CC BY
77
УДК 18:632.488.42:575
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ SSR-МАРКЕРОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ УРОВНЯ ГИБРИДНОСТИ СЕМЯН СЛАДКОГО ПЕРЦА
Е.В. ДУБИНА, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник (e-mail: lenakrug1@rambler. ru)
С.В. КОРОЛЁВА, кандидат сельскохозяйственных наук, зав. отделом
С.В. ГАРКУША, доктор сельскохозяйственных наук, директор
Всероссийский научно-исследовательский институт риса, пос. Белозерный, 3, Краснодар, 350921, Российская Федерация
Резюме. На базе лаборатории биотехнологии и молекулярной биологии ФГБНУ ВНИИ риса (Краснодар) в 20132016 гг. выполнены исследования по разработке методики оценки генетической чистоты семян F1 Capsicum annuum L., основанной на полиморфизме микросателлитных ДНК-маркеров. Материалом послужили генотипы перца сладкого, использованные в селекционной работе в отделе овощекар-тофолеводста ФГБНУ ВНИИ риса (Краснодар) для создания гибридов F1 Фишт и Памир. Апробировано 12 кодоминантных микросателлитных (SSR) маркеров и установлен уровень их полиморфного информационного содержания для 17 генотипов перца сладкого. Для выделения ДНК из образцов растений использовали бесхлорофилльные семидневные проростки. Экстракцию ДНК выполняли СТАВ-методом. Олигонуклеотид-ные последовательности кодоминантных SSR-маркеров взяты из базы данных на сайте www.VegMarks. Для электрофоре-тического разделения продуктов ПЦР использовали 8%-ный полиакриламидный гель на основе 1 *Трис-боратного буфера. Визуализацию проводили в ультрафиолете после окрашивания гелей бромистым этидием (EtBr). По результатам ДНК-анализа выделено 3 кодоминантных микросателлитных локусаДНК(CAMS-117 - 11 хромосома, CAMS-142 - 1 хромосома и CAMS-405 - 8 хромосома) с уровнем полиморфизма, пригодным для молекулярно-генетической дифференциации изученной группы генотипов Capsicum annuum L. (15-16аллелей). Уровень гибридности F1 Памир полокусам CAMS-142 и CAMS-117 составил 92% (на 100 проанализированных растений - 8 материнских), Фишт - 96%. Установленная высокая степень полиморфизма системы молекулярного маркирования на основе микросателлитныхлокусов ДНК дает
Таблица. Нуклеотидная последовательность SSR-
возможность использовать её как надежный лабораторный метод определения уровня гибридности гибридов Г1 перца сладкого, а также для оценки сортовых качеств семян. Ключевые слова: сладкий перец, ББЯ-маркеры, молекулярное маркирование.
Дляцитирования: Дубина Е.В., Королёва С.В., Гаркуша С.В. Использование ББЯ-маркеров для оценки уровня гибридности семян сладкого перца //Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. № 8. С. 42-44.
Перец сладкий (Capsicum annuum L.) - одна из самых древних и популярных овощных культур в мире. Для поддержания высокой эффективности его семеноводства необходим мониторинг уровня гибридности коммерческих партий семян гибридов F1. Для решения этой задачи традиционно используют метод грунт-контроля, который требует значительных затрат времени и посевных площадей. Кроме того, проявление морфологических признаков в значительной степени зависит от условий окружающей среды. Наиболее перспективные системы маркирования семенного материала основаны на оценке полиморфизма ДНК. В частности, микросателлитные повторы ДНК (SSR) стабильны в соматических клетках, локусспецифичны, их наследование, как правило, носит кодоминантный характер, что позволяет отличать гомозиготное состояние исследуемого локуса от гетерозиготного [1, 2]. Распределение по всему геному облегчает использование этих маркеров, как для молекулярного картирования, так и для выполнения ряда прикладных селекционно-генетических задач [3, 4].
Цель исследований - разработать методическую схему оценки уровня гибридности (процента гибридных семянок) для гибридов F1 перца сладкого на основе ПЦР (микросателлитного) анализа.
Условия, материалы и методы. Исследования выполнены на базе лаборатории биотехнологии и молекулярной биологии ФГБНУ ВНИИ риса в условиях ла-маркеров на Capsicum annuum L.
Название праймера Сиквенс Мотив Хромосома Преинициа-торный комплекс (PIC) Размер продукта, п.н.*
CAMS-142 F gagcgcttaagtggtcatagg (ta)3...(ac)7... 7 0.78 241
R ctacaacgccccaaaacaat (ac)12a(ta)8
CAMS-153 F tgcacaaatatgaatcccaaga (ta)7(tg)14cg(tg)6 6 0.73 243
R aagtcagcaaacacatctgacaa
CAMS-156 F ccctatgctttcacaactcct (ac)14a(ta)6 10 0.71 181
R gacgtggttatgacgataggc
CAMS-398 F atggtccatggtcagcagat (ag)22 7 0.73 165
R gggcagaacagtggatgatt
CAMS-606 F gactagtccccgttcaacca (gt)3...(tc)14 7 0.78 208
R tttgcgagaagatgcttcag
CAMS-806 F tgtcacaagtgtcaaggtaggag (aga)19 10 0.79 227
R ccccaaaaattttccctcat
CAMS-117 F ttgtggaggaaacaagcaaa (tg)21(ta)3 11 0.86 223
R cctcagcccaggagacataa
CAMS-405 F ttcttgggtcccacactttc (tc)18 8 0.83 241
R aggttgaaaggagggcaata
CAMS-811 F gaagaaacgaaggatgaacaaaa (aag)3...(gaa)3... 9 0.82 260
R cctgtttcctcttcctcagc (gaa)7
CAMS-234 F tatagcccatgggtgccttt (ta)5(tg)6cg(tg)7 6 0.78 157
R aaaacccaatattaaccatatgcaa
CAMS-236 F ttgtagtttgcgtaccatttga (ac)14a(ta)10 2 0.70 191
R atgaatccagggttccacaa
CAMS-864 F ctgttgtggaagaagaggaca (aga)32 7 0.86 222
R gcttctttttcaacctcctcct
*п.н. - пар нуклеотидов.
t—1
* — 14 >411
— — 1 Н —1
►•Ниммамивианиеи *
Min СкиПам S6 Фиш Спя Быа ЛЗОТн ЛЗОТвФл Сам122 Кр 11м84 Гол Лум S2 ЭнеЛКад ГШ 55 мергц CAMS 405
ДНК-маркирования первоначально проверили полиморфизм ББЯ-маркеров между родительскими формами перца сладкого (см. табл.). У исследованного набора образцов выявлено 16 аллелей по микроса-теллитному локусу САМБ-405 (рис. 1) и столько же по локусу САМБ-117 (рис. 2).
Рис. 1. Амплификация ДНК генотипов перца сладкого с парой праймеров CAMS-405: Mm - маркер молекулярной массы, Сам - ms См, Пам - Памир F1, S6 - ?S6 (материнская форма), Фиш - Фишт F1, Стал - Zg 1, Биа - Биа 132, Л307нз (плоды опущены вниз), Л307вх (плоды подняты вверх), Фл -Фламинго, Сам 122 - Сам 122, Креп - Креп 312, ПМ 84 - ПМ 84, Гл - ms Гл, Лум - ms Лум, S2 - S2, Эн - ms Эн, Кад - ms Кад, ПП - ms Янт 1, 55- Селигер F1.
бораторного опыта. Полиморфизм микросателлитных локусов проверяли на 17 родительских линиях перца сладкого, используемых в селекционном процессе в отделе овощекартофолеводства ФГБНУ ВНИИ риса при создании гибридов F1 Capsicum annuum L. Уровень гибридности определяли у районированных на территории Краснодарского края гибридов F1 перца сладкого Фишт и Памир (по 100 растений).
Молекулярно-генетические исследования проводили методом ПЦР с использованием кодоминантных микросателлитных молекулярных маркеров, взятых из базы данных на сайте www.VegMarks (см. табл.) [1, 2, 5]. ДНК для ПЦР-анализа выделяли методом СТАВ по Марею [6]. ПЦР проводили в конечном объёме 25 мкл: 0,1 цМ dNTPs, 25мМ KCl, 60 мМ Tris-HCl (pH 8,5), 0,1% Тритон Х-100б, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1,5 мМ MgCl2, 1 единица Taq-полимеразы, 0,3 цМ праймеров и 40-50 нг ДНК.
Амплификацию осуществляли в ДНК-амплификаторе «Bio-Rad», оптимизировав при этом условия ПЦР. Это позволило обеспечить высокий выход целевых ампли-фицированных фрагментов, наряду с минимальным количеством неспецифичных амплификатов: начальная денатурация при 94 °С - 3 мин, 1 цикл; следующие 10 циклов - денатурация при 94 °С - 30 с; отжиг праймеров при 60 °С - 1 мин, каждый последующий цикл температуру отжига снижали на 1 °С; синтез при 72 °С - 1 мин; следующие 30 циклов - денатурация при 94 °С - 30 с; отжиг праймеров при 55 °С - 1 мин; синтез при 72 °С - 1 мин; завершающий синтез при 72 °С - 5 мин, 1 цикл.
Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле при напряжении 250 В/см, 3 ч. Их визуализацию проводили в ультрафиолетовом свете, предварительно пластину геля окрашивали 1%-ным раствором бромистого этидия (BrEt, 2,7-диамино-10-этил-9-фенилфенатридинийбромид, хомидий бромид) [7, 8].
Идентификацию и определение размеров аллелей микросателлитных локусов проводили путём сравнения со стандартным образцом - маркером молекулярной массы pBR322/BsuR I (Хеликон) с использованием программы Gel-Pro Analyzer 3.1.
Результаты и обсуждение. Для оценки уровня гибридности гибридов F1 перца сладкого на основе
Рис. 2. Амплификация ДНК генотипов перца сладкого с парой праймеров САМБ-117: Мт - маркер молекулярной массы, Сам - те См, Пам - Памир F1, Б6 - ?Б6 (материнская форма), Фиш - Фишт F1, Стал - Zg 1, Биа - Биа 132, Л307нз (плоды опущены вниз), Л307вх (плоды подняты вверх), Фл -Фламинго, Сам 122 - Сам 122, Креп - Креп 312, ПМ 84 - ПМ 84, Гл - те Гл, Лум - те Лум, Б2 - Б2, Эн - те Эн, Кад - те Кад, ПП - те Янт 1, 55- Селигер F1.
По локусу САМБ-142 также зафиксирован высокий уровень полиморфизма анализируемых генотипов -15 аллелей (рис. 3).
U А >41 DililMI I ——-«fit--«i..i»-
== JBbtiifcL— «а
WHt' MM
Рис. 3. Амплификация ДНК генотипов перца сладкого с парой праймеров CAMS-142: Mm - маркер молекулярной массы, Сам - ms См, Пам - Памир F1, S6 - ?S6 (материнская форма), Фиш - Фишт F1, Стал - Zg 1, Биа - Биа 132, Л307нз (плоды опущены вниз), Л307вх (плоды подняты вверх), Фл -Фламинго, Сам 122 - Сам 122, Креп - Креп 312, ПМ 84 - ПМ 84, Гл - ms Гл, Лум - ms Лум, S2 - S2, Эн - ms Эн, Кад - ms Кад, ПП - ms Янт 1, 55- Селигер F1.
Всего по изученным микросателлитным локусам у исследованного набора образцов перца сладкого выявлено 72 аллели. Наибольшее их число (15-16) детектировано для локусов CAMS-405, CAMS-142, CAMS -117, наименьшее (1-2) - для локусов CAMS-398, CAMS-811.
По результатам проведенного ПЦР-анализа из 12 изученных кодоминантных микросателлитных маркеров высокую эффективность в выявлении внутривидового
результате самоопыления. Процент гибридных растений по результатам микросателлитного анализа по локусам САМБ-142 и САМБ-117 составил по 92% (на 100 проанализированных растений - 8 материнских).
Рис. 4. Аллельная миграция в локусе САМБ-142 гибрида F1 Памир перца сладкого:?Б6 - материнская форма, 3Сам -отцовская форма.
полиморфизма показали три: САМБ-117 (11 хромосома), САМБ-142 (1 хромосома) и САМБ-405 (8 хромосома).
На следующем этапе работы для оценки уровня гибридности районированных на территории Краснодарского края гибридов F1 перца сладкого Фишт и Памир был проведен ПЦР-анализ с использованием двух кодоминантных ББЯ-маркеров - САМБ-142 (рис. 4) и САМБ-117 (рис. 5).
Электрофореграмма демонстрирует, что образцы перца сладкого Памир №№ 19, 18, 15, 14, 12, 1-9 по локусу САМБ-142 имеют как «отцовские», так и «материнские» аллели и, таким образом, представляют собой гибриды. Образцы № 17, 16, 13 несут только «материнскую» аллель и, следовательно, получены в
ам
ШяШщ
4Ш
Рис. 5. Аллельная миграция в локусе САМБ-117 гибрида F1 Памир перца сладкого: ? - Б6, 3 - те См.
Уровень гибридности гибрида F1 перца сладкого Фишт по локусам САМБ-117 и САМБ-142 был равен 96%.
Выводы. Таким образом, установленная высокая степень полиморфизма системы молекулярного маркирования на основе микросателлитных локусов ДНК позволяет с успехом использовать её как надежный лабораторный метод определения уровня гибридности гибридов F1 перца сладкого, а также для оценки сортовых качеств семян.
Литература.
1. Morgante M., Oliveri A.M. PCR-amplified microsatellite markers in plant genetics//Plant J. 1993. V. 3. Рр. 175-182.
2. Thomas M.R., Scott N.S. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphism when analysed as sequence-tagged sites (STSs)// Theor. Appl. Genet. 1993. V.86. Рр. 985-990.
3. DNA polymorphism in genetic resources of red pepper using microsatellite markers / P. Hanacek, T. Vyhnanek, M. Rohrer, J. Cieslarova, H. Stavelikova // Hort. Sci. (Prague ). 2009. V. 36 (4). Pp. 127-132.
4. Байназарова А. Н. Молекулярно-генетическое изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus L.) и его применение для оценки гибридности семян и маркирования устойчивости к мучнистой росе: дисс. ... канд. биол. наук. М., 2009. 115 с.
5. Minamiyama Y., Tsuro M., Hirai M. An SSR based linkage map of Capsicum annuum. Molecular Breeding. 2006. V. 18. Pp. 157-169.
6. Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA // Nucleic Acids Research. 1980. No 10. Pp. 4321-4325.
7. Остерман Л.А. Методы исследования нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1981. 288 с.
8. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов//Молекулярная клиническая диагностика. М.: Мир, 1999. С. 395-427.
USE OF SSR-MARKERS FOR EVALUATING HYBRID LEVEL OF SWEET PEPPER
E.V. Dubina, S.V. Koroleva, S.V. Garkusha
All-Russian Rice Research Institute, pos. Belozernyi, 3, Krasnodar, 350921, Russian Federation
Summary. The studies were carried out at the premises of the laboratory of biotechnology and molecular biology of the FGBNU All-Russian Research Institute of Rice Breeding (Krasnodar) in 2013-2016. The aim of the study was to develop a method for evaluation of genetic purity of seeds F1 of Capsicum annuum L., based on the polymorphism of microsatellite DNA markers. The material was sweet pepper genotypes used in breeding work of the department of vegetable and potato breeding of the FGBNU All-Russian Research Institute of Rice Breeding (Krasnodar) to create F1 hybrids Fisht and Pamir. Twelve codominant microsatellite (SSR) markers were approved, and the level of its polymorphic information content for 17 genotypes of sweet pepper was determined. To isolate DNA from plant samples we used achlorophyllous seven-day seedlings. DNA extraction was carried out by CTAB method. The oligonucleotide sequences of the codominant SSR-markers drawn from a database on www.VegMarks site. For the electrophoretic separation of PCR products it was used 8% polyacrylamide gel on the basis of 1x Tris-borate buffer. Visualization was performed in ultraviolet after staining the gels with ethidium bromide (EtBr). According to DNA analysis results it was selected three codominant microsatellite DNA loci (CAMS-117 - 11th chromosome, CAMS-142 - 1st chromosome and CaMs-405 - 8th chromosome) with the polymorphism level suitable for molecular genetics differentiation of the studied group of genotypes of Capsicum annuum L. (15-16 alleles). The level of hybridity of the hybrid F1 Pamir for loci CAMS-142 and CAMS-117 was 92% (it was 8 maternal plants per 100 studied plants), of Fisht - 96%. The determined high degree of polymorphism of the system of molecular marking based on DNA microsatellite loci enables to successfully use it as a reliable laboratory method for determining the level of hybridity of hybrids F1 of sweet peppers, as well as to assess the variety qualities of seed. Keywords: sweet pepper, SSR-markers, molecular marking.
Author Details: E.V. Dubina, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow (e-mail: lenakrug1@rambler.ru); S.V. Koroleva, Cand. Sc. (Agr.), head of division; S.V. Garkusha, Dr. Sc. (Agr.), director.
For citation: Dubina E.V., Koroleva S.V., Garkusha S.V. Use of SSR-Markers for Evaluating Hybrid Level of Sweet Pepper. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2016. V. 30. No 8. Pp. 42-44 (in Russ.).
