bo.G182), дающим 14-42 аллеля [10].
Для вида B. alnoides исследовано 19 микро-сателлитных маркеров серии BAG [11] с 3-12 аллелями. 17 из разработанных для них пар праймеров были успешно амплифицированы у B. luminifera, 13 - у B. fujianensis.
Проведен обзор данных обо всех имеющихся в GenBank последовательностях микросателлитных маркеров березы [12]. Исследована возможность использования 52 микросателлитных пар праймеров березы для гибридизации в других родах семейства Betulaceae, при этом эффективность амплификации составила 92,3 % для рода Betula, 50,6 % - Alnus, 41,2 % - Corylus, 36,5 % - Carpinus, 34,0 % - Ostrya и 34,6 % - Ostryopsis [12, 13]. Микросателлиты применяются также при изучении происхождения и эволюционной истории берез [14-16].
Развитие молекулярно-генетических методов открыло новые методические возможности для изучения особенностей динамики популяционно-генетической структуры различных видов растений, в том числе и таких, как береза повислая и пушистая. Получаемая таким образом информация необходима при разработке стратегии сохранения генофонда и рационального использования ресурсов. На основании изложенного выше применение SSR-маркеров при исследовании генетического разнообразия популяций березы и для выявления возможных генетически детерминированных причин сокращения ее численности и деградации генофонда является актуальным направлением исследований [5].
Материалы и методы исследований
Для генетической оценки доктором биол. наук Ю.Н. Исаковым и канд. с.-х. наук И.Ю. Исаковым
отобран 31 образец селекционного ценного материала берёз в возрасте 33 лет, произрастающих в Воронежском государственном биосферном заповеднике, квартал 298 (табл. 1). Материал представлен вторым поколением, полученным при свободном опылении деревьев первого поколения (гибридов местных берёз - пушистой Betula pubescens Ehrh. и повислой Betula pendula Roth., а также потомства от свободного опыления). Наличие в тканях веге-тирующих растений ингибиторов ПЦР усложняет очистку нуклеиновых кислот. По этой причине экстракция ДНК осуществлялась из только что распустившихся листьев модифицированным нами ЦТАБ-методом. Использованный метод делает возможным получение нуклеиновых кислот доста-
точно высокой степени чистоты, что позволяет на выходе ПЦР дать ампликоны, хорошо визуализируемые на электрофорезе [17]. К тому же использованный метод ниже по себестоимости по сравнению с готовыми коммерческими наборами. Для разрушения мембран растительных клеток ткани растирались пестиком в ступке с подогретым 2 % ЦТАБ-буфером (2 % CTAB, 1,5 М NaCl, 100 mM Tris-base, 50 mM EDTA; рН 8.0). Клеточный гомо-генат инкубировался 30 минут при 65 °С в термостате, пробирки периодически встряхивали. Затем, охладив пробирки, добавляли равный объем смеси хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1) и перемешивали содержимое.
Таблица1
Характеристика образцов березы, отобранных для молекулярно-генетического анализа
№ образца Инв. № № бирки Вид / гибрид
1 2 (прививка) У041730 B. pendula х B. pubescens
2 6 У041726 B. pendula х B. pubescens
3 13/7 У041729 B. pendula х B. pubescens
4 13 К281816 B. pendula
5 33I28 (Б-12 с/о) К281818 B. pubescens
б 34I5 (Б-12 св!о) К281819 B. pubescens
7 38I22 (Б-18 с/о) К181820 B. pubescens
8 37I24 (Б-11 с/о) К281814 B. pubescens
9 C 5 К281828 B. pendula х Betula pendula var. carelica
10 р!л-4 У041716 Betula
11 шт-1 У041702 Betula pendula var. carelica
12 шт-2 К191424 Betula pendula var. carelica
13 шт-3 К191422 Betula pendula var. carelica
14 шт-4 У041703 Betula pendula var. carelica
15 б!п-2 У041704 Betula pendula var. carelica
16 б!п-1 У041707 Betula pendula var. carelica
17 карлик У041713 Betula pendula var. carelica
18 3I13 (п1к) У041720 Betula pendula var. carelica
19 3I22 (б!п) У041712 Betula pendula var. carelica
20 б!п У041721 Betula pendula var. carelica
21 п1к-2 р У041714 Betula pendula var. carelica
22 кустов. No.310 К191417 Betula pendula var. carelica
23 п1к-3 К191430 Betula pendula var. carelica
24 кап-5 К191419 B. pubescens (свободное опыление)
25 8/31 (С-30 с/о) К191428 B. pendula
26 8I21 (С-30 с/о) К191427 B. pendula
27 8I1 (С-30 св/о) К191420 B. pendula
28 8I2 (С-30 св/о) К191425 B. pendula
29 3I33 (С-31 с/о) К191426 B. pendula
30 3I4 (С-31 св/о) К191429 B. pendula
31 34I10 (Б-12 св/о) К191418 B. pubescens
После центрифугирования в течение 15 минут (14 000 об/мин, комнатная температура) к отобранному супернатанту добавляли половину объема хлороформа, проводили центрифугирование ещё раз. Полученный супернатант отбирали в новые пробирки и для осаждения ДНК добавляли двойной объем 96 % этилового спирта. Пробирки инкубировали 30 минут в морозильной камере (-20 °С), после чего их центрифугировали 30 минут (14 000 об/мин при 4 °С). Отбирали жидкость, промывали осадок 70 % этанолом, подсушивали и растворяли в ТЕ-буфере (10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 8.0). Для визуализации полученного препарата ДНК и определения степени его деградации проводили электрофорез в 0,7 % агарозном геле с добавлением этидия бромида. Полученный тотальный препарат ДНК хранили при -20 °С и использовали для проведения ПЦР. В процессе исследований нами подобрано и протестировано по 12 специфических микросателлитных локусов для видов рода Betula [9, 10] (табл. 2). Для праймеров каждого локуса
Характеристика м1
оптимизировали температуры отжига. Подобранные температуры отжига для микросателлитных праймеров для березы приведены в табл. 3, 4. Оптимизирован режим амплификации для берёзы: 3 минуты - предварительная денатурация при 94 °С; затем 35 циклов: 30 секунд - денатурация при 94 °С, 40 секунд - отжиг, 15-25 секунд - элонгация при 72 °С; 5 минут - окончательная элонгация при 72 °С. Также нами оптимизирован состав реакционной ПЦР-смеси (объем 20 мкл) следующего состава: 10 х ПЦР-буфер (2 мкл), смесь четырех dNTP, 2 mM (2 мкл), смесь двух праймеров, 2 цМ (4 мкл), ДНК-матрица 1 мкл, Taq-полимераза 5 ед./мкл (0,3 мкл), вода 11 мкл.
Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 3 % агарозном геле в горизонтальной камере Power Pac TM Universal («BIO-RAD», США) в течение 3 часов при напряжении электрического поля 60 В. Применялся однократный ТВЕ-буфер (89mM Tris, 89mM H3BO3, 2mM EDTA; рН 8.0). Окрашивание осуществлялось бромидом этидия.
Таблица 2
;ллитных локусов березы
№ п/п Локус Инв. номер Последовательность праймера (5' - 3') Повтор T отжига, °С Число выявленных аллелей Размер ПЦР-продукта
1 L1.10 AF310856 ACGCTTTCTTGATGTCAGCCTCACCAAGTTC CTGGTGGAT (AG)4AA (AG)10 55 4 160-200
2 L2.3 AF310847 CAGTGTTTGGACGGTGAGAACGGGTGAAGT AGACGGAACT (AG)16 55 3 190-220
3 L3.1 AF310851 CTCCTTAGCTGGCACGGACCCCTTCTTCATA AAACCCTCAA (CT)3CC (CT)2CC (CT)13AT (CT)5 59 4 210-250
4 L3.4 AF310852 AACCCTCGTTTGGCTACTGAGAACAGTTACT AGTCAAACTGAAAACC (GTAT)3 (GT)5 55 2 250-270
5 L4.4 AF310858 TTGAGATAGACGATAGAGGTAAAGCAAGGC ATTTCTCCAATTTTCTT (AG)17 55 3 250-280
6 L5.4 AF310862 AAGGGCACCTGCAGATTAGAAAAATTGCAA CAAAACGTGC (TC)26 55 4 240-270
7 L7.1a AF310854 GTTTTGGGTTTCCACTTCCAACTGGTAATACC TTTACCAAGCC (CT)12CCT T(CT)4 55 1 150
8 L7.3 AF310864 GGGGATCCAGTAAGCGGTATCACACGAGAG ATAGAGTAACGGAA (GT)18(GA) 14 55 4 190-230
9 L7.4 AF310855 TGAAACGAACGGAAGAGTTGATACGCCAGA CTTTCATCCG (GA)7 59 2 240-250
10 L13.1 AF310871 CACCACCACAACCACCATTAAACACCCTTTG CAACAATGA (CA)3(GA)1 4 55 4 80-120
11 L021 AF310877 GCCAAAGCCAACGCTAGTAATCCTAGCCGA GAGAAGTTGC (CT)13 59 1 190
12 Bo.F39 4 AY423608 AATGCAGCATCTCTTACCCACGCAATAATAT GGAAA (TC)13 48 4 130-160
Визуализация полученных ампликонов проводилась на трансиллюминаторе TFP («Vilber Lourmat», Франция). Размер полученных фрагментов определялся по сравнению с ДНК-маркерами 100 bp Ladder DNA marker (100 bp - 3000 bp) («Axygen», США) и М34 (100 bp + 50 bp) («СибЭн-зим», Россия). Результаты анализа были воспроизведены на всех этапах в трёхкратной повторности.
С выделенными и очищенными ДНК исследованных генотипов березы проводился ПЦР-анализ в соответствии с программами, оптимизированными для каждой пары использованных прай-меров. Результат амплификации по каждому из микросателлитных локусов приводится в виде электрофореграмм. По результатам проведенного ПЦР-анализа генотипов березы пушистой и повислой и их гибридов по 12-и SSR-маркерам 100 %-м полиморфизмом и наибольшим числом выявленных аллелей характеризуются локусы L1.10, L3.1, L7.3, L13.1, L5.4, Bo.F394.
Результаты исследований и обсуждение В локусе L1.10 обнаружено 4 ДНК-ампли-кона, размах варьирования длин составляет от 160 п. н. до 200 п. н. (рис. 1). Аллель 160 п. н. отмечен только у четырех образцов (N0.10, 13, 14, 27). Обозначения номеров согласно табл. 2. В локусе L3.1 насчитывается 4 ПЦР-продукта с варьированием длин от 210 п. н. до 250 п. н. (рис. 2). Аллель 250 п. н. присутствует только у образца N0.14, а аллель 230 п. н. отсутствует только у образцов N0.4 и N0.8. Данный микросателлитный маркер показал возможность установления полиплоидности (наличие трех аллелей 210, 230, 240 п. н. у образцов N0.3 и №.7). Микросателлитный маркер Bo.F394 по результатам анализа характеризуется четырьмя ДНК-фрагментами (130-160 п. н.) (рис. 3). В локусе L7.3 (рис. 4) размер четырех наблюдаемых фрагментов изменяется в пределах от 190 п. н. до 230 п. н. Фрагмент размером 190 п. н. присутствует у образцов N0.26, 29, фрагмент 220 п. н. - №.7-9. Аллель 200 п. н. отмечен у всех исследованных образцов, кроме N0.4, 8, 9.
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР образцов березы (1-31) по локусу L1.10
(М - маркер молекулярных масс)
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР образцов березы (1-31) по локусу L3.1 (М - маркер молекулярных масс)
Рис. 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР образцов березы (1-31) по локусу Bo.F394
(М - маркер молекулярных масс)
Рис. 4. Электрофореграмма продуктов ПЦР образцов березы (1-31) по локусу L7.3 (М - маркер молекулярных масс)
Локус L13.1 характеризуется четырьмя аллелями (80-120 п. н.) (рис. 5). Фрагмент 80 п. н. присутствует только у образцов N0.4, 6, 8, 24, 31; 120 п. н. - только у N0.1, 3, 12, 13, 15. Локус L5.4 характеризуется четырьмя аллелями (240-270 п. н.) (рис. 6). Фрагмент 240 п. н. отмечен почти у всех исследованных образцов, кроме N0.1, 4, 14, 27. Аллель 260 п. н. присутствует только у образцов N0.5, 6, 8, 9, 11; 270 п. н. - только у N0.13, 28, 30. Перечисленные ядерные микросателлиты в наибольшей степени подходят для идентификации и паспортизации образцов березы.
Локус Ь2.3 характеризуется тремя аллелями (190-220 п. н.). Аллель 210 п. н. присутствует только у образцов N0.1, 18-20, 23.
С использованием праймеров к локусу Ь4.4 ампликон 260 п. н. отмечен почти у всех исследованных образцов, кроме N0.10, 19, 22, 24, 28. Аллель 250 п. н. присутствует только у образцов N0.19, 20, 22-24, 28; 280 п. н. - только у N0.7, 10, 31. Наименьшее количество аллелей (по 2 ДНК-фрагмента) установлено по Ь3.4, Ь7.4. В локусе Ь3.4 отмечено только два ампликона, 250 п. н. до 270 п. н. Уровень полиморфизма - 100 %. Микросателлит Ь7.4 характеризуется двумя аллелями 240 и 250 п. н. При этом аллель 240 п. н. отмечен у образцов N0.4, 13, 17, а аллель 250 п. н. присутствует у всех образцов (уровень полиморфизма - 50 %). Не полиморфными и, следовательно, не информативными для исследуемых гибридов и форм берез оказались локусы Ь7.1а и Ь021, представленные одним ПЦР-продуктом (150 и 190 п. н. соответственно). Следовательно, данные праймеры не могут быть использованы для генетической дифференциации генотипов берёзы. Среди исследованных
генотипов берез всего детектировано 439 фрагментов, из которых 346 оказались полиморфными, что составляет 78,8 % ампликонов. Длина полученных продуктов варьируется от 80 до 280 п. н. Среднее число ДНК-фрагментов на локус - 36,6, максимальное - 47 (Б0.Р394), минимальное - 31 (Ь7.1а, Ь021). Среднее число полиморфных ампли-конов на локус - 28,8, максимальное - 47 (Б0.Б394), минимальное - 3 (Ь7.4). По результатам проделанной работы выделен 31 уникальный генотип березы (из 31 исследованного образца). Для части проанализированных образцов установлены микросателлиты с уникальным аллельным составом: локус Ь3.1 - для образцов N0.4, 8 и 14; В0.Б394 - N0.13, 16, 17, 20; Ь7.3 - N0.4, 7, 8 и 9; Ь2.3 - N0.19 и 23; Ь3.1 - N0.15. Для генотипа N0.10 выявлено сразу два маркера со специфичным набором аллелей (Ы.10 и L4.4). Генотипы N0.3 и N0.7 существенно отличаются от других исследованных образцов наличием в локусе L3.1 трех аллелей, а между собой - по остальным локусам. Образцы N0.11, 29, 30 выделяются по набору фрагментов L13.1, а между собой - по Ь5.4; N0.22, 25, 26, 31 от других - по L5.4, между собой - по L1.10 и Ь13.1. Ряд исследованных генотипов возможно идентифицировать только по комбинации аллелей в двух микросателлитах: образцы N0.2 и 24 - по локусам Ы.10 и Ь2.3; N0.21 - L1.10 и L4.4; N0.27 - L1.10 и В0^394; N0.5 - L5.4 и Ь7.3; N0.6 - Ь3.1 и Ь5.4; N0.1 - Ь13.1 и Ь3.1; N0.12 - Ь13.1 и Б0.Р394;№.18 - L2.3 и L7.3. Образец N0.28 отличается от остальных только по комбинации сразу трех локусов ^4.4, L3.1, L5.4). Пример аллельного состава и шифры микросател-литных локусов исследованных генотипов берёзы представлены в табл. 3.
Рис. 5. Электрофореграмма продуктов ПЦР образцов березы (1-31) по локусу Ь13.1
(М - маркер молекулярных масс)
Рис. 6. Электрофореграмма продуктов ПЦР образцов березы (1-31) по локусу Ь5.4 (М - маркер молекулярных масс)
Таблица 3
Аллельный состав микросателлитных локусов исследованных генотипов березы (п. н.)
Образец ^^^^^ Локус L1.10 L2.3 L3.1 L3.4 L4.4 L5.4 L7.1a L7.3 L7.4 L13.1 L021 Bo.F394
1 190/190 210/210 230/230 250/270 260/260 250/250 150/150 200/200 250/250 120/120 190/190 140/140
2 170/190 190/220 230/230 270/270 260/260 240/240 150/150 200/200 250/250 100/100 190/190 140/140
3 190/190/ 190 190/220 210/230/ 240 270/270/ 270 260/260/ 260 240/240/ 240 150/150/ 150 200/200/ 200 250/250/ 250 120/120/ 120 190/190/ 190 150/150/ 150
4 190/190 190/220 210/240 250/250 260/260 250/250 150/150 230/230 240/250 80/110 190/190 150/150
5 190/190 190/190 230/230 250/250 260/260 240/260 150/150 200/230 250/250 110/110 190/190 140/150
6 190/190 190/220 210/230 250/250 260/260 240/260 150/150 200/200 250/250 80/110 190/190 140/150
7 200/200/ 200 190/190/ 190 210/230/ 240 250/250/ 250 260/280 250/250/ 250 150/150/ 150 200/220 250/250/ 250 110/110/ 110 190/190/ 190 140/140/ 140
8 170/170 190/190 210/210 250/270 260/260 240/260 150/150 220/220 250/250 80/110 190/190 140/140
9 170/190 190/190 230/230 250/270 260/260 240/260 150/150 220/230 250/250 110/110 190/190 140/140
10 160/160 190/220 230/230 270/270 280/280 240/240 150/150 200/200 250/250 100/100 190/190 140/160
По 12 исследованным SSR-маркерам составлены мультилокусные паспорта генотипов березы (табл. 3), позволяющие на основе наличия (1) / отсутствия (0) 36 аллелей идентифицировать исследованные образцы. По результатам проведенного молекулярного анализа установлено, что образцы берёзы повислой (Betula pendula Roth.) отличаются от берёзы пушистой (Betula pubescens Ehrh.) по локусам L. 3.1, L.7.3, L.1.10, L.4.4, L.5.4, L13.1 наличием или отсутствием выявленных ДНК-ампли-конов. От берёзы карельской (Betula pendula var. carelica) берёза повислая и пушистая различаются по локусам L.2.3, L.7.3, L.1.10, L.4.4, L.5.4.
Заключение. Таким образом, в результате проведенной работы показана возможность диагностирования индивидуальных генотипов березы на основе полиморфизма микросателлитных маркеров. Составлены мультилокусные генетические паспорта для 31 исследованного образца березы, которые позволяют проводить идентификацию и паспортизацию генотипов данного объекта. Из
анализа полученных данных следует, что для проведения молекулярно-генетической паспортизации и идентификации ценных для селекции генотипов березы предлагается применять микросателлитные локусы: Ь1.10, Ь2.3, Ь3.1, Ь3.4, Ь4.4, Ь5.4, Ь7.3, Ь7.4, L13.1 и Бо.Б394 (уровень полиморфизма локусов составляет 50-100 %).
На первых этапах для анализа генетического разнообразия берёз необходимо использовать ядерные микросателлитные маркеры. Они имеют дву-родительское наследование, в геномах берёзы многочисленны, кодоминантны, вариабельны и распространены во всех частях генома. Также микроса-теллитные маркеры позволяют выявлять самый высокий уровень гетерозиготности.
Примечание авторов: полные мультилокусные генетические паспорта всех исследованных генотипов берёзы, полные шифры локусов и элек-трофореграммы могут быть предоставлены авторами по запросу.
Таблица 4
Мультилокусные генетические паспорта исследованных генотипов березы (пример)
L1.10 L2.3 L3.1 L3.4 L4.4 L5.4
Образец Локус (п. н. о 40 0 0 0 0 (N 0 0 (N 0 (N (N 0 (N 0 on (N 0 ^t-<N 0 <N 0 <N 0 <N 0 <N 0 40 <N 0 00 <N 0 ^t-<N 0 <N 0 40 <N 0 <N
1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0
2 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0
3 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0
4 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0
5 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0
6 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0
7 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0
8 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0
9 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0
10 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0
Цветом обозначены уникальные генотипы берёзы.
Библиографический список
1. Zienkiewicz E. Genome fingerprinting by simple sequence repeats (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification [Text] / E. Zienkiewicz, A. Rafalski, В. Labuda // Genomics. - № 20. - P. 176-183.
2. Microsatellite sequences: a new generation of molecular markers for forest genetics [Text] / F. Lefort, C. Echt, R. Streiff, G. G. Vendramin // Forest Genetics. - 1999. - № 6 (1). - P. 15-20.
3. Jarvinen P. Nucleotide variation of birch (Betula L.) species: population structure and phylogenetic relationships [Text] : PhD diss. / P. Jarvinen. - Joensuu, 2004. - 138 p.
4. Изучение генетической структуры популяций карельской березы в Республике Карелии с помощью микросателлитного анализа [Текст] / Л. В. Ветчинникова, А. Ф. Титов, Л. В. Топчиева, Н. Л. Рендаков // Проблемы объектов лесной науки: современное состояние и перспективы. - Воронеж, 2014. - С. 10-12.
5. Оценка генетического разнообразия популяций карельской березы в Карелии с помощью микросателлитных маркеров [Текст] / Л. В. Ветчинникова, А. Ф. Титов, Л. В. Топчиева, Н. Л. Рендаков // Экологическая генетика. - 2012. - Т. 10. - № 1. - С. 34-37.
6. Исаков И. Ю. Генотипирование селекционных форм лиственных древесных растений с использованием баз данных сиквенсов ДНК [Текст] / И. Ю. Исаков // Проблемы объектов лесной науки: современное состояние и перспективы. - Воронеж, 2014. - С. 42-43.
7. Population history, genetic variation and conservation status of the endangered birch species Betula nana L. in Poland [Text] / K. A. Jadwiszczak, D. Drzymulska, A. Banaszek, P. Jadwiszczak // Silva Fennica. - 2012. - № 46 (4). -P. 465-477.
8. Genetic diversity and genetic structure of adult and buried seed populations of Betula maximowicziana in mixed and post-fire stands [Text] / K. Uchiyama, S. Goto, Y. Tsuda, Y. Takahashi, Y. Ide // Forest Ecology and Management. - 2006. - № 237. - P. 119-126.
9. Kulju K. K. M. Twenty-three microsatellite primer pairs for Betula pendula (Betulaceae) [Text] / K. K. M. Kulju, M. Pekkinen, S. Varvio // Molecular Ecology Notes. - 2004. - № 4. - P. 471-473.
10. Isolation and characterization of microsatellite markers in the tetraploid birch, Betula pubescens ssp. tortuosa [Text] / C. Truong, A. E. Palmé, F. Felber, Y. Naciri-Graven // Molecular Ecology Notes. - 2005. - № 5. - P. 96-98.
11. Isolation and characterization of 19 microsatellite markers in a tropical and warm subtropical birch, Betula alnoides Buch.-Ham. ex D. Don [Text] / J. J. Guo, J. Zeng, S. L. Zhou, Z. G. Zhao // Molecular Ecology Resources. -2008. - № 8 (4). - P. 895-897.
12. Gürcan K. Transferability of microsatellite markers in the Betulaceae [Text] / K. Gürcan, Sh. A. Mehlenbacher // J. Amer. Soc. Hort. Sci. - 2010. - № 135 (2). - P. 159-173.
13. Cross-species amplification of Betula pendula Roth simple sequence repeat markers in Alnus species [Text] / A. Zhuk, I. Veinberga, M. Daugavietis, D. Rungis // Baltic Forestry. - 2008. - № 14 (2). - P. 116-121.
14. Исаков Ю. Н. Интеграционно-эпигенетическое происхождение карельской берёзы: гипотеза и факты [Текст] / Ю. Н. Исаков, Н. М. Соустова, И. Ю. Исаков // Структурные и функциональные отклонения от нормального роста и развития растений под воздействием факторов среды. - Петрозаводск, 2011. - С. 98-103.
15. Palmé A. Evolution history and chloroplast DNA variation in three plant genera: Betula, Corylus and Salix. The impact of post-glacial colonisation and hybridization [Text] : Comprehensive summaries of dokt. diss. / A. Palmé. -Uppsala, 2003. - 59 p.
16. Linkage map of birch, Betula pendula Roth, based on microsatellites and amplified fragment length polymorphisms [Text] / M. Pekkinen, S. Varvio, K. K. M. Kulju, H. Kärkkäinen, S. Smolander, A. Viherä-Aarnio, V. Koski, M. J. Sillanpää // Genome. - 2005. - № 48. - P. 619-625.
17. Doyle J. J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue [Text] / J. J. Doyle, J. L. Doyle // Phytochem Bull. - 1987. - № 19. - P. 11-15.
References
1. Zienkiewicz E. Genome fingerprinting by simple sequence repeats (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification / E. Zienkiewicz, A. Rafalski, В. Labuda // Genomics. - № 20. - P. 176-183.
2. Microsatellite sequences: a new generation of molecular markers for forest genetics / F. Lefort, C. Echt, R. Streiff, G. G. Vendramin // Forest Genetics. - 1999. - № 6 (1). - P. 15-20.
3. Järvinen P. Nucleotide variation of birch (Betula L.) species: population structure and phylogenetic relationships: PhD diss. / P. Järvinen. - Joensuu, 2004. - 138 p.
4. Izucheniye geneticheskoy struktury populyatsiy kаrelskoy berozy v Respublike Kаrelii s pomoshchyu mikrosаtellitnogo аnаlizа / L. V. Vetchinnikova, A. F. Titov, L. V. Topchiyeva, N. L. Rendakov // Problemy obyektov lesnoy nauki: sovremennoe sostoyanie i perspektivy. - Voronezh, 2014. - S. 10-12.
5. Otsenka geneticheskogo raznoobraziya populyatsiy karelskoy berezy v Karelii s pomoshchyu mikrosatellitnykh markerov / L. V. Vetchinnikova, A. F. Titov, L. V. Topchiyeva, N. L. Rendakov // Ekologicheskaya genetika. - 2012. - T. 10. - № 1. - S. 34-37.
6. Isakov I. Yu. Genotipirovanie selektsionnykh form listvennykh drevesnykh rasteniy s ispolzovaniem baz dannykh sikvensov DNK / I. Yu. Isakov // Problemy obyektov lesnoy nauki: sovremennoe sostoyanie i perspektivy. -Voronezh, 2014. - S. 42-43.
7. Population history, genetic variation and conservation status of the endangered birch species Betula nana L. in Poland / K. A. Jadwiszczak, D. Drzymulska, A. Banaszek, P. Jadwiszczak // Silva Fennica. - 2012. - № 46 (4). -P. 465-477.
8. Genetic diversity and genetic structure of adult and buried seed populations of Betula maximowicziana in mixed and post-fire stands / K. Uchiyama, S. Goto, Y. Tsuda, Y. Takahashi, Y. Ide // Forest Ecology and Management. -2006. - № 237. - P. 119-126.
9. Kulju K. K. M. Twenty-three microsatellite primer pairs for Betula pendula (Betulaceae) / K. K. M. Kulju, M. Pekkinen, S. Varvio // Molecular Ecology Notes. - 2004. - № 4. - P. 471-473.
10. Isolation and characterization of microsatellite markers in the tetraploid birch, Betula pubescens ssp. tortuosa / C. Truong, A. E. Palmé, F. Felber, Y. Naciri-Graven // Molecular Ecology Notes. - 2005. - № 5. - P. 96-98.
11. Isolation and characterization of 19 microsatellite markers in a tropical and warm subtropical birch, Betula alnoides Buch.-Ham. ex D. Don / J. J. Guo, J. Zeng, S. L. Zhou, Z. G. Zhao // Molecular Ecology Resources. - 2008. -№ 8 (4). - P. 895-897.
12. Gürcan K. Transferability of microsatellite markers in the Betulaceae / K. Gürcan, Sh. A. Mehlenbacher // J. Amer. Soc. Hort. Sci. - 2010. - № 135 (2). - P. 159-173.
13. Cross-species amplification of Betula pendula Roth simple sequence repeat markers in Alnus species / A. Zhuk, I. Veinberga, M. Daugavietis, D. Rungis // Baltic Forestry. - 2008. - № 14 (2). - P. 116-121.
14. Isakov Yu. N. Integratsionno-epigeneticheskoye proiskhozhdeniye karelskoy berozy: gipoteza i fakty / Yu. N. Isakov, N. M. Soustova, I. Yu. Isakov // Strukturnye i funktsionalnye otkloneniya ot normalnogo rosta i razvitiya rasteniy pod vozdeystviyem faktorov sredy. - Petrozavodsk, 2011. - S. 98-103.
15. Palmé A. Evolution history and chloroplast DNA variation in three plant genera: Betula, Corylus and Salix. The impact of post-glacial colonisation and hybridisation: Comprehensive summaries of dokt. diss. / A. Palmé. -Uppsala, 2003. - 59 p.
16. Linkage map of birch, Betula pendula Roth, based on microsatellites and amplified fragment length polymorphisms / M. Pekkinen, S. Varvio, K. K. M. Kulju, H. Kärkkäinen, S. Smolander, A. Viherä-Aarnio, V. Koski, M. J. Sillanpää // Genome. - 2005. - № 48. - P. 619-625.
17. Doyle J. J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue / J. J. Doyle, J. L. Doyle // Phytochem Bull. - 1987. - № 19. - P. 11-15.
Сведения об авторах
Федулова Татьяна Петровна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии ФГБУ «Всероссийский научно-исследовательский институт лесной генетики, селекции и биотехнологии», 394043, г. Воронеж, ул. Ломоносова, д. 105, т.: +7 (473) 253-71-89, e-mail: biotechnologiya@mail.ru
Исаков Юрий Николаевич - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории экологической генетики ФГБУ «Всероссийский научно-исследовательский институт лесной генетики, селекции и биотехнологии», 394043, г. Воронеж, ул. Ломоносова, д. 105, т.: +7 (473) 253-71-89
Корчагин Олег Михайлович - директор ФГБУ «Всероссийский научно-исследовательский институт лесной генетики, селекции и биотехнологии», г. Воронеж, ул. Ломоносова, д. 105; кандидат биологических наук, доцент кафедры ботаники и физиологии растений ФГБОУ ВО «Воронежский государственный лесотехнический университет имени Г.Ф. Морозова», г. Воронеж, ул. Тимирязева, 8
Исаков Игорь Юрьевич - кандидат сельскохозяйственных наук, доцент кафедры лесных культур, селекции и лесомелиорации ФГБОУ ВО «Воронежский государственный лесотехнический университет имени Г.Ф. Морозова», г. Воронеж, ул. Тимирязева, 8, e-mail:isakov@vmail.ru
Кондратьева Анна Михайловна - кандидат биологических наук, научный сотрудник ФГБУ «Всероссийский научно-исследовательский институт лесной генетики, селекции и биотехнологии», 394043, г. Воронеж, ул. Ломоносова, д. 105, т.: +7 (473) 253-71-89, e-mail: kondratyeva_anya@mail.ru
Ржевский Станислав Геннадъевич - младший научный сотрудник ФГБУ «Всероссийский научно-исследовательский институт лесной генетики, селекции и биотехнологии», 394043, г. Воронеж, ул. Ломоносова, д. 105, т.: +7 (473) 253-71-89, e-mail: molecularbiotech@mail.ru
Information about authors
Fedulova Tatiana Petrovna - Doctor of biological Sciences, leading researcher of laboratory of biotechnology, FSBI "All-Russian research Institute of forest genetics, breeding and biotechnology", 394043, Voronezh, Lomonosov street, d. 105, t: +7 (473) 253-71-89, e-mail: biotechnologiya@mail.ru
Isakov Yuri Nikolaevich - Doctor of biological Sciences, leading researcher of laboratory of ecological genetics, FSBI "All-Russian research Institute of forest genetics, breeding and biotechnology", 394043, Voronezh, Lomonosov street, d. 105, t: +7 (473) 253-71-89
Korchagin Oleg Mikhailovich - Director of FSBI "All-Russian research Institute of forest genetics, breeding and biotechnology", Voronezh, Lomonosov street, d. 105, t: +7 (473) 253-71-89; Candidate of biological Sciences, Associate Professor of the Department of botany and plant physiology, "Voronezh State Forestry Engineering University named after G. F. Morozov", Voronezh, Timiryazev str., 8
Isakov Igor Yurievich - Candidate of agricultural Sciences, Associate Professor of forest crops, selection and forest reclamation, "Voronezh State Forestry Engineering University named after G. F. Morozov", Voronezh, Timiryazev str., 8 e-mail:isakov@vmail.ru
Kondratieva Anna Mikhailovna - Candidate of biological Sciences, Researcher of the FSBI "All-Russian research Institute of forest genetics, breeding and biotechnology", 394043, Voronezh, Lomonosov street, d. 105, t: +7 (473) 253-71-89, e-mail: kondratyeva_anya@mail.ru
Rzhevskiy Stanislav Gennadyevich - Junior researcher of the FSBI "All-Russian research Institute of forest genetics, breeding and biotechnology", 394043, Voronezh, Lomonosov street, d. 105, t: +7 (473) 253-71-89, e-mail: molecularbiotech@mail.ru
