CC BY
71
Раздел
УДК 579.66
02.00.10 Биоорганическая химия
DOI: 10.17122/bcj-2019-1-96-99
Л. Я. Василова (к.т.н., доц.), Л. И. Каримова (магистрант), А. Г. Борисенков (магистрант)
СКРИНИНГ МИКРООРГАНИЗМОВ - ПРОДУЦЕНТОВ
КСИЛАНАЗ
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347)2431935, e-mail: [email protected]
L. Ya. Vasilova, L. I. Karimova, A. G. Borisenkov
SCREENING OF MICROORGANISMS - PRODUCERS
OF XILANASE
Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str., 450062, Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
С целью поиска перспективных продуцентов ксиланолитических ферментов был проведен скрининг бактерий из музея кафедры БТМП УГНТУ, обладающих амилолитической активностью. Обнаружено, что при культивировании микроорганизмов на агаризованной среде, содержащей 0.5% ксилана, все исследуемые штаммы синтезировали внеклеточные ксиланазы. В результате исследований отобраны четыре штамма бактерий с высоким уровнем ферментативной активности. Наибольшая ксиланазная активность, составляющая 4.00 МЕ, обнаружена у штамма А13.1.
Ключевые слова: ксилан; ксиланаза; ксилоза; микроорганизмы; скрининг; ферментативная активность.
Ксилан является компонентом гемицел-люлозы — основного структурного и второго по распространенности полисахарида в растительных клетках. Он представляет собой гетерогенный полисахарид, состоящий в основном из цепей /-О-ксилопиранозных остатков, соединенных 1,4-гликозидными связями. Заместителями являются О-ацетильные, а-Ь-араби-нофуранозильные и 4-О-метилглюкуронозиль-ные остатки .
Полный гидролиз ксилана осуществляется комплексом ферментов, включающим эндо-1,4-/-Э-ксиланазу (КФ 3.2.1.8), /-О-ксилози-дазу (КФ 3.2.1.37), а-Ь-арабинофуранозидазу (КФ 3.2.1.55), а-О-глюкуронидазу (КФ 3.2.1.139) и ацетилксиланэстеразу (КФ 3.1.1.72) 2 (рис. 1). Основными ферментами, используемыми для деструкции ксилана, являются эндо-1,4-/-ксиланаза, которая гидролизу-
Дата поступления 28.09.18
Bacterial screening was carried out in order to search for promising producers of xylanolitic ferments. These bacteria possessing amylolytic activity, were taken from the museum of the Department BTMP USPTU. It was found that all studied strains, cultivated on agar medium containing 0.5% of xylan, synthetized extracellular xylanases. As a result of the screening, four strains of bacteria with a high level of enzymatic activity were selected. The highest xylanase activity (4.00 IU) was found for strain A13.1.
Key words: fermentation activity; microorganisms; screening; xylan; xylanase; xylose.
ет /-1,4-гликозидные связи в молекуле ксила-на с образованием олигосахаридов различной длины цепи, и /-ксилозидаза, расщепляющая ксилан и его олигомерные производные до ксилозы, действуя на концевые остатки с нере-дуцирующего конца макромолекулы .
В настоящее время ксиланазы находят широкое применение в таких промышленных процессах, как повышение усвояемости кормов для сельскохозяйственных животных и птиц, биоотбеливание целлюлозы, в текстильной промышленности, при очистке сточных вод, для улучшения текстуры хлебобулочных изделий, осветления соков и вина, при биоконверсии лигноцеллюлозных отходов в различные химические соединения и топлива (ксилит, фурфурол, этанол, бутанол, метан, ацетон и др.), а также в кормовой микробиологический белок (протеины) Также сообщается, что ксилоолигосахариды, образующиеся при гидролизе ксилана, ингибируют рост саркомы-
А
a-4-О-метилглюкуроновая кислота HOOC
эндо-1,4- ß-D-ксиланаза
]
a-D-глюкуронидаза
OH O OH OAc
h^^^-^^^^o OH^^^^^^O m^^i-j^O-
HOH2C OH
a-арабинофураноза
HOH2C
OH a-L-арабинофуранозидаза
a-арабинофураноза
OH O
OH
ß-D-ксилоза
ß-D-
ксилозидаза
Рис. 1. А — ксиланолитические ферменты, вовлеченные в деградацию ксилана; Б — гидролиз ксилоолиго-сахаридов ^-ö-ксилозидазой.
180 и других опухолей путем косвенного стимулирования неспецифической иммунологической защиты хозяина и обладают противовоспалительной активностью 5.
Ксилан-деградирующие ферменты продуцируются широким рядом микроорганизмов, включающим бактерии (Bacillus, Clostridium, Cellulomo-nas, Micrococcus, Streptomyces), грибы (Tricho-derma, Aspergillus, Pénicillium, Fusarium, Chaeto-mium, Alternaria, Thermomyces, Geotrichum) и дрожжи (Cryptococcus, Trichosporon) 6' 7.
В настоящее время основными продуцентами промышленных препаратов ксиланаз являются мицеллиальные грибы родов Trichoderma и Aspergillus 6. Однако ксилана-зы, продуцируемые бактериями, обладают рядом преимуществ: они являются не экзофер-ментами, как грибные, а эндоферментами; способны работать в широком диапазоне рН (5— 9); обладают высокой термостабильностью; менее чувствительны к ингибиторам ксилана-зы 6-8. Эти качества делают бактериальные ксиланазы более перспективным продуктом биотехнологической промышленности по сравнению с грибными ксиланазами.
Цель данной работы — поиск бактериальных микроорганизмов, способных продуцировать внеклеточные ксиланазы.
Материалы и методы исследования
Выделение ксилана.
Выделение ксилана проводили из древесины березы согласно методике 9. После удале-
ния коры древесина была измельчена в тонкую стружку менее 0.1 мм толщиной. Перед извлечением ксилана древесные стружки освобождали от жиро-восковых веществ. Для этого 12.5 г стружек кипятили в 500 мл воды в течение 1 часа. Воду сливали и к стружкам добавляли этиловый спирт, разведенный водой в объемной пропорции 1:1. Затем смесь кипятили в течение часа под обратным холодильником, после чего стружки промывали водой и сушили до воздушно-сухого состояния.
Обработанные стружки экстрагировали 4%-ным раствором КаОИ при постоянном перемешивании в течение 6 ч, затем щелочной экстракт декантировали и нейтрализовали ледяной уксусной кислотой до выпадения осадка. Для ускорения формирования осадка и вымывания попутно извлекаемого небольшого количества адсорбированного лигнина в емкость с осадком ксилана добавляли 96%-ный этиловый спирт в объемном соотношении 1:1. После отделения фазы осадка ксилана путем отстаивания в течение суток водно-спиртовой экстракт лигнина декантировали, а к осадку ксилана вновь добавляли этанол. Эту операцию повторяли несколько раз до исчезновения желтого окрашивания спиртового экстракта. Затем влажный осадок ксилана тонко распределяли по поверхности и высушивали при комнатной температуре на воздухе. Высушенный продукт, представляющий собой хрупкую, легко дробящуюся прозрачную пленку, растирали в ступке. Готовый продукт — светло-кремовый порошок ксилана.
Б
Выделенный ксилан был идентифицирован методом ИК-спектроскопии. ИК-спектры регистрировали на инфракрасном спектрофотометре «Ш Pгestige-21 БЫшаёги». ИК спектр, V, см-1: 3307 (О-Н), 1736 (С=О), 1465 (СН2), 1377 (СН3), 1271 (С-Н), 1251 (С-О-С), 1045 (С-О), 985 (СН3-С-О).
Полученный порошок ксилана использовали в качестве единственного источника углерода и энергии при выращивании микроорганизмов и для приготовления субстрата при определении ксиланазной активности.
Культивирование микроорганизмов.
Микроорганизмы выращивали на агаризован-ной среде следующего состава (г/л): ксилан - 5.0; КН2РО4 - 0.5; MgS04•7Н20 - 0.2; СаС12-2Н2О -0.1; пептон - 5.0; дрожжевой автолизат - 5.0; агар-агар микробиологический - 15.0.
Питательную среду стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 оС под давлением 1.1 кгс/см2. Выращивание микроорганизмов осуществляли на чашках Петри при температуре 37 оС в течение 48 ч.
Экстракция фермента.
200 мг биомассы суспендировали в 1 мл цитратного буфера (рН 5.3) и экстрагировали внеклеточные ферменты на возвратно-поступательном шейкере в течение 30 мин. Далее биомассу отделяли центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об./мин. Полученные супернатанты использовали в качестве неочищенных ферментных растворов при определении ксиланазной активности.
Приготовление раствора ксилана.
В качестве субстрата был использован 1%-ный раствор ксилана в 0.05М цитратном буфере, рН 5.3. 1 г ксилана гомогенизировали в 80 мл буферного раствора при 60 оС, растворяли в течение 1 ч при постоянном перемешивании на кипящей водяной бане. Полученный раствор охлаждали до комнатной температуры и доводили объем до 100 мл тем же буферным раствором 10.
Определение ксиланазной активности.
Активность определяли согласно методике, изложенной в 11. Ксиланазную активность измеряли по начальной скорости образования восстанавливающих сахаров: 0.1 мл ферментного раствора инкубировали с 0.9 мл 1%-ного раствора ксилана в течение 5 мин при 50 оС и рН 5.3 (табл.).
Содержание восстанавливающих сахаров определяли 3,5-динитросалициловым методом 12. К реакционной смеси добавляли 1,5 мл реактива 3,5-динитросалициловой кислоты и кипятили при 100 оС в течение 15 мин. Далее реакционную смесь охлаждали и измеряли поглоще-
ние при 540 нм на фотоколориметре КФК-2. Количество образовавшегося продукта (ксилозы) определяли по калибровочной кривой.
Ксиланазную активность фермента выражали в международных единицах: одна единица соответствует количеству фермента, которое вызывает образование 1 мкмоль восстанавливающих сахаров (в пересчете на ксилозу) в минуту из раствора ксилана при 50 оС и рН 5.3.
Результаты и обсуждение
В качестве объектов исследования были использованы бактериальные культуры микроорганизмов из музея кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ, обладающие амилолитической активностью, поскольку из литературных данных известно, что многие бактериальные продуценты амилаз синтезируют и другие внеклеточные гидролитические ферменты, в том числе целлю-
13
лазу, ксиланазу, пектиназу, хитиназу и др. .
Ксиланазы являются индуцибельными ферментами 14, поэтому для их биосинтеза культивирование микроорганизмов проводили на агаризованной среде, содержащей ксилан березы. Экстракты биомассы использовали в качестве неочищенных ферментных растворов при определении ксиланазной активности.
Всего было исследовано 76 штаммов. Обнаружено, что при культивировании микроорганизмов на агаризованной среде, содержащей 0.5% ксила-на, все исследуемые штаммы синтезировали внеклеточные ксиланазы. Большая часть микроорганизмов, 70% от общего числа, проявляли среднюю ксиланазную активность в диапазоне 1-3 МЕ. Ксиланазную активность более 3.00 МЕ показали лишь 9% исследуемых объектов (рис. 2).
0-1 1-2
Активность фйрмента, МЕ
Рис. 2. Распределение исследуемых штаммов по ксиланолитической активности
Ксиланазная активность ферментных препаратов наиболее активных штаммов (А2.3, А2.4, А9.3 и А13.1) представлена в табл.
Таблица
Ксиланазная активность ферментных
препаратов штаммов А2.3, А2.4, А9.3 и А13.1
№ Штамм Ксиланазная активность, МЕ
1 А2.3 3.33
2 А2.4 3.60
3 А9.3 3.27
4 А13.1 4.00
Литература
1. Poutanen K., Ratto M., Puis J, Viikari L. Evaluation of different microbial xylanolytic systems // Journal of Biotechnology.— 1987.— V.6.- Pp.49-60.
2. Biely P. Biochemical aspects of the production of microbial hemicellulases.- London: Portland Press, 1993.- Pp.127-143.
3. Ammoneh H., Harba M., Akeed Y., Al-Halabi M., Bakri Y. Isolation and identification of local Bacillus isolates for xylanase biosynthesis // Iranian Journal of microbiology.- 2014.- V.6, №2.- Pp.127-132.
4. Kalim B., Bohringer N., Ali N., Schaberle T. Xylanases from Microbial Origin to Industrial Application // British Biotechnology Journal.-2015.- V.7, №1.- Pp.1-20.
5. Ebringerova A., Hromadkova Z. Xylans of industrial and biomedical importance // Biotechnology and Genetic Engineering Reviews.- 1999.- V.16, №1.- Pp.325-346.
6. Collins T., Gerday C., Feller G. Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases // FEMS Microbiology Reviews.- 2005.- №29.- Pp.3-23.
7. Burlacu A., Cornea C., Israel-Roming F. Microbial xylanase: a review // Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies.- 2016.- V. XX.- Pp.335-342.
8. Бактериальная ксиланаза эффективнее // Свиноводство.- 2012.- № 7.- С. 42-43.
9. Торгошов В. И., Соловьева Л. В., Зубец О. В., Капуцкий Ф. Н. Получение ксилана фармацевтического качества из древесины березы // Вестник Брянского гос. ун-та.- 2014.- С.21-26.
10. Полыгалина Г.В. и др.Определение активности ферментов.-М.: ДеЛи принт, 2003.- 375 с.
11. Bailey M., Biely P., Poutanen K. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity // Journal of Biotechnology.- 1992.- V.23.-Pp. 257-270.
12. Miller G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar // Analytical Chemistry.- 1959.- V.31, №3.- Pp.426-428.
13. Kiran T., Asad W., Siddiqui S., Ajaz M., Rasool S. Industrially important hydrolytic enzyme diversity explored in stove ash bacterial isolates / / Pakistan journal of pharmaceutical sciences.-2015.- V.28, №6.- Pp.2035-2040.
14. Salmon D., Spier M., Soccol C., Vandenberghe L., Weingartner V., Montibeller, Bier M., Faraco V. Analysis of inducers of xylanase and cellulose activities production by Ganoderma applanatum LPB MR-56 // British Micological Society.-2014.- V.30.- Pp.1-8.
Наибольшая ксиланазная активность, обнаруженная у штамма А13.1, составила 4.00 МЕ. Таким образом, штамм А13.1 является перспективным продуцентом препаратов внеклеточных ксиланаз.
References
1. Poutanen K., Ratto M., Puis J, Viikari L. [Evaluation of different microbial xylanolytic systems]. Journal of Biotechnology, 1987, vol.6, pp.49-60.
2. Biely P. [Biochemical aspects of the production of microbial hemicellulases]. London, Portland Press, 1993, pp.127-143.
3. Ammoneh H., Harba M., Akeed Y., Al-Halabi M., Bakri Y. [Isolation and identification of local Bacillus isolates for xylanase biosynthesis]. Iranian Journal of microbiology, 2014, vol.6, no.2, pp.127-132.
4. Kalim B., Bohringer N., Ali N., Schaberle T. [Xylanases from Microbial Origin to Industrial Application]. British Biotechnology Journal, 2015, vol.7, no. 1, pp.1-20.
5. Ebringerova A., Hromadkova Z. [Xylans of industrial and biomedical importance]. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 1999, vol.16, no. 1, pp.325-346.
6. Collins T., Gerday C., Feller G. [Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases]. FEMS Microbiology Reviews, 2005, vol.29, pp.3-23.
7. Burlacu A., Cornea C., Israel-Roming F. [Microbial xylanase: a review]. Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, 2016, vol.XX, pp.335-342.
8. Bakterialnaya ksilanaza effektivnee [Bacterial xylanase more efficiently]. Svinovodstvo [Pig production], 2012, no.7, pp.42-43.
9. Torgoshov V., Solovieva L., Zubets O., Kaputskiy F. Polucheniye ksilana farmatsevti-cheskogo kachestva iz drevesiny berezy [Pharmaceutical xylan production from birch wood]. Vestnik Bryanskogo gos. universiteta [Bulletin of Bryansk State University], 2014, pp.21-26.
10. Polygalina G.V. i dr. Opredeleniye aktivnosti fermentov [Determination of enzyme activity]. Moscow, DeLi print Publ., 2003, 375 p.
11. Bailey M., Biely P., Poutanen K. [Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity]. Journal of Biotechnology, 1992, vol.23, pp.257-270.
12. Miller G.L. [Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing suga]. Analytical Chemistry, 1959, vol.31, no.3, pp.426-428.
13. Kiran T., Asad W., Siddiqui S., Ajaz M., Rasool S. [Industrially important hydrolytic enzyme diversity explored in stove ash bacterial isolates]. Pakistan journal of pharmaceutical sciences, 2015, vol.28, no.6, pp.2035-2040.
14. Salmon D., Spier M., Soccol C., Vandenberghe L., Weingartner V., Montibeller, Bier M., Faraco V. [Analysis of inducers of xylanase and cellulose activities production by Ganoderma applanatum LPB MR-56]. British Micological Society, 2014, vol.30, pp.1-8.
