CC BY
113
DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10110
УДК 579.22
Влияние различных источников углерода и азота на продукцию ксиланаз грибом Bipolaris sorokiniana
Риш. С. МУХАММАДИЕВ1, аспирант
Рин. С. МУХАММАДИЕВ1, аспирант
Т. В. БАГАЕВА1, доктор биологических наук,
профессор (e-mail: public.mail@kpfu.ru)
Л. Р. ВАЛИУЛЛИН2, кандидат биологических наук,
директор
А. П. ГЛИНУШКИН3, доктор сельскохозяйственных наук, профессор РАН
казанский (Приволжский) федеральный университет, ул. Кремлевская, 18, Казань, 420000, Российская Федерация
2Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности, Научный городок, 2, Казань, 420008, Российская Федерация
3Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии, ул. Институт, вл. 5, р. п. Большие Вяземы, Одинцовский р-н, Московская обл.,143050, Российская Федерация
Резюме. Исследовали влияния различных источников углеродного и азотного питания и их концентраций на продукцию ксиланаз штаммом микромицета B. sorokiniana Bp1. Штамм-продуцент культивировали глубинным способом на жидкой питательной среде (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0; Na2HPO4 ■ 2H2O - 10,0; KCl - 0,5; MgSO4 • 7H2O - 0,15 при температуре 30 оС в течение 5 суток. Гидролазную активность ксиланаз определяли окрашиванием редуцирующих сахаров динитро-салициловой кислотой, субстратом служил 1 %-ный березовый ксилан. В качестве источника углерода для B. sorokiniana Bp1 использовали глюкозу, мальтозу, ксилозу, целлюлозу, крахмал, отходы деревоперерабатывающей промышленности и сельского хозяйства (пшеничную солому и отруби, ячменную солому, кукурузные початки, древесные опилки); в качестве источника азота - нитрат аммония, сульфат аммония, нитрат натрия, нитрат калия, пептон, мочевину и дрожжевой экстракт. Максимальная активность ксиланаз (43,69 ед./мл на 5-е сутки) отмечена на среде с 4 %-ной пшеничной соломой. Гидролазная активность ферментов, по сравнению с другими источниками углерода, повышалась при внесении ксилана, ячменной соломы и кукурузных початков (18,78; 12,84 и 17,26 ед./мл, соответственно). Наибольшую репрессию продукции ксиланаз продуцента вызывали раффиноза, глюкоза, ксилоза и мальтоза (0,06; 0,09; 0,19; 0,27 ед./мл соответственно). Внесение 0,5 % нитрата натрия в среду культивирования приводило к 4-х кратному увеличению ксиланазной активности, по сравнению с контролем. Добавление хлорида, нитрата и сульфата аммония в концентрации 0,5 % незначительно влияло на продукцию гидролитических ферментов в культуральной жидкости штамма микромицета B.sorokiniana Bp1 (12,11; 12,60 и 13,78 ед./мл, соответственно).
Ключевые слова: глубинное культивирование, микромицет, Bipolaris sorokiniana, киланазы, активность, источники углерода и азота.
Для цитирования: Влияние различных источников углерода и азота на продукцию ксиланаз грибом Bipolaris sorokiniana / Риш. С. Мухаммадиев, Рин. С. Мухаммадиев, Т. В. Багаева и др. //Достижения науки и техники АПК. 2019. Т. 33. № 1. С. 41-44. DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10110.
Ксиланазы - ферменты класса гидролаз, которые катализируют процесс расщепления р-гликозидных связей в молекуле гетерогенного полисахарида кси-лана с образованием ксилоолигосахаридов вплоть до мономерного соединения - ксилозы [1]. Ксиланы входят в состав распространенных связующих гликанов, в
растительной клеточной стенке их содержание может достигать 40 % [2]. Расщепление ксилана происходит ксиланазными полиферментными системами.
Ксиланазный комплекс, в основном, состоит из гидролаз нескольких типов, различающихся отношением к субстратам: эндо^-1,4-ксиланаза (ЕС 3.2.1.8), эндо-1,3-ß-ксиланаза (ЕС 3.2.1.32), ß-ксилозидаза (EC 3.2.1.37) или экзо^-ксиланаза - a-L-арабинофуранозидаза (EC 3.2.1.55), a-глюкуронидаза (EC 3.2.1.131) и ацетилкси-ланэстераза (EC 3.1.1.72) [3].
В природе ксиланазы способны продуцировать бактерии, актиномицеты и грибы [2]. Однако исследования, проведенные отечественными и зарубежными энзимологами, показывают, что наиболее перспективные продуценты - микроскопические грибы. Способность к образованию ксиланаз обнаружена у видов Trichoderma viride, T. harzianum, T. koningii, T. lignorum [4], T., Aspergillus niger, A. aculeatus [5], A. oryzae [6],
A. lentulus [7], A. tamarii [8], Chrysosporium lucknowense [9], Penicillium canescens [10], Geotrichum candidum [11], Fusarium oxysporum [12], Penicillium glabrum [13], Thermomyces lanuginosus [14] и др.
Ксиланазы находят широкое применение в различных отраслях производства: в пищевой промышленности - для повышения упругости теста, осветления соков; в спиртовой и пивоваренной промышленности - для осветления вин, улучшения качества пива; в сельском хозяйстве - для гидролиза грубых кормов животных и птицы [4, 15, 16, 17, 18].
В связи с активным интересом, который обусловлен использованием ксиланаз в различных отраслях, энзимологи ищут наиболее эффективные методы увеличения образования этого фермента [6, 7, 8]. На синтез ксиланаз влияет добавление в среду культивирования микроорганизма органических и неорганических субстратов - солей, пептона, аминокислот, крахмала, глюкозы, дрожжевого экстракта и др. Установлено, что использование таких источников питания, как ксилан, кукурузные початки, пшеничные отруби, ячменная и пшеничная солома, также могут положительно влиять на активность гидролитических ферментов, в том числе и ксиланаз микромицетов [13, 19, 20]. Некоторые из этих добавок содержат в своем составе соли кальция, магния и фосфора, а также ростовые соединения, которые способны оказывать стимулирующее воздействие на продукцию ксиланаз.
К числу перспективных и мало изученных объектов относятся микромицеты рода Bipolaris. Показано, что они вырабатывают антибиотики, токсины (виктоксинин, прегельминтоспорол, прегельминтоспоролактон, гель-минтоспорол), фитогормоны (цитокинины) и внутриклеточные аминокислоты [21, 22, 23]. В последние годы за рубежом появились сведения, что разные виды рода Bipolaris способны продуцировать ксиланазу (B. zeicola,
B. maydis, B. sorokiniana и B. spicifera) [24, 25].
Цель исследования - определение влияния различных источников углеродного и азотного питания и их концентраций на продукцию ксиланаз штаммом микромицета B. sorokiniana Bp1.
Условия, материалы и методы. В работе использовали штамм микромицета B. sorokiniana Bp1,
выделенный из образцов дерново-подзолистой почвы Республики Татарстан. Культуру микроорганизмов поддерживали на твердой картофельно-глюкозной среде с агаром (КГА) при температуре 4 С.
В качестве исходной для глубинного культивирования штамма-продуцента использовали жидкую питательную среду следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0; N8^0,, ■ 2Н20 - 10,0; КС1 - 0,5; МдБ04 ■ 7Н20 - 0,15 [20]. Микроорганизмы культивировали в конической колбе объемом 100 мл с 40 мл среды при скорости вращения качалки 120 об./мин. и температуре 30 С в течение 5 суток. Культуральную жидкость центрифугировали при 9 тыс. об./мин. в течение 10 мин., далее супернатант оценивали на активность фермента ксиланазы.
Для этого в качестве субстрата использовали березовый ксилан. К исследуемому образцу объемом 1 см3 добавляли 1 см3 субстрата, после чего смесь выдерживали на водяной бане при 50 °С в течение 20 мин. Содержание редуцирующих сахаров в гидролизате устанавливали по ГОСТ 31488-2012 «Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности ксиланазы». Измерение абсорбции осуществляли на спектрофотометре и!аЬ 101 при 540 нм. За единицу кси-ланазной активности принимали количество фермента, которое в стандартных условиях катализирует процесс расщепления субстрата с образованием 1 мкмоль восстанавливающих сахаров.
Для изучения влияния источников углерода на продукцию ксиланаз микроорганизмы культивировали в течение 5 суток на указанной ранее жидкой среде, используя сахара (глюкоза, мальтоза, ксилоза, целлюлоза, крахмал), а также отходы деревоперерабатывающей промышленности и сельского хозяйства (пшеничная солома и отруби, ячменная солома, кукурузные початки, древесные опилки) в концентрации 1,0 % [13].
Для изучения влияния источников азота на синтез ксиланаз гриб культивировали на среде с добавлением
неорганических (KNO NaNO (NH4)2SO4
NH4NO3,
NH4CI)
и органических (пептон, мочевина и дрожжевой экстракт) источников азота в концентрации 0,5 % [20]. В качестве источника углерода использовали пшеничную солому (4 %), контроль - исходная среда с пшеничной соломой (4 %).
Опыты проводились в 3-х биологических и 3-х аналитических повторностях. Статистическую обработку результатов осуществляли путем нахождения средних арифметических значений и их стандартных ошибок с использованием пакета программ Microsoft Office Excel 2013. Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, различия считали достоверными при p<0,05.
Результаты и обсуждение. Одной из главных особенностей микромице-тов служит их способность к изменению метаболизма в соответствии с условиями окружающей среды, что дает возможность управлять процессом роста микроорганизма и увеличивать
выход конечного продукта, в том числе повышать биосинтез необходимого белка. Способность микроми-цетов к образованию ксиланаз в количествах, которые превосходят физиологические потребности, в первую очередь, обусловлена компонентами питательной среды, содержащими специфические вещества-индукторы фермента [26].
На первом этапе исследования определяли лучший источник углерода для продукции ксиланаз микро-мицетом B. sorokiniana Bp1. Их образование было наибольшим, по сравнению с другими источниками (р<0,05), при добавлении в питательную среду ксила-на и пшеничной соломы - (18,78±1,65) и (23,05±2,0) ед./мл, соответственно (см. табл.). Значительное накопление гидролаз наблюдали со 2-х суток культивирования продуцента.
Таблица. Влияние источников углерода на продукцию ксиланаз штаммом В. вогок1п1апа Вр1*
Источник углерода, 1 % Ксиланазная активность, ед./мл
Глюкоза 0,09±0,007
Мальтоза 0,27±0,03
Галактоза 0,15±0,01
Рафиноза 0,06±0,004
Ксилоза 0,19±0,02
Сахароза 0,12±0,01
Целлюлоза 2,71±0,21
Крахмал 0,31±0,03
Ксилан 18,78±1,65
Пшеничная солома 23,05 ±2,0
Пшеничные отруби 4,65 ±0,38
Ячменная солома 12,84 ±1,16
Кукурузные початки 17,26±1,52
Древесные опилки 0,32 ±0,02
*различия между вариантами статистически значимы (р<0,05);
различия не значимы между вариантами с использованием ксилана и кукурузных початков, крахмала и древесных опилок (р > 0,05).
Установленная зависимость объясняется тем, что ксиланазы по своей природе представляют собой индуцибельные ферменты, количество которых резко возрастает в присутствии соответствующего субстрата, то есть ксилансодержащих источников углерода (пшеничная и ячменная солома, кукурузные початки) и в то же время, снижается конечными продуктами [17].
Рис. 1. Влияние различных концентраций пшеничной соломы на биосинтез ксиланаз штаммом B. sorokiniana Bp1. Различия статистически значимы между вариантами с добавлением 1 % и 4 % пшеничной соломы (р < 0,05).
Рис. 2. Влияние источников азота на продукцию ксиланаз штаммом В. вогокШапа Вр1. Различия статистически значимы в варианте с использованием нитрата натрия, по сравнению с контролем (р<0,05).
Результаты нашего исследования согласуются с данными зарубежных авторов, которые установили, что синтез ксиланаз микромицетом Со^!юЬо!ив ва^ив значительно индуцируется в присутствии ксилана и пшеничной соломы в качестве источника углерода в среде, но подавляется такими моносахарами, как глюкоза, мальтоза и ксилоза [20]. В литературе также указано, что продукты неполного гидролиза субстрата, специфические вещества-индукторы, способны значительно увеличивать синтез ксиланаз микромицетов [27]. Благодаря этому ядерный аппарат клетки начинает продуцировать такой ферментный комплекс, который, попадая во внешнюю среду, приводит к наибольшему гидролизу субстрата.
В связи с тем, что биосинтез ксиланаз штаммом В. вогок1п1апа Вр1 усиливался в присутствии пшеничной соломы, далее проводили исследования по подбору оптимальной концентрации этого субстрата. Культивирование гриба осуществляли на питательной среде с пшеничной соломой в концентрациях 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 %. Наибольшее увеличение активности ксиланаз наблюдали при внесении пшеничной соломы в концентрации 4,0 % (43,69±3,8 ед./мл). Различия были статистически значимы между вариантами с добавлением 1 % и 4 % пшеничной соломы (р < 0,05). Дальнейшее повышение концентрации соломы снижало активность ксилаз (рис. 1). Этот эффект, по-видимому, связан с тем, что высокие концентра-
ции приводят к репрессии биосинтеза фермента, обусловленной увеличением вязкости культуральной жидкости и изменением содержания растворенного в среде кислорода.
При изучении влияния различных источников азота на биосинтез ксиланаз B. sorokiniana максимальный в опыте результат отмечен при использовании NaNO3. В концентрации 0,5 % он способствовал 4-х кратному увеличению ксиланазной активности, по сравнению с контролем (р<0,05). Добавление таких источников азота, как хлорид, нитрат и сульфат аммония, приводило к значительно меньшему повышению продукции гидролитических ферментов (рис. 2).
Полученные результаты согласуются с данными зарубежных авторов, которые показали, что лучшим источником азотного питания, способствующим наибольшей продукции ксиланаз грибами Aspergillus awamori, Trichoderma harzianum и Cochliobolus sativus, служит нитрат натрия [20, 28, 29].
Выводы. Таким образом, установлено, что добавление в жидкую питательную среду культивирования микромицета Bipolaris sorokiniana различных углерод-и азотсодержащих субстратов приводит к изменению активности ксиланаз. Оптимальными источниками азота и углерода, способствующими наибольшей продукции ксиланаз B. sorokiniana Bp1, служат нитрат натрия в концентрации 0,5 % и пшеничная солома в концентрации 4 %.
Литература.
1. Алимова Ф. К., Тухбатова Р. И., Тазетдинова Д. И. Методы определения гидролаз почв и почвенных микроорганизмов: Учебно-методическое пособие. Казань: Казанский университет, 2010. 68 с.
2. Xylanases from fungi: properties and industrial applications / M. L. Polizeli, A. C. S. Rizzatti, R. Monti, etc. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. Vol. 67. No. 5. Pp. 577-591.
3. Новожилов Е. В. Применение ферментных технологий в целлюлозно-бумажной промышленности: монография. Архангельск: Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В. Ломоносова, 2013. 364 с.
4. Алимова Ф. К. Промышленное применение грибов рода Trichoderma. Казань: УНИПРЕСС ДАС, 2006. 268 с.
5. Пищевая химия. Добавки: учеб. пособие для СПО/Л. В. Донченко, Н. В. Сокол, Е. В. Щербакова и др. М.: Издательство Юрайт, 2018. 223 с.
6. Szendefy J., Szakacs G., Christopher L. Potential of solid-state fermentation enzymes of Aspergillus oryzae in biobleaching of paper pulp // Enzyme Microb. Technol. 2006. Vol. 39. No. 6. Pp. 1354-1360.
7. Kaushik P., Mishra A., MalikA. Dual application of agricultural residues forxylanase production and dye removal through solid state fermentation // Int. Biodeterioration & Biodegradation. 2014. Vol. 96. Pp. 1-8.
8. Characterization of multiple xylanase forms from Aspergillus tamarii resistant to phenolic compounds/ A. V. Monclaro, E. N. Aquino, R. F. Faria, etc. // Mycosphere. 2016. Vol. 7. No. 10. Pp. 1554-1567.
9. Устинов Б. Б. Свойства ксиланаз Chrysosporium lucknowense: автореф. дис.... канд. техн. наук. М., 2006. 24 с.
10. Серебряный В. А. Ксиланаза Penicillium canescens: выделение гена, изучение его регуляции и создание штамма-продуцента: автореф. дис. канд. техн. наук. М., 2006. 26 с.
11. Дубовая Н. В. Исследование процессов выделения и очистки микробной эндо-1,4-Р-ксиланазы из рода Geotrichum и изучение свойств фермента: автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 2002. 25 с.
12. Extracellular xylanases from two pathogenic races of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris: enzyme production in culture and purification and characterization of a major isoform as an alkaline endo-fi-(1,4)-xylanase of low molecular weight /1. Jorge, O. de la Rosa, J. A. Navas-Cortés, etc. //Antonie van Leeuwenhoek. 2005. Vol. 88. № 1. Pp. 49-59.
13. Production, purification, and characterization of a major Penicillium glabrum xylanase using brewer's spent grain as substrate /A. Knob, S. M. Beitel, D. Fortkamp, etc.//BioMedRes. Intern. 2013. Vol. 2013. Pp. 728-735.
14. Ziaie-Shirkolaee Y., Talebizadeh A., Soltanali S. Comparative study on application of T. lanuginosus SSBP xylanase and commercial xylanase on biobleaching of non wood pulps // Biores. Technol. 2008. Vol. 99. No. 16. Pp. 7433-7437.
15. Microbial xylanases and their industrial applications: a review / Q. K. Beg, M. Kapoor, L. Mahajan, etc. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. Vol. 56. No. 3-4. Pp. 326-338.
16. Motta F. L., Andrade C. C. P., Santana M. H. A. A review of xylanase production by the fermentation of xylan: classification, characterization and applications // Sustainable Degradation of Lignocellulosic Biomass - Techniques, Applications and Commercialization/eds. A. K. Chandel, S. S. da Silva. Croatia: InTech, 2013. Pp. 251-276.
17. Burlacu A., Cornea C. P., Israel-Roming F. Microbial xylanase: a review// Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies. 2016. Vol. 20. Pp. 335-342.
18. Xylanases and their industrial applications: A review/ D. Kumar, S. S. Kumar, J. Kumar, etc.// Biochem. Cell. Arch. 2017. Vol. 17. No. 1. Pp. 353-360.
19. Partial purification and characterization of xylanase produced by Penicillium expansum / A. L. S. Querido, J. L. C. Coelho, E. F. Araújo, etc. // Brazilian Archives of Biology and Technology. 2006. Vol. 49. No. 3. Pp. 475-480. [Электронный ресурс]. URL: http://dx.doi.org/10.1590/S1516-89132006000400016(дата обращения: 16.04.2004).
20. Bakri Y., Jawhar M., Arabi M. I. EImprovement of Xylanase Production by Cochliobolus sativus in Submerged Culture//Food Technol. Biotechnol. 2008. Vol. 46. No. 1. Pp. 116-118.
21. Bakri Y., Jawhar M., Arabi M. I. Improvement of Xylanase Production by Cochliobolus sativus in Solid Sate Fermentation // Brazil. J. Microbiol. 2009. Vol. 39. Pp. 602-604.
22. Arabi M. I., Jawhar M. Effect of additional carbon source and moisture level on xylanase production by Cochliobolus sativus in solid fermentation // Brazil. J. Microbiol. 2011. Vol. 80. No. 2. Pp. 162-165.
23. Зинченко В. А. Химическая защита растений: средства, технология и экологическая безопасность. М.: Колос, 2006. 232 с.
24. Emami K., Hack E. Characterisation of a xylanase gene from Cochliobolus sativus and its expression // Mycological Research. 2001. Vol. 105. Pp. 352-359.
25. Emami K., Hack E. Conservation of XYN11A and XYN11B xylanase genes in Bipolaris sorghicola, Cochliobolus sativus, Cochliobolus heterostrophus, and Cochliobolus spicifer // Current Microbiology. 2002. Vol. 45. Pp. 303-306.
26. Оптимизация биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Trichoderma viride / Л. Н. Ларина, Н. М. Павлова, Э. А. Шишкова и др. // Биотехнология. 2005. № 4. С. 29-37.
27. Production of fungal xylanases / D. Haltrich, B. Nidetzky, K. D. Kulbe, etc. // Bioresour. Technol. 1996. Vol. 58. No. 2. Pp. 137-161.
28. Abdel-Sater, M.A., El-Said, A.H.M. Xylan-decomposing fungi andxylanolytic activity in agricultural and industrial wastes // Int. Biodeter. Biodegr. 2001. Vol. 47. No. 1. Pp. 15-21.
29. Lemos J. L. S., Fontes M. C. A., Pereira N. J. Xylanase production by Aspergillus awamori in solid-state fermentation and influence of different nitrogen sources //Appl. Biochem. Biotechnol. 2001. Vol. 91-93. No. 1-9. Pp. 681-689.
Influence of Different Carbon and Nitrogen Sources on the Production of Xylanases by Bipolaris sorokiniana
Rish. S. Muhammadiev1, Rin. S. Muhammadiev1, T. V. Bagaeva1, L. R. Valiullin2, A. P. Glinushkin3
'Kazan Federal University, ul. Kremlevskaya, 18, Kazan', 420000, Russian Federation
2Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Nauchnyi gorodok, 3, Kazan, 420008, Russian Federation 3All-Russian Research Institute of Phytopathologyul. Institut, vl. 5, r.p. Bol'shie Vyazemy, Odintsovskii r-n, Moskovskaya obl., 143050, Russian Federation
Abstract. The effect of carbon and nitrogen sources in different concentrations on the production of xylanases by Bipolaris sorokiniana Bp1 was studied. The strain was cultivated in liquid nutrition medium by the pour plate method at 30 C for 5 days: yeast extract - 5.0 g/L, Na2HPO4*2H2O - 10.0 g/L, KCl - 0.5 g/L and MgSO4*7H2O - 0.15 g/L. The hydrolase activity of xylanases was determined by staining the reducing sugars with dinitrosalicylic acid, 1% birch xylan was a substrate. As a source of carbon for B. sorokiniana Bp1 there were used glucose, maltose, xylose, cellulose, starch, different agricultural and industrial wastes: wheat straw, wheat bran, barley straw, corn cobs, sawdust. Ammonium nitrate, ammonium sulfate, sodium nitrate, potassium nitrate, peptone, urea and yeast extract were used as sources of nitrogen. The maximum activity of xylanases (43.69 U/mL on the 5th day) was obtained on the medium with 4% wheat straw. An increase in the enzymatic activity of hydrolase was observed when carbon sources such as xylan, barley straw, corn cobs were added (18.78, 12.84 and 17.26 U/mL, respectively). The highest repression of xylanase production was caused by raffinose, glucose, xylose and maltose (0.06, 0.09, 0.19 and 0.27 U/mL, respectively). The addition of 0.5% sodium nitrate to the culture medium resulted in a 4-fold increase in xylanase activity compared to the control. The addition of ammonium chloride, nitrate and sulfate had a negligible effect on the production of hydrolytic enzymes in culture liquid of B.sorokiniana Bp1 (12.11, 12.60 and 13.78 U/mL, respectively).
Keywords: submerged cultivation; micromycete; Bipolaris sorokiniana; xylanase; activity; sources of carbon and nitrogen. Author Details: Rish. S. Muhammadiev, post graduate student; Rin. S. Muhammadiev, post graduate student; T. V. Bagaeva, D. Sc. (Biol.), prof. (e-mail: public.mail@kpfu.ru); L. R. Valiullin, Cand. Sc. (Biol.), head of division; A. P. Glinushkin, D. Sc. (Agr.), professor of the RAS.
For citation: Muhammadiev Rish. S., Muhammadiev Rin. S., Bagaeva T. V., Valiullin L. R., Glinushkin A. P. Influence of Different Carbon and Nitrogen Sources on the Production of Xylanases by Bipolaris sorokiniana. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2019. Vol. 33. No. 1. Pp. 41 -44 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10110.
