CC BY
83
Е. В. Скворцов, Ф. Г. Каримова, Ф. К. Алмова,
А Энтор Фуентос Кабрера
ВЛИЯНИЕ ЦАМФ НА БИОСИНТЕЗ КСИЛАНАЗ БАКТЕРИЯМИ И ГРИБАМИ
Проведены исследования, показавшие, что при добавке в среду культивирования бактерий Bacillus circulans цАМФ, эуфилин и кофеин пролонгируют процесс активного синтеза ксиланаз. Исследована кинетика процесса. При добавке цАМФ в культуральную среду грибов Trichoderma снижалась ксиланазная активность. B.circulans показал возрастание активности синтеза ксиланаз при концентрации эуфиллина в среде более 0.1 mM/l и кофеина более 1 mM/l. Накопление ксиланаз в культуральной среде возрастало на 22-32%.
Исходные данные и цель работы
В настоящее время основным биотехнологическим источником ксиланаз, ферментов гидролизующих пентозаны, являются грибы [1-10]. Промышленные препараты ксиланаз грибного происхождения получают из селектированных штаммов родов Trichoderma и Aspergillus [11]. Бактерии также являются продуцентами ксиланаз [12-23]. Необходимо отметить, что биосинтез ксиланаз бактериальными штаммами происходит заметно быстрее (1-2 суток), нежели грибными культурами (3-5 суток) ферментации. Бактериальные ксиланазы имеют в основном рН оптимум около 6 в отличие от грибных рН 4.5-5.0.
Ксиланазы используются в технологии производства спирта, для гидролиза ржи. Применение ксиланаз при гидролизе вызвано составом углеводной фракции ржи. Рожь богата крахмалом, а также содержит достаточно крупную, в сравнении с пшеницей фракцию пентозанов [15]. Эндосперм, который составляет 82.5% всего зерна, окружен плодовой и семенной оболочками, состоящими из некрахмалистых полисахаридов: целлюлозы, гемицеллюлозы, пентозанов, Р-глюканов [24]. Часть пентозанов, около 2% воздушно - сухого вещества (ВСВ) ржаного зерна растворимы в воде. Растворимые пентозаны ржи, переходящие при проведении гидролиза в раствор, значительно увеличивают вязкость затора и замедляют действие амилолитических ферментов, обычно применяющихся при гидролизе. В настоящее время в спиртовой промышленности отработана технология ферментативного гидролиза углеводной фракции ржи. Эта технология предусматривает гидролиз ксила-назами, разрушающим пентозаны, растворение крахмала ржи с применением разжижающего фермента амилосубтилина, и гидролиз его раствора глюкоавоморином. С помощью гидролиза получают растворы сахаров, подлежащие дальнейшему сбраживанию. На биосинтез ферментов оказывают влияние не только состав среды культивирования, но также и внутриклеточные сигнальные системы, управляющие процессами экспрессии генома. Большое влияние на синтез карбогидраз оказывает аденилат-циклазная сигнальная система. Компонентами этой системы являются циклическая АМФ (цАМФ), цАМФ- зависимые протеин киназы, белки индукторы и репрессоры транскрипции [25].
Целью проведенной нами работы являлось исследование влияния добавок цАМФ, ингибиторов фосфодиэстеразы эуфилина и кофеина на биосинтез ксиланаз бактериями Bacillus circulans и грибами Trichoderma, а также определение эффективных концентраций
эуфилина и кофеина, активизирующих синтез ферментов продуцентом.
Результаты и обсуждение
Нами проведены эксперименты по культивированию бактерий B. drculans и грибов Trichoderma на ржаных экстрактах с добавками экзогенного цАМФ. В исходную питательную среду стерильно добавляли раствор цАМФ в количествах, обеспечивавших концентрацию в среде 2.5, 25, 125 нМ/л. Результаты проведенного эксперимента приведены на рисунках 1,2.
Время, ч
Рис. 1 - Динамика активности ксиланаз при культивировании бактерий В. еігеиіат с добавками экзогенного цАМФ в среду
Рис. 2 - Динамика активности ксиланаз при культивировании гриба Trichoderma с добавками экзогенного цАМФ в среду
Культивирование гриба с добавками цАМФ продолжалось в течение 96 ч. Культи-
вирование бактерий проводили 48 ч. Сравнительные результаты приведены в таблице 1. Полученные результаты показали различное влияние экзогенного цАМФ на биосинтез ксиланаз бактериями и грибами. Активность фермента и рост бактерий возрастали при добавках цАМФ, тогда как грибы снижали рост и активность ксиланаз. Исходя из этих результатов было принято решение провести исследования влияния ингибиторов фосфодиэ-стеразы цАМФ на биосинтез ксиланаз бактериями B. circulans.
Таблица 1 - Изменение ксиланазной активности при добавках экзогенного цАМФ при культивировании бактерий B.circulans и грибов Trichoderma*
Содержание цАМФ Trichoderma B.circulans
Ксиланазная активность, IU/ml Биомасса, мг/мл Ксиланазная активность, IU/ml Биомасса, мг/мл
Контроль 7.70+0.3 2.09+0.3 2.53+0.1 0.71+0.02
2.5 nM/l 7.75+0.3 2.19+0.3 3.02+0.2 0.73+0.01
25 nM/l 1.1 ±0. 2 0.25+0.1 3.65+0.3 0.82+0.02
0.125 microM/l 0.7+0.1 0.15±0.1 3.92+0.2 0.95+0.02
*(n=3) (a<0.05)
Культивирование бактерий в глубинной культуре для биосинтеза ксиланаз проведено на средах, содержавших пентозаны. В культуральные среды добавляли ингибиторы фосфодиэстеразы (ФДЭ) цАМФ эуфилин и кофеин, в виде препарата кофеин бензоат натрия. Ингибиторы ФДЭ цАМФ подавляют гидролиз цАМФ фосфодиэстеразой, вызывая повышение уравня цАМФ в клетках, т.е. добавление ингибиторов ФДЭ цАМФ имитирует эффект экзогенного цАМФ. Очищенные препараты культуральных жидкостей исследовались на ксиланазную активность. Результаты экспериментов показали повышение ксила-назной активности в культуральной среде бактерий B.circulans при добавках эуфилина и кофеина. (табл. 2, 3). B.circulans показал возрастание ксиланазной активности при концентрации эуфиллина в среде более 0.1 mM/l и кофеина более 1 mM/l. Отмечено повышение ксиланазной активности в культуральной среде на 22-32%. Причем дальнейшее увеличение добавок сверх указанных выше концентраций не приводило к значительному дальнейшему увеличению ферментативной активности.
Нами проведены исследования динамики ксиланазной активности при добавках эу-филина и кофеина в среду культивирования B.circulans (рис. 3, 4). Культивирование бактерий проводили в течение 48 часов. Добавки препаратов производили в количествах, необходимых для обеспечения соответствующей концентрации в среде культивирования через 20 ч после засева исходной среды инокулятом.
Применяя препараты, ингибирующие фосфодиэстеразу, удалось добиться повышения активности фермента в течение 40 часов культивирования, тогда как рост ксиланазной активности культуральных жидкостей контрольных культур замедлялся через 20 часов. Сразу после добавки препаратов наблюдалось снижение ферментативной активности, вероятно вызванное перестройкой внутриклеточных биосинтетических процессов бактерий B.circulans (рис. 3,4).
Таблица 2 - Влияние добавок эуфилина на биомассу и ксиланазную активность
B.circulans*
Добавка эуфилина, mM/l Накопление биомассы, OD590 Активность ксиланаз, IU/ml
0 0.75+0.02 2.81+0.04
0.01 0.73+0.01 2.78+0.02
0.1 0.82+0.02 3.67+0.02
1 0.85+0.02 3.69+0.04
5 0.80+0.01 3.69+0.03
10 0.90+0.02 3.72+0.03
*(n=3) (a<0.05)
Таблица 3 - Влияние добавок препарата кофеина на биомассу и ксиланазную активность B.circulans*
Добавка кофеина, mM/l Накопление биомассы, 0D590 Активность ксиланаз, IU/ml
0 0.75+0.02 2.81+0.04
0.01 0.73+0.01 2.80+0.03
0.1 0.74+0.02 2.75+0.02
1 0.85+0.02 3.42+0.04
5 0.80+0.01 3.65+0.03
10 0.90+0.02 3.61+0.03
*(n=3) (a<0.05)
Рис. З - Исследование кинетики ксиланазной активности B.circulans при добавке эу-филина в 20 ч культивирования
Рис. 4 - Исследование кинетики ксиланазной активности B.circulans при добавке кофеина в 20 ч культивирования
Экспериментальная часть
Исследования проводились на базе кафедры микробиологии КГУ и центра аналитических исследований ТатНИИСХ.
Определение ксиланазной активности ферментных препаратов [26]
Определение проводили следующим образом: 0.2-5.0 г образца (1000-10000 IU) взвешивали в 100 мл колбу и растворяли с перемешиванием в 100 мл ацетатного буфера. Далее образцы разбавляли до конечной концентрации (в D раз) приблизительно до концентрации 0.2-0.7 IU/мл для ксиланаз, 0.15-0.25 IU/мл для целлюлаз. Исследование проводили в трех повторностях. Разбавленный образец в количестве 0.06 мл помещали в пробирку. Пробирку помещали на 5 мин в 40°С на водяную баню. Добавляли 0.6 мл субстрата и перемешивали. Через 20 мин инкубация прерывалась добавлением 0.3 мл раствора динитросалициловой кислоты (DNSA).
Субстрат для исследования активности ксиланаз готовили следующим образом :750 мг кси-лана (Sigma X0502) помещали в 40 мл ацетатного буфера. Растворяли ксилан перемешиванием на кипящей водяной бане в течение 5 мин. После охлаждения до комнатной температуры рН раствора доводили 25% HCl до 5.0. Обьем раствора доводили до 50 мл ацетатным буфером. Для построения калибровочного графика стандарты ксилозы помещали в 0.06 мл ацетатного буфера в пробирку. Образцы не инкубировали при 40°С, а сразу добавляли DNSA.
После окончания описанной процедуры для образцов и стандартов растворы в пробирках центрифугировали, отделяли надосадочную жидкость. Полученный раствор инкубировали точно 10 минут в кипящей водяной бане, затем охлаждали в ледяной бане 5 минут, добавляли 3 мл воды и перемешивали. Абсорбцию измеряли при 530 нм, используя двухлучевой спектрофотометр Lambda 35 Perkin Elmer Ins. Одна единица активности энзима (IU) соответствует количеству фермента, вызывающего выход одного мкмоля восстанавливающих сахаров в минуту при гидролизе соответствующего субстрата. Выход восстанавливающих сахаров определяли по калибровочным графикам, построенным по ксилозе. Для расчета применяли следующую формулу: IU= (PB1-PB0)xD/20xH, где IU- активность фермента в международных единицах, РВ1 и РВ0- редуцирующие вещества после и до ферментолиза соответственно; D- разбавление фермента перед внесением в реакционную смесь; Н- дозировка препарата мл; 20 - время ферментолиза, мин.
Культивирование бактерий B. circulans для получения инокулята
Штаммы бацилл засевали «штрихом» на поверхность скошенного в пробирках L-агара. Посевы выращивали при t=37°C в течение 24-48 ч. По истечении указанного срока с поверхности колоний водой смывали бактериальные споры. Полученную суспензию спор высевали в L - бульон и
культивировали при 1=37°С в течение ночи. Культуральную жидкость в дальнейшем разводили таким образом, чтобы ее оптическая плотность составляла 0.25±0.05 единиц при А=590 нм и использовали в качестве инокулята для засева глубинных культур.
Культивирование бактерий в глубинной культуре для биосинтеза ксиланаз
Культуральные среды засеивали 2% инокулята. Культуры выращивали в 200 мл колбах, содержавших 100 мл среды в течение 48 ч на лабораторных качалках с интенсивностью качания 200 об/мин при температуре 37 С. Клетки отделяли центрифугированием. Пробы для определения биомассы и ферментативной активности отбирали каждые 5 ч.
Питательная среда для биосинтеза ксиланаз бактериями (%): пентозаны -0.5; белок -0.2; (NN4)2804 -0.3.
Получение среды проводили следующим образом. Ржаные отруби экстрагировали 0.5М NH40H с гидромодулем 1:5. Ржаные отруби из расчета 50 г на 250 мл экстрагировали при постоянном перемешивании в течение 1 ч при комнатной температуре. Экстракт отделяли от нерастворимого остатка центрифугированием. Кислотность экстракта корректировали 1М серной кислотой до рН 4.5. Полученный таким образом экстракт нагревали до 95°С и выдерживали 15 минут для коагуляции белков. Экстракт отделяли от белкового осадка центрифугированием. Супернатант нейтрализовали до рН 7.0 1М КОН и разбавляли водой до содержания 0.5% пентозанов в растворе. Полученный раствор использовали в качестве среды, содержавшей растворенные пентозаны для культивирования продуцентов ксиланаз. Влияние добавок цАМФ исследовали в диапазоне 2.5-125 нМ/л, эуфи-лина и кофеина - в диапазоне 0.01-10 мМ.
Контроль за ростом бактерий
Прирост определяли по увеличению оптической плотности культуральной среды при А=590 нм (0Б590).
Культивирование грибов Trichoderma для получения инокулята
Посевы выращивали на агаризованной среде Чапека при температуре 28оС, 7 суток. По истечении указанного срока с поверхности колоний водопроводной водой смывали споры грибов. Полученную суспензию разбавляли до содержания 1х106 спор/мл и в дальнейшем использовали в качестве инокулята для засева глубинных культур.
Культивирование грибов в глубинной культуре для биосинтеза ферментов
Культуральные среды засевали 2% инокулята. Культуры выращивали в 200 мл колбах, содержавших 100 мл среды в течение 96 часов на лабораторных качалках с интенсивностью качания 200 об/мин при температуре 28С при исходном значении рН=6.0. Клетки отделяли центрифугированием. Пробы для определения биомассы и ферментативной активности отбирали каждые 24 ч.
Питательная среда для биосинтеза ксиланаз грибами (%): пентозаны -0.2; белок -0 5; (NN4)2804 -0.5.
Получение среды проводили следующим образом. Рожь дробили до прохода через сито 1мм 85% помола. Проводилась экстракция дробленого зерна 0.5М N^0^ при рН=10.0 гидромодулем 1:10. Дробленую рожь из расчета 50 г на 500 мл экстрагировали при постоянном перемешивании в течение 1 часа при комнатной температуре. Экстракт отделяли центрифугированием. Экстракт после коррекции рН до 4.5 1М серной кислотой помещали в кипящую водяную баню, затем центрифугировали в течение 15 мин при 4500 об/мин для отделения осажденного белка. Кислотность надосадочной жидкости доводили 1М КОН до рН=6.0, помещали в кипящую водяную баню на 60 мин, затем центрифугировали в течение 15 мин при 4500 об./мин. Супернатант отделяли и использовали в качестве среды, содержащей растворенные пентозаны для культивирования продуцентов ксиланаз. Влияние добавок цАМФ исследовали в диапазоне 2.5-125 нМ/л.
Контроль за ростом грибов
Прирост определяли по абсолютно сухому весу (АСВ) высушенной после осаждения центрифугированием биомассы гриба.
Штаммы
В работе использовали штаммы из коллекции музея лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов лаборатории сельскохозяйственной микробиологии и кафедры микробиологии Ка-
занского государственного университета: бациллы Bacillus arculans и грибы Trichoderma 302 Математическая обработка
Математическая обработка результатов исследований проведена с использованием математического аппарата программы Microsoft Excel. Все приведенные в отчете результаты имеют высокую степень достоверности, уровень значимости а^0.05.
Заключение
Результаты проведенного исследования показали, что при культивировании бактерий B.circulans добавка в среду цАМФ, эуфилина и кофеина вызывала пролонгирование роста ксиланазной активности. Добавка цАМФ в среду культивирования грибов Trichoderma снижала рост ксиланазной активности.
На основании результатов исследований можно сделать следующие выводы.
1. Получены результаты, показавшие возможность увеличения ксиланазной активности при использовании добавок цАМФ, эуфилина и кофеина в культуральные среды B.circulans.
2. Получены результаты, показавшие снижение роста ксиланазной активности при использовании добавок цАМФ в культуральные Trichoderma.
3. Показана возможность использования препарата кофеин бензоат натрия для увеличения ксиланазной активности сред при культивировании B.circulans, что делает возможным применения полученных результатов при промышленном получении препаратов ксиланаз.
Проведенные исследования показали, что применение препарата кофеин бензоат натрия при промышленном синтезе ксиланаз B.circulans, повышает ксиланазную активность и увеличивает глубину конверсии компонентов культуральной среды. Таким образом, применение кофеина бензоата натрия может позволить снизить себестоимость препаратов ксиланаз и является перспективным методом повышения эффективности их промышленного производства.
Литература
1. Khalil B.O., Bharat B., Muresh K.// Enzyme and Microb. Technol. 2000. Т.27. №7. P. 459-466.
2. Fujimoto Z.// J. Mol. Biol. 2000. V.300. P. 575-585.
3. Hidenori T., Ryuichiro N., Satoshi N. //Biotechnol. and biochem.2000. №4. P.887-890.
4. Bisaria V. S.; Mishra S. // Crit. Rev. Biotechnol. 1989. № 9. P.61-103.
5. Kubicek C. P., Messner R., Gruber F. // Enzyme Microb. Technol. 1993. №15. P.90-99.
6. Jagruti G.P., Koteswara R.K., Prafulla D.J. //J. Chem. Technol. and Biotechnol. 1994. V.60. №1.
P. 55-60.
7. Saha B.C. //Process Biochemistry. 2002. V.37. №11. P. 1279-1284.
8. Vega-Estrada J.,Flores-Cotera L.,Santiago A.//Appl.Microbiol and Biotechnol. 2002. V.58. №4. P.
435-438
9. Lu W., Li D.,Wu Y. //Enzyme and Microbial Technology. 2003. V.32. №2. P. 305-311
10.JоrgensenH., Eriksson T., Borjesson J.// Enzyme and Microbial Technology. 2003. V.32. №2. P.
851-861.
11.Грачева И.М//Технология ферментных препаратов. М.:Агропромиздат,1987. 169 с.
12.Pat U.S. 5306633, 2002
13.Aguilar G., Trejo B.A., Garcia J.M., Huitron C. // Can.J.Microbiol. 1991. V.11. Р. 912-917.
14.Paice W. B.Subtilis xylanases// Archiv. Microbiology. 1986. №144. P. 201-205.
15.Околелова Т.М., Кулаков А.В., Молоскин С.А., Грачев Д.М. Корма и ферменты. Сергиев Посад, ВНИТИП, 2001. 122 с.
16.Wakarchuk W.W., Campbell R.L., Sung W.L., Davoodi J., Yaguchi M. // Protein Science. 1994. V. 3. Issue 3. Р. 218-224.
17.Sa-Pereira P., Costa-FerreiraM., Aires-Barros M.R. // Journal of Biotechnology. 2002. V.94. Issue 3. P. 265 - 275.
18.Hidenori T., Ryuichiro N., Satoshi N. // Biotechnol. and biochem. 2000. №4. P.887-890.
19. Dhillon A., Khanna S. // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2000. №27(3). P. 325-327.
20.Dhillon A., Gupta J.K., Jauhari B.M., Khanna S. // Bioresource Technology. 2000. №14. P. 273-277.
21.BocchiniD.A., Alves-Prado H. F., Baida L.C., Roberto I.C., Gomes E., Da Silva R. // Process Biochemistry. 2002. 10. P.727-731.
22.Nishimoto M., Honda Y., Kitaoka M., Hayashi K. // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2002. V.93, Issue 4. P.428-430.
23.Jung-han, Suh, Yong-Jin C. // Journal of Microbiology and Biotechnology, 1996. № 6(3). P. 173-178.
24.Кретович В.Л. Биохимия зерна и хлеба. М.:Наука, 1991. С.136-12.
25.Botsford J.L., Harman J.G. // Microbiol. Rev. 1992. 56. P.100-122.
26.Konig J., Grasser R., Pikor H.// Anal Bioanal Chem. 2002. V.374. P.80-87.
© Е. В. Скворцов - асп. каф. микробиологии КГУ; Ф. Г. Каримова - д-р биол. наук, зав. лаб. сигнальных систем клеток КИББ; Ф. К. Каримова - канд. биол. наук, доц. каф. микробиологии КГУ; А Энтор Фуентос Кабрера - студ. КГУ.
