CC BY
19СОВРЕМЕННЫЙ ИНЖИНИРИНГ В ПРОИЗВОДСТВЕ САХАРА
www.nt-prom.ru
УДК 633.6. 3: 575.2
Молекулярные подходы к идентификации перспективных генотипов сахарной свёклы
Т.П. ФЕДУЛОВА, д-р биолог. наук Д.Н. ФЕДОРИН, канд. биолог. наук, А.А. НАЛБАНДЯН, канд. биолог. наук (e-mail: biotechnologiya@ mail.ru)
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова»
Введение
В мировой практике для изучения особенностей генома близкородственных форм, которыми являются сорта и линии культурных растений, используют методы молекулярного маркирования. Высокая комбинационная способность исходных линий часто связана со степенью их генетической дивергенции. Ранее отбор таких линий проводился с помощью анализа фенотипических признаков, в настоящее время — с помощью молекулярно-генетических маркеров полиморфизма различных участков ДНК [1]. Для оценки генетического разнообразия селекционного материала сахарной свёклы в последние годы широко используются SSR- и RAPD-маркеры, для которых характерна высокая информативность. Широко используемым методом исследования ДНК-гетерогенности селекционного материала является RAPD — метод полимеразной цепной реакции с использованием короткого случайного праймера [2, 3]. При выполнении данного вида анализа полиморфизм определяется как присутствие/отсутствие в электрофоретических спектрах специфических фрагментов ДНК и обусловлен различиями последовательностей ДНК в местах посадки праймеров [4]. Так, украинскими учёными [5] осуществлена дифференциация и идентификация различных генотипов сахарной свёклы (Beta vulgaris L.) с использованием RAPD- и SSR-анализа. Выявлены и проанализированы 14 аллелей по четырём RAPD-маркерам, установлена гетерогенность исследуемых материалов по частоте аллелей (0,22 0,67), что свидетельствует о возможности применения этих маркеров для гено-типирования сахарной свёклы и определения степени родства между ними. Наиболее перспективным подходом при получении высокопродуктивных гибридов различных культур является комплексное использование методов молекулярного анализа (RAPD + ISSR-генотипирование), основанных на анализе полиморфизма ДНК, которые позволяют сгруппировать изучаемый материал по степени генетического родства [6, 7]. Таким образом, разработка параме-
тров молекулярного отбора и ранжирования по гетерогенным группам коллекции исходного материала сахарной свёклы для подбора родительских пар при гибридизации является актуальным направлением исследований.
Цель исследований заключалась в установлении эффективных полиморфных ДНК-маркеров для идентификации исходных форм сахарной свёклы.
Материалы и методы исследований
В качестве материалов для исследований были использованы проростки мужскостерильных линий сахарной свёклы, линий сростноплодных опылителей и их гибридов, предоставленные доктором наук В.П. Ошевневым и кандидатом сельскохозяйственных наук Н.П. Грибановой. Выделение геномной ДНК из растительной ткани осуществлялось фенол-хлороформным методом [8, 9]. Качество экстрагированной суммарной ДНК оценивалось методом электорофоре-за в 1%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Полученная ДНК растворялась в 10 мМ трис-НС1-буфере, рН 8,0, содержащем 0,1 мМ ЭДТА и использовалась для ПЦР-анализа. Полимеразно-цепная реакция была проведена на амплификаторе «^епшеБ» (Великобритания). В работе использованы RAPD-праймеры ОРА-10, ОРС-06, ОРР-18 [10].
Результаты исследований и их обсуждение
С использованием метода RAPD-анализа изучен полиморфизм повторяющихся последовательностей ДНК исходных селекционных материалов сахарной и кормовой свёклы (МС-линий и многосемянных опылителей). Анализ результатов ПЦР геномной ДНК селекционных образцов свёклы с RAPD-праймером 0РА-10, представленных на электрофорезе в 1%-ном агарозном геле, показал их невысокий генетический полиморфизм (рис. 1).
В результате амплификации геномных ДНК растений установлено, что данный локус представлен только двумя аллелями (300 и 400 п.н.) в разной комбинации в образцах. Только генотипы МС 1Е и МС Ш имеют по
шт
www. nt-prom. ru
Рис. 1. Амплификация геномной ДНК образцов с праймером ОРА-10. М - маркеры молекулярных масс ДНК GeneRuler™ (Thermo Scientific, США)
Обозначения: МС1Е, МС1F (МС-формы иностранного происхождения);
1086 - RW (Rote Walze - кормовая белая свёкла);
1090 - РС3 х 6 х РФ у2; 1091 - РС3 х РФ у2; 1093 - РФ уг;
1108 - РС 3 х 8 х РФП 4 х тетраплоид; 1109 - РФП4;
1138- РС2 х 6 х ОП2-9; 1139 - МС 1E х ОП2-9;
1141 - МС 1Fх ОП2-9; 1142 - ОП2-9;
1154 - РС 9 х 6 х РФ 11207; 1155 - МС 1E х РФ 11207;
1156 - МС 1F х РФ 11207; 1234 - РС 3 х 8;
1251 - РС 3 х 6; 1264 - РС 3
одному ампликону с длинами 400 и 300 п.н. соответственно. Данные селекционные материалы, представленные мужскостерильными формами иностранного происхождения, по изучаемому локусу существенно отличаются от остальных отечественных номеров. Полиморфизм по локусу 0РА-10 находится в пределах 50—100 %. Анализ результатов ПЦР-образцов с праймером 0РС-06 свидетельствует о неоднородности выявленных ДНК-ампликонов со всеми используемыми для генетического анализа ДНК (рис. 2).
У изученных сортообразцов выявлено 3 ДНК-амликона с длинами 250, 300 и 400 п.н. Причём у ге-
нотипов зарубежной селекции (МС 1Е и МС Ш) выявлен всего 1 аллель (250 п.н.). Таким образом, данные селекционные материалы отличаются по генетической структуре от номеров селекции ВНИИСС. По результатам молекулярного анализа полиморфизм образцов сахарной свёклы по данному RAPD-локусу составляет от 33 до 66 %. Для селекционных материалов, проанализированных с помощью праймера ОРР-18, характерна однородность продуктов амплификации во всех исследуемых генотипах (рис. 3), выявлен единственный ДНК-ампликон длиной 300 п.н. Исключением является образец № 1109 (РФ П4), для которого не обнаружены ампликоны с данными праймерами. Данный номер является тетраплоидным фертильным опылителем и поэтому отличается от остальных селекционных материалов по своей генетической организации.
Рис. 2. Амплификация геномной ДНК образцов с праймером ОРС-06. М — маркеры молекулярных масс ДНК GeneRuler™ (Thermo Scientific, США)
Рис. 3. Амплификация геномной ДНК образцов с праймером ОРР-18
Выявленный полиморфизм по RAPD-локусу составляет 100 %. Математическая обработка матрицы ДНК-профилей позволила сгруппировать селекционные материалы по степени их генетического родства и определить попарные генетические дистанции всех возможных комбинаций скрещиваний изученных родительских форм, на основе которых была построена дендрограмма (рис. 4).
Генетические дистанции DN (евклидовы) между исследованными генотипами, рассчитанные по данным RAPD-анализа, варьировали от 0 до до 2,24. Максимальные генетические расстояния (DN = 2,24) выявлены для образцов № 1 (МС 1Е,) и № 8 (РС 3), № 2 (МС Ш) и № 8, что подтверждается реальным происхождением данных материалов. Растения № 1 и 2 представляют собой мужскостерильные формы иностранного происхождения, а растения № 8 являются МС-формой селекции ВНИИСС. Достаточно высокие значения DN = 2, 0 отмечены для генотипов № 6 и 8, 8 и 9, 10 и 11, 8 и 13, 8 и 14. Также высокие генетические дистанции (DN = 1, 73) отмечены для образцов № 3 и 8, 4 и 8, 5 и 8, 7 и 8. Растения селекционного
52 САХАР № 6 • 2019
СОВРЕМЕННЫЙ ИНЖИНИРИНГ В ПРОИЗВОДСТВЕ САХАРА
www.nt-prom.ru
С-1 С-6 С-9 С-10 С-11 С-13 С-14 С-2 С-3 С-4 С-5 С-7 С-1 2 С-15 С-16 С-17 С-8
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
Рис. 4. Дендрограмма генетических дистанций генотипов сахарной свёклы по RAPD-локусам Обозначения образцов: 1 - МС 1Е, 2 - МС Щ 3 - 1086, 4 - 1090, 5 - 1091, 6 - 1093, 7 - 1108, 8 - 1109, 9 - 1138, 10 - 1139, 11 - 1141, 12 - 1142, 13 - 1154, 14 - 1155, 15 - 1156, 16 - 1234, 17 - 1251, 18 - 1264
№ 8 с большинством исследованных генотипов по использованным RAPD-локусам показали значительные генетические расстояния, что свидетельствует о глубоком генетическом отличии их от растений других линий. Результаты кластеризации селекционных материалов сахарной свёклы позволили сгруппировать исследованные линии в три кластера. Селекционные образцы с максимальными генетическими расстояниями рекомендованы для скрещиваний.
Заключение
Таким образом, по результатам проведённого ПЦР-анализа с RAPD-праймерами OPA-10, OPC-10, OPP-118 составлены матрицы генетических профилей исходных линий сахарной свёклы и выявлены специфические ДНК-профили для индивидуальных генотипов; установлена степень полиморфизма локу-сов ДНК, выявляемых данными праймерами. На основе полученных данных создана маркерная система идентификации исходного материала сахарной свёклы (молекулярно-генетические формулы) для использования в селекционном процессе.
Список литературы
1. Improved Heterosis Prediction by Combining Information on DNA- and Metabolic Markers / Т. Gärtner [and oth.] // PLoS One. - 2009. - № 4 (4).
2. Сиволап, Ю. Генетический полиморфизм злаковых растений при помощи ПЦР с произвольными праймерами / Ю. Сиволап, Р. Календарь, С. Чеботарь // Цитология и генетика. - 1994. - Т. 28. - № 6. - С. 54-61.
3. Martin, C. The use of RAPD markers to facilitate the identification of Oryza species within a germplasm collection / C. Martin [and oth.] // Genetic Resources and Crop Evolution. - 1997. - V. 44. - P. 175-183.
4. Гостимский, С. А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров / С.А. Гостимский, З.Г. Кокаева, Ф.А. Коновалов // Генетика. - 2005. - Т. 41. - № 4. - С. 480-492.
5. Кляченко, О. Изучение аллельного состояния микро-сателлитных локусов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) / О. Кляченко, Л. Присяжнюк // Эл. период. изд. ЮФУ «Живые и биокосные системы». - 2014. - № 8.
6. Азарин, К. Оценка комбинационной способности линий подсолнечника и подбор SSR-маркеров, ассоциированных с эффектом гетерозиса / К. Азарин // Сб. матер. 6-й Междунар. конф. «Инновационные направления исследований в селекции и технологии возделывания масличных культур». 24-25 февраля 2011 г., Краснодар. - С. 5-9.
7. Hong, Sh. Analysis of impregnating ion into high-sugar mutant sugar beet by quantitative trait loci (QTLs) / Wang Yan Fei, Gao WenWei, Qu YanYing, Zhang Li Ming // Sugar Crops of China. - 2010. - No. 3. - P. 27-28.
8. Chomczynski, P. Single-Step Metod of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. -1987. - V. 162. - P. 156-159.
9. Rogers, S. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues / S. Rogers, A. Bendich // Plant Molecular Biologi. - 1985. - V. 5. -P. 67-69.
10. Ghasemi, A.R. Analysis of genetic diversity of sugar beet genotypes using random amplified polymorphic DNA marker / A.R. Ghasemi, A.R. Golparvar, M.N. Isfahani // Genetika. - 2014. - Vol. 46. - No. 3. - P. 975-984.
Аннотация. В статье представлены результаты молекулярной оценки исходных родительских форм сахарной свёклы (мужскостерильных линий, линий многосемянных опылителей) и гибридов с их участием по трём произвольным RAPD-праймерам. Выявлены наиболее полиморфные RAPD-праймеры и разработаны методические подходы к идентификации селекционных материалов сахарной свёклы и подбора родительских компонентов для скрещиваний, основанные на присутствии/отсутствии фрагментов ДНК с учётом евклидовых расстояний. Ключевые слова: сахарная свёкла, ПЦР-анализ, PARD-праймеры, молекулярная идентификация, генотип. Summary. In the article, the results of molecular evaluation of sugar beet initial parent forms (male-sterile lines, multigerm pollinator lines) and hybrids produced with their participation using 3 random RAPD-primers are presented. The most polymorphic RAPD-primers have been revealed, and methodical approaches to identification of sugar beet breeding materials selection of parent components for crosses based on presence absence of DNA fragments with regard to Euclidean distances have been developed.
Keywords: sugar beet, PCR-analysis, RAPD-primers, molecular identification, genotype.
