Научная статья на тему 'Система вирусологической оценки действия дезинфектантов на вирус гепатита а'

Система вирусологической оценки действия дезинфектантов на вирус гепатита а Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

CC BY
49
10
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Н А. Замятина, В В. Куприянов, В Ф. Полещук, Л И. Николаева

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Система вирусологической оценки действия дезинфектантов на вирус гепатита а»

СИСТЕМА ВИРУСОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ДЕЙСТВИЯ ДЕЗИНФЕКТАНТОВ НА ВИРУС ГЕПАТИТА А. Гепатит А (ГА) был и остается повсеместно распространенной инфекцией на территории Российской Федерации. После значительного спада заболеваемости гепатитом А (в 1999 г. 30,2 на 100000 населения), в настоящее время вновь наблюдается период подъема заболеваемости. Это явление отражает волнообразный характер эпидпроцесса, осложненный к тому же нарастанием в стране количества чрезвычайных ситуаций природного характера.

Как известно, фекально-оральный механизм передачи ГА реализуется в основном алиментарным, водным и контактно-бытовым путем. В профилактике ГА-инфекции наряду с активной и пассивной иммунизацией немаловажную роль играет комплекс санитарно-гигиенических мероприятий, целью которых является разрыв механизма передачи инфекции. Первостепенное значение имеет проведение текущей и заключительной дезинфекции, направленных на инактивацию вируса ГА (ВГА).

ВГА относится к семейству Picomaviridae рода Hepatovirus. Инактивационные характеристики ВГА сходны с таковыми для других энтеровирусов, однако он наиболее устойчив к действию неблагоприятных факторов окружающей среды. ВГА устойчив в диапазоне рН 3,0-11,0; к кислотам (рН - 3,0 в течение 3-х часов при +25 С); к органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, фреон, генетрон и др.; при температуре +60° С вирус полностью сохраняется в течение 60 минут; при 44° С вирус устойчив в течение месяца. ВгА остается инфекционным на протяжении 1 месяца после высушивания на твердой поверхности при +25° С и 42%-ой относительной влажности; он сохраняется несколько лет при -20° С.

Вирус ГА инактивируется автоклавированием (+121° С за 20 минут); сухим жаром (+180° за 1 час) и ультрафиолетовым облучением (1,1 Вт на глубину 0,9 см за 1 мин.). Что касается инактивации ВГА химическими веществами, то он инактивируется формалином, перманганатом калия, йодистыми соединениями, хлорамином в высоких концентрациях, 70% этанолом и др.

До настоящего времени в практическом здравоохранении широко используются в качестве дезинфицирующих средств синтетические моющие вещества в сочетании с перекисью водорода и хлорсодержащие растворы с различной концентрацией активного вещества. В то же время известно, что хлорсодержащие вещества представляют собой агрессивную среду и часто вызывают аллергические реакции у человека. Перекись водорода вызывает коррозию металлических компонентов изделий медицинского назначения.

Если к многообразию новых и часто дорогостоящих инструментов и аппаратов современной медицины добавить многочисленные, в большинстве случаев термолабильные полимеры, которые создаются со все новыми свойствами, то можно объяснить увеличение количества исследований в области создания новых дезинфекционных средств.

К сожалению, не так много работ посвящены изучению устойчивости ВГА к действию различных физико-химических агентов и факторов. Отдельные авторы исследовали либо только антигенную, либо только инфекционную активность ВГА. Причем инфекционная активность изучалась также отдельно либо на культуре клеток, либо на экспериментальных животных. К тому же степень очистки вирусных суспензий, состав буферных систем, чувствительность применяемых диагностических методов отличались друг от друга в разных экспериментах, хотя параметры стабильности во многом зависят от вышеперечисленных факторов.

Наша работа может рассматриваться как первый этап разработки комплексного подхода к изучению системы вирусологической оценки действия дезинфектантов на ВГА.

В качестве основных методических приемов, определяющих эффективность воздействия дезинфектантов на стабильность ВГА, нами были выбраны исследования изменений антигенной активности в иммунологических реакциях и инфекционной активности при заражении культуры клеток и лабораторных животных. В работе использовались высокочувствительные методы диагностики: иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР).

В последнее время в ряде стран в качестве дезинфектантов стали применяться более безопасные химические агенты, по своему действию гораздо активнее хлора и не вызывающие аллергических реакций у человека. Это ферментный препарат «Сайдезим», 2% глутаровый альдегид, средство «Сайдекс», препараты, созданные на основе четвертичных аммониевых соединений, -типа «Дезэфект», «Септодор», «Септопол», «Лизоморфин-3000».

В нашей работе представлены результаты комплексной вирусологической оценки действия препарата «Септодор» на вирус гепатита А.

Для эксперимента были приготовлены 3 рабочих раствора дезинфектанта в концентрациях 0,05%, 0,1%, 0,5%.

На первом этапе определяли оптимальные концентрации дезинфектанта, уменьшающие антигенную активность культурального ВГА и ВГА, находящегося в фекальном экстракте, полученном от больного.

Для получения культурального ВГА использовали перевиваемую культуру клеток (линия 4647), зараженную адаптированным к ней штаммом ВГА. Отобранные пробы культурального ВГА, обладающие антигенной активностью и специфичностью, были обработаны дезинфектантом в трех разведениях. Полученные смеси инкубировали 1 час при +37° С. Образовавшийся осадок центрифугировали 10000 g 20 минут при +4° С. Осветленный препарат наносили на колонку с SephadexG-100, уравновешенную фосфатно-солевым буфером, и собирали по 1 мл.

Проверка антигенной активности методом ИФА показала, что под воздействием дезинфектанта уже в концентрации 0,1 % она практически снижается до уровня отрицательного контроля, а при концентрации 0,5% антигенная активность всех образцов культурального ВГА соответствует показателям отрицательных контролей (незараженные клетки 4647 и буфер вместо антигена). Образцы были дополнительно исследованы методом ПЦР. Отсутствие РНК ВГА после обработки дезинфектантом является доказательством полной инактивации вируса.

В то же время наличие вирусного генома не обязательно свидетельствует о сохранении патогенных свойств вируса, так как особенностью метода ПЦР является то, что в качестве источника генетического материала для репликации может быть использован любой, даже деструктивный биологический материал.

Аналогичные эксперименты по определению изменений антигенной активности вируса были проведены в эксперименте с ВГА, полученным от больного ГА (вспышка ГА в организованном детском коллективе). Была произведена частичная обработка нативного материала для получения 10% фекального

экстракта, который в дальнейшем был обработан дезинфектантом в трех разведениях (0,5%, 0,1%, 0,05%), также как и культуральный ВГА.

Анализ антигенной активности методом ИФА показал, что под действием препарата «Септодор» в концентрации 0,5% она снижается до уровня отрицательных контролен.

Таблица 1

Влияние дезинфектанта на антигенную активность культурального ВГА и ВГА, выделенного из фекалий больного ГА человека (ИФА и ПЦР)_

концентрация препарата «Септодор»

Образцы 0% 0,05% 0,1% 0,5%

ИФА ПЦР ИФА ПЦР ИФА ПЦР ИФА ПЦР

Культуральный ВГА № 1 + + + + - + - -

Культуральный ВГА № 2 + + + + - +/- - -

Культуральный ВГА № 3 + + + + + + - -

Негативные клетки 4647 - - - - - - - -

PBS-TW - - - - - - - -

ВГА от больного + + + + + + - -

Негативные фекалии - - - - - - - -

PBS-TW - - - - - - -

Снижение антигенной активности культурального ВГА происходит уже при концентрации дезинфектанта 0,1%, тогда как снижение антигенной активности нативного ВГА до уровня отрицательных контролен наступает при более высокой концентрации препарата- 0,5%. Это может быть связано с тем, что вирус в фекальном экстракте дополнительно защищен белковым материалом и находится в агрегированном состоянии.

На втором этапе изучалось изменение инфекционной активности ВГА, обработанного дезинфектантом при заражении культуры клеток 4647 и экспериментальных животных.

В культуральную жидкость, содержащую аттестованный штамм ВГА, добавляли дезинфектант в трех разведениях; смесь инкубировали 1 час при +37° С. Затем проводили гель-фильтрацию на колонке с 8ерИаёех 0-75 с целью отделения компонентов дезинфектанта от вирусных частиц. Элюат, содержащий вирусные частицы, подвергали стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр (МШроге) и вносили во флаконы на клеточный монослой. В общей сложности было заражено 12 флаконов: 3 флакона - ВГА, не обработанным дезинфектантом, 3 флакона -вируссодержащей жидкостью, обработанной дезинфектантом в концентрации 0,5%, 3 флакона - вируссодержащей жидкостью, обработанной дезинфектантом в концентрации 0,1%, 3 флакона - вируссодержащей жидкостью, обработанной дезинфектантом в концентрации 0,05% препарата «Септодор».

Контролем служили нативный ВГА, необработанный дезинфектантом, и негативные клетки 4647. На 21-й день после заражения клетки снимали и после соответствующей обработки проверяли на наличие в них AgBrA методом ИФА.

Таблица 2

Влияние дезинфектанта на инфекционную активность культурального ВГА (метод ИФА)_

Образиы, обработанные методом ИФА Концентрация дезинфектанта

0% 0,05% 0,1% 0,5%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12

Культуральный ВГА + + + + +/- - +/- +/- - - - -

Негативные клетки 4647

Как видно из таблицы, ВГА полностью утрачивает инфекционную активность после обработки вируса дезинфектантом в концентрации 0,5%.

В качестве чувствительных к ГА животных были использованы Callitrix Jaccus (мармозеты). Были отобраны серонегативные в отношении ГА животные со стабильными, на уровне нормы, биохимическими показателями (ALT, AST, Icd). Животные были разделены на 3 группы (по два животных): 1 группа - контрольные; 2 группа - зараженные ВГА, обработанным дезинфектантом; 3 группа - зараженные нативным ВГА. Для заражения обезьян был выбран ВГА, выделенный от больного ГА и аттестованный в ИФА и ПЦР. В качестве рабочего разведения дезинфектанта была выбрана 0,5%-ая концентрация. Животных из 2-ой группы заражали внутривенно. От момента заражения дважды в неделю, в течение 4-х недель, далее один раз в неделю производили взятие крови у животных с целью определения уровня

активности сывороточных аминотрансфераз и изоцитратдегидрогеназы, антител к ВГА класса М (анти-ВГА IgM). Фекальные пробы собирали с 4-го по 90-й день после заражения и исследовали их на наличие AgBrA методом ИФА. В течение указанного периода у двух обезьян из 2-ой группы не было обнаружено ни анти-ВГА IgM, ни экскреции ВГА с фекалиями.

Отсутствие вышеперечисленных диагностических маркеров однозначно свидетельствовало об отсутствии ГА инфекции. Однако у одной из двух обезьян наблюдался на ранних сроках подъем активности биохимических показателей, не связанных с развитием инфекционного процесса.

Возможно, подъём связан с наличием некоторого количества дезинфектанта в инокуляте, использованном для заражения. 3-я группа обезьян была внутривенно заражена вируссодержащим 10 % фекальным экстрактом, необработанным дезинфектантом. Процедура заражения, периодичность взятия крови и сбор фекальных проб были идентичными описанным выше. У одной из обезьян наблюдался подъём уровней активности трех исследованных биохимических показателей, превышающий в 2 и более раз фоновый уровень в конце первой и в течение второй недель после заражения.У данного животного на 5-6 день была выявлена кратковременная экскреция ВГА с фекалиями. Анти-ВГА IgM в пробах сывороток крови выявлялись, начиная с 14-го дня после заражения. Перечисленные диагностические маркёры свидетельствуют о развитии инфекционного процесса, связанного с ГА у данного животного. Контрольные обезьяны из 1-й группы оставались серонегативными в отношении ГА, а также по показателям уровня активности ALT, AST, Icd в пределах нормы в течение всего срока эксперимента.

В дальнейшем необходимо применить комплексный подход при изучении системы вирусологической оценки действия дезинфектанта на ВГА, находящийся в естественных условиях окружающей среды.

Н.А.Замятина, В.В.Куприянов, В.Ф.Полещук, Л.И.Николаева, Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, г. Москва.

СОВРЕМЕННЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ГЕПАТИТА А у ВЗРОСЛЫХ. В настоящее время гепатит А (ГА) продолжает оставаться одним из наиболее распространенных вирусных гепатитов в мире. Его удельный вес в суммарной заболеваемости вирусными гепатитами колеблется в весьма широких пределах, составляя в развитых странах 10-30%, в развивающхся странах, эндемичных по гепатиту А, - 70-80%.

В России за последние 5 лет в динамике заболеваемости гепатитом А отмечались противоположные тенденции: в 1998-99гг. имело место значительное сокращение заболеваемости, тогда как в 2000 г. уровень заболеваемости возрос по сравнению с предыдущим годом - на 90.1%, а в 2001г, еще на 38,3%. В связи с резким ростом заболеваемости доля ГА в структуре вирусных гепатитов увеличилась с 31% в 1999г. до 58% в 2001г.

Аналогичные закономерности динамики заболеваемости ГА наблюдались и в г.Москве. Так, если уровень заболеваемости ГА в г.Москве в 1997г. составлял 24,5, то к 2001г. заболеваемость ГА выросла до 50,3 на 100 тыс. населения. Такой рост заболеваемости оживил интерес к гепатиту А как эпидемиологов, так и клиницистов.

Вирусный гепатит А достаточно хорошо изучен, его клинико-эпидемиологические особенности хорошо известны. Это острое антропонозное заболевание с фекально-оральным механизмом передачи. Источниками инфекции являются больные желтушными и безжелтушными формами в ранней стадии болезни - в конце инкубационного периода, в преджелтушный период и в первые дни появления желтухи. Гепатит А протекает в виде спорадических случаев с выраженным сезонным подъемом заболеваемости в осенний период. При неблагоприятных условиях возможно развитие массивных эпидемий. Гепатитом А чаще болеют в раннем и молодом возрасте, за исключением детей первого года жизни. Течение гепатита А, в основном, нетяжелое, характеризуется сравнительно коротким преджелтушным периодом, чаще с острым лихорадочным началом, умеренной выраженностью клинических симптомов, достаточно быстрым обратным их развитием и полным выздоровлением с формированием стойкого пожизненного иммунитета. При гепатите А не наступает хронизация. Такой благополучный отдаленный прогноз при гепатите А определил достаточно спокойное отношение клиницистов к этому заболеванию, особенно на фоне растущей проблемы парентеральных вирусных гепатитов.

Однако в последние годы гепатит А все чаще привлекает к себе внимание клиницистов. Изменение ряда социально-экономических и эпидемиологических условий повлияло на течение гепатита А и обусловило появление некоторых особенностей этого заболевания на современном этапе.

Так, в России в последние годы отмечается снижение популяционного иммунитета к гепатиту А. У значительной части населения отсутствуют антитела к вирусу ГА, которые прежде формировались в детском возрасте за счет интенсивного, зачастую скрытого вовлечения детей в эпидемический процесс. Сохраняющийся риск заражения взрослого населения на этом фоне обусловил в последние 5 лет перемещение максимальных возрастных показателей заболеваемости на более старшие возрастные группы. Если ранее удельный вес лиц старше 14 лет среди больных ГА составлял менее 40%, то в 2001 году он приблизился к 60%. Известно, что у детей ГА протекает в основном в легкой, зачастую в безжелтушной, форме. С возрастом же вероятность развития тяжелого течения ГА возрастает. Данные английских исследователей (Kyrlagkitsis I, Cramp M.E., Smith H. et al., 2002), проанализировавших течение острого гепатита А за 25-летний период, свидетельствуют о наличии прямой зависимости тяжести заболевания от возраста.

Существует определенная связь между характером клинических проявлений ГА и способом инфицирования. Несмотря на то, что гепатит А является кишечной инфекцией, в ряде случаев может быть реализован и парентеральный путь передачи. Наиболее грозное течение ГА возникает при посттрансфузионной передаче вируса ГА. В научной

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.