CC BY
46
УДК 18:632.488.42:575
РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКОМ СХЕМЫ ОЦЕНКИ
ГИБРИДНОСТИ СЕМЯН F. BRASSICA OLERACEA L.,
«_» _ _ _
ОСНОВАННОМ НА ПОЛИМОРФИЗМЕ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ДНК-МАРКЕРОВ
Е.В. ДУБИНА, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник (e-mail: [email protected])
С.В. КОРОЛЁВА, кандидат сельскохозяйственных наук, зав. отделом
С.В. ГАРКУША, доктор сельскохозяйственных наук, директор
С.А. ЮРЧЕНКО, младший научный сотрудник
Л.В. ЕСАУЛОВА, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
Всероссийский научно-исследовательский институт риса, пос. Белозерный, 3, Краснодар, 350921, Российская Федерация
Резюме. Исследования выполнены на базе лаборатории биотехнологии и молекулярной биологии ФГБНУ ВНИИ риса в условиях лабораторного опыта в 2013-2016 гг. с целью разработки методической системы оценки генетической чистоты семян F1 Brassica oleracea L., основанной на полиморфизме микро-сателлитных ДНК-маркеров. Материалом послужили генотипы капусты белокочанной, используемые в селекционной работе отделом овощекартофолеводста ФГБНУ ВНИИ риса для создания гибридов F1. В работу вовлечены 19 кодоминантных микро-сателлитных (SSR) маркеров. Выделение ДНК осуществляли методом СТАВ. Из исследуемого набора микросателлитных маркеров наибольший полиморфизм между родительскими формами существует по локусам Na12-F12 и Na12-A02. Заметные отличия по отдельным аллелям отмечены по локусам Ra2-E12, Ni2B02, SSR 10, 6 и 7. По всем остальным изученным SSR-маркерам отличий по ДНК-профилю между родительскими линиями Brassica oleracea L. не установлено. Для 19 локусов в 5 образцах капусты белокочанной обнаружено 28 аллельных состояний (в среднем по 3 аллеля на локус). Наибольшее число аллелей (6-8) для выбранного набора генотипов было детектировано для локусов Na12-A02, Na12-F12, локализованных на разныххромосомах SSR маркера, наименьшее (1-2) для локусов Na10-D09, Ra2-E12 и Ni3-G04B. При апробации 19 SSR маркеров высокую эффективность в выявлении внутривидового полиморфизма коллекционных образцов капусты белокочанной отдела овощеводства показали 3 наиболее информативных, локализо-ваных на разных хромосомах - Na12-A02, Na12-F12 и Ra2-E12, которые можно рекомендовать для применения в дальнейшей работе при оценки гибридности коммерческих партий семян гибридов F1 капусты белокочанной ПЦР-методом. Ключевые слова: капуста белокочанная, линии и гибриды F1, гибридность, SSR-маркеры, молекулярное маркирование, ДНК-паспорта.
Для цитирования: Разработка методической схемы оценки гибридности семян F1 Brassica oleracea L., основанной на полиморфизме микросателитных ДНК-маркеров / Е.В. Дубина, С.В. Королёва, С.В. Гаркуша, С.А. Юрченко, Л.В. Есаулова//Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. № 8. С. 49-51.
Для «гетерозисных» культур (капуста, подсолнечник и др.) особенно важно определение гибридности, поскольку в этом случае урожайность напрямую зависит от доли гибридных семянок в реализуемой партии, которая не должна быть ниже 98%. В существующей системе семеноводства величину этого показателя определяют традиционными методами апробации посевов или грунт-контроля (Закон РФ «О семеноводстве»). Такую ситуацию нельзя признать удовлетворительной, поскольку существуют гибриды неотличимые по морфологическим признакам.
Наличие надежного экспресс-метода оценки генетической однородности реализуемых семян гибридов
Достижения науки и техники АПК. 2016. Т 30. № 8 —
капусты белокочанной чрезвычайно важно для качественного семеноводства [1].
Современные биотехнологические методы (геноти-пирование микросателлитных локусов ДНК) позволяют решить эту проблему с высокой точностью [2]. Микросателлиты представляют собой простые, наиболее доступные, удобные и относительно недорогие маркеры, пригодные, прежде всего, для идентификации генотипов. Они стабильны в соматических клетках, локусспецифич-ны, их наследование как правило носит кодоминантный характер, что позволяет отличать гомозиготное состояние исследуемого локуса ДНК от гетерозиготного [3, 4].
Зарубежные авторы ранее уже использовали микро-сателлитные маркеры для изучения биоразнообразия капусты белокочанной [2, 5]. Есть такой опыт и у российских ученых [1].
Цель исследований - разработать методическую систему оценки генетической чистоты семян F1 Brassica oleracea L., основанную на полиморфизме микросателлитных ДНК-маркеров.
Условия, материалы и методы. Работа выполнена на базе лаборатории биотехнологии и молекулярной биологии ФГБНУ ВНИИ риса в условиях лабораторного опыта в 2013-2016 гг. Материалом для исследования послужили генотипы капусты белокочанной, используемые в отделе овощекартофолеводста ФГБНУ ВНИИ риса для создания гибридов F1.
Для изучения уровня полиморфизма микросателлитных локусов между родительскими формами капусты белокочанной использовали ДНК-анализ на основе метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) [1, 2], апробировали кодоминантные SSR маркеры [5], взятые в исследование на основание информации базы данных на сайте www. VegMarks (табл. 1).
Выбранная система молекулярного маркирования приоритетна для «гетерозисных» культур ввиду высокого уровня полиморфизма (25 аллелей на один локус и более), локусспецифичности и кодоминантного характера наследования [6].
Выделение ДНК осуществляли методом СТАВ [7]. Основные компоненты реакционной смеси объёмом 25 мкл: 40-50 нг ДНК, 0,1 цМ dNTPs, 25 mM KCl, 60 mM Tris-HCl (pH 8,5), 0,1% Тритон Х-100б 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1,5 mM MgCl2, 1 единица Taq-полимеразы и 0,3 цМ прай-меров. ДНК-амплификацию проводили на амплификаторе компании «Bio-Rad», программа ПЦР содержала 45 циклов: первичная денатурация при 95°С продолжительностью 15 мин - 1 цикл; денатурация при 94°С, 2 мин - 1 цикл; денатурация при 94°С, 1 мин, отжиг праймеров при 65°С, 30 с (каждые 2 цикла температуру понижали на1°С до достижения финальной температуры отжига 55°С), 72°С, 45 с - 20 циклов; денатурация при 94°С 1 мин, отжиг праймеров при 55°С 30 с, расширение при 72°С, 45 с - 20 циклов.
Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 8%-ном полиакриламидном геле при напряжении 250 V 2,5-3 ч. Их визуализацию проводили в ультрафиолетовом свете, предварительно пластину геля окрашивали 1%-ным раствором бромистого этидия [8,9].
- 49
Таблица 1. Праймеры для генотипирования Brassica oleracea L.
Название праймера Диапазон длин Мотив Геном- Количество
Последовательности праймеров ПЦР-фрагмен-тов, п. н. специфичность обнаруженных аллелей
Na10-D09 F-AAGAACGTCAAGATCCTCTGC R-ACCACCACGGTAGTAGAGCG 150-170 (GT)n ABC 6
Na12-A02 F-AGCCTTGTTGCIIIICAACG R-AGTGAATCGATGATCTCGCC 160-218 (CT)n ABC 16
Na12-F12 F-CGTTCTCACCTCCGATAAGC R-TCCGATGTAGAATCAGCAGC 170-190 (CCG)n ABC 8
Ni2-B02 F-CGCTGCAATTATACGAAAGC R-CCTCATGCTCTCCAAAGACC 80-110 (GGC)n ABC 14
Ra2-E12 F-TGTCAGTGTGTCCACTTCGC R-AGAGAAACCCAATAAAGTAGAACC 125-165 (GA)n АВС 10
Ni3-G04B F-ATACTCGGGATAGGTGTGCG R-CATGTGGCAATCCTACATTTAC 70-140 (AG)n ABC 15
0I12-A04 F-TGGGTAAGTAACTGTGGTGGC R-AGAGTTCGCATACTCTGGAGC 110-150 (CT)n ABC 8
BRMS-006 F-TGGTGGCTTGAGATTAGTTC R-ACTCGAAGCCTAATGAAAAG 140-175 (GA)n ABC 5
AF051772 F-TCCGAAAGTGGGGAAAGG 154-187 (aag)5 ABC —
R-TGTGTCAGAAAGCGAGAAGG
AF458409 F-AGAAAGCAGACGGGAATGG 133-168 (aga)6 ABC —
R-TGGTTAAAGCGAAAGTGTGC
AJ427337 F-GCTGATGTTGATGGTGATGG 187-212 (ga)5 ABC —
R-GCCGAAGCAGACAAATAAAAC
BZ523957 F-ATTATGACGCCTGTTTTA 231-272 (ttg)6 ABC —
R-TTGGTTAGAAGTTATGGGAAC
CC956628 F-GTCCCCTCTCTCTCCCATCC 201-218 (tc)5 АВС —
R-TGAGCCATTTCTTTATTTGTTCC
CC956699 F-TCTCACCTATCTTCTTCTCTTTCTTTC 158-198 (cac)9 ABC —
R-CGCCTCGTGCTTCTTTCTC
CC969431 F-AAGCCACCTCACCTTAGCC 237-272 (ga)6 ABC —
R-GAAATCCCAGAGACTGAAAACC
CC969459 F-CCAAAGATTCAGAGGAAATGG 190-205 (cgg)5 ABC —
R-GCGTCAAAAACGGTGTCG
CC969497 F-CAAATGACTACGGGAACAGGA 129-145 (tgc)5 ABC —
R-GGGTGGTGCTCAAGGATAAA
CC969507 F-AACTGAAACGACCAAGAAGTCC 298-301 (ct)5 ABC —
R-CCAGGAGGAGAGAGAGAGAGC
X94979 F-TCCAAGACCGTAGAGGAGGA 128-138 (atg)5 ABC —
R-AAGCCAACAAACTTCAACAACA
Идентификацию и определение размеров аллелей микросателлитных локусов осуществляли путём сравнения со стандартным образцом - маркером молекулярной массы pBR322/BsuRI(Хеликон, Россия) с использованием программы Gel-Pro Analyzer 3.1.
Результаты и обсуждение. В результате оценки уровня полиморфизма использованных в работе SSR-маркеров между родительскими формами капусты белокочанной установлено аллельное разнообразие анализируемых генотипов. Электрофореграмма (рис. 1) указывает на то,
что из исследуемого набора микросателлитных маркеров наибольший полиморфизм между родительскими формами, используемыми в селекционном процессе в отделе овощекартофелеводства ФГБНУ ВНИИ риса, существует по локусам Na12-F12 и Na12-A02.
Заметные отличия по отдельным аллелям между родительскими формами капусты белокочанной отмечены и по локусу Яа2-Е12 (рис. 2).
Мш
юм^
!"—1 NLVG04B |
Ra2-E12 | 0112-А04 MJG04B | BRMS-0W
SO»-'
113 4 5)2 3 4 S 12 3 4 5 1 2 3 Л Мш
■Nn!2A02 Nil2-F12 NS2BCI2 N310-DOP i
Iii 4SI 2345 Мш 1234 5 113 4
Рис. 1. Визуализация продуктов амплификации в SSR-локусах Na12-A02, Na12-F12, Ni2-B02, Na10-D09 улиний Brassica oleracea L.: дорожка №1 - линия капусты белокочанной Кт1; №2 - линия Бс1ф; №3 - Пи 714, №4 - линия Хн1ф 144-2; №5 - линия 270-488.
Рис. 2. Визуализация продуктов амплификации в локусах Ra2-E12, 0I12-A04, Ni3-G04B, BRMS-006 у линий Brassica oleracea L.: дорожка №1 - линия капусты белокочанной Кт1; №2 - линия Бс1ф; №3 - линия Пи 714; №4 - линия Хн1ф 144-2; №5 - линия 270-488
Кроме того, различия по отдельным аллелям между родительскими формами капусты белокочанной от_ Достижения науки и техники АПК. 2016. Т 30. № 8
Рис. 3. Визуализация продуктов амплификации: а) по маркерам Ni2-B02, SSR 8 - локус CC969459, SSR 9 - локус CC969497, SSR 10 - локус CC969507 у линий Brassica oleracea L. (1 - линия Тен 133-3; 2 - линия 272-510; 3 - линия 272-576; 4 - линия Бр129-10; 5 - линия 279-488); б) по SSR-маркерам 5 - локус CC956628; 6 - локус CC956699; 7 - локус CC969431; 11 - локус X94979 у линий Brassica oleracea L. (1 - линия Тен 133-3; 2 - линия 272-510; 3 - линия 272-576; 4 - линия Бр129-10; линия 279 - 488).
5SR N12B02 SSRS SSR 9
II 3 4 5 II 145 11 34
SSR
г з 4 s
— —
----- ---_
1 2 3 4 5 1 SSR tupMp 5 2 3 4 5 1 SSR маркер 6 2 J 4 5 SSR ьглркгр 7 12 3 4 5 SSR »tap»»!» 11
мечены по локусам Ni2B02, SSR 10, 6 и 7 (рис. 3). По всем остальным изученным SSR-маркерам отличий по ДНК-профилю между родительскими линиями Brassica oleracea L. не установлено.
Из 19 изученных микросателлитных маркеров высокую эффективность в выявлении внутривидового полиморфизма коллекционных образцов капусты белокочанной отдела овощеводства показали 3 наиболее информативных и локализованых на разных хромосомах SSR-маркера - Na12-A02, Na12-F12 и Ra2-E12, которые можно рекомендовать для использования в дальнейшей работе при оценки гибридности коммерческих партий семян гибридов F1 капусты белокочанной ПЦР-методом.
Всего обнаружено 28 аллельных состояний для 19 локусов в 5 образцах капусты белокочанной (в среднем по 3 аллеля на локус). Наибольшее число аллелей (6-8) для выбранного набора генотипов было детектировано для локусов Na12-A02, Na12-F12, локализованных на разных хромосомах ББЯ-маркера, наименьшее (1-2) для локусов Na10-D09, Яа2-Е12 и М3-004В.
Выводы. Определён набор наиболее информативных (полиморфных) ББЯ-локусов: Na12-A02, Na12-F12 и 1^2-Е12, который может быть использован для определения генетической чистоты (гибридности) гибридов F1 капусты белокочанной, созданных на основе линий из коллекции отдела овощеводства ВНИИ риса.
Литература.
1. Артемьева А.М., Клоке Э., Чесноков Ю.В. Анализ филогенетических связей вида Brassica oleracea L. (капуста огородная) //ВестникВОГиС. 2009. Т.13. № 4. С.759-771.
2. Louarn S., Torp A.M., Holme I.B. Database derivedmicrosatelline markers (SSRs) forcultivardifferentiation in Brassicca oleracea // Genet. Res. Crop Evol. 2007. V. 54. Pp. 1717-1725.
3. Morgante M., Oliveri A.M. PCR-amplified microsatellite markers in plant genetics//Plant J. 1993. V. 3. Pp. 175-182.
4. Thomas M.R., Scott N.S. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphism when analysed as sequence-tagged sites (STSs)// Theor. Appl. Genet. 1993. V.86. Pp. 985-990.
5. Database derived microsatellite markers (SSRs) for cultivar differentiation in Brassica oleracea/S. Louarn, A.M. Torp, I.B. Holme, S.B. Andersen, B.D. Jensen // Genet Resour Crop Evol. 2007. Vol. 54. Pp.1717-1725.
6. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов//Молекулярная клиническая диагностика. М.: Мир, 1999. С. 395-427.
7. Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA // Nucleic Acids Research. 1980. Vol. 10. Pp. 4321-4325.
8. Остерман Л.А. Методы исследования нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1981. 288 с.
9. Panaud O., Chen X., McCouch S. R. Frequency of microsatellite sequences in rice (Oryza sativa L.) // Genome. 1995. V. 38. Pp. 1170-1176.
DEVELOPMENT OF METHODOLOGY SCHEME FOR EVALUATING HYBRIDITY OF SEEDS F1 OF BRASSICA OLERACEA L., BASED ON POLYMORPHISM OF MICRO-SATELLITE DNA-MARKERS
E.V. Dubina, S.V. Koroleva, S.V. Garkusha, S.A. Yurchenko, L.V. Esaulova
All-Russian Rice Research Institute, pos. Belozerny, 3, Krasnodar, 350921, Russian Federation
Summary. The investigations were carried out on the base of laboratory of biotechnology and molecular biology of the All-Russia Research Institute of Rice Breeding under conditions of laboratory experiment in 2013-2016. The goal of the study was to develop a methodology system for evaluation of genetic purity of seeds F1 of Brassica oleracea L., based on polymorphism of microsatellite DNA-markers. Genotypes of headed cabbage used by the department of vegetables and potato breeding of the All-Russia Research Institute of Rice Breeding for creation of hybrids F1 were used as a material for the research. Nineteen co-dominant microsatellite (SSR) markers were included in the work. DNA extraction was performed by CTAB-method. From the test set of microsatellite markers the greatest polymorphism between the parental forms was foe loci Na12-F12 and Na12-A02. Noticeable differences in specific alleles were observed foe loci Ra2-E12, Ni2B02, SSR 10, 6 and 7. For all other studied SSR-markers the differences in the DNA-profile between the parental lines of Brassica oleracea L. were not found. For 19 loci in 5 samples of cabbage 28 allelic states were found (on average 3 alleles per a locus). The highest number of alleles (6-8) for a selected set of genotypes was detected for loci Na12-A02, Na12-F12, localized on different chromosomes of the SSR marker, the smallest (1-2) - for the loci Na10-D09, Ra2-E12 and Ni3-G04B. When testing 19 SSR markers three most informative and localized on different chromosomes SSR markers - Na12-A02, Na12-F12 and Ra2-E12 showed the highest efficiency in detecting interspecific polymorphism of collection samples of headed cabbage from the vegetable breeding department. They can be recommended for use in further work with PCR-method for evaluating hybridity of commercial seeds of hybrids F1 of headed cabbage. Key words: headed cabbage, F1 lines and hybrids, hybridity, SSR-markers, molecular marking, DNA-passports. Author Detalis: E.V. Dubina, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow (e-mail: [email protected]); S.V. Koroleva, Cand. Sc. (Agr.), head of division; S.V. Garkusha, D. Sc. (Agr.), director; S.A. Yurchenko, junior research fellow; L.V. Esaulova, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow. For citation: Dubina E.V., Koroleva S.V., Garkusha S.V., Yurchenko S.A., Esaulova L.V. Development of Methodology Scheme for Evaluating Hybridity of Seeds F1 of Brassica oleracea L., Based on Polymorphism of Micro-Satellite DNA-Markers. Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2016. Vol. 30. No. 8. Pp. 49-51 (in Russ.).
Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. № 8
51
