CC BY
9СИСТЕМА ВИРУСОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ДЕЙСТВИЯ ДЕЗИНФЕКТАНТОВ НА ВИРУС ГЕПАТИТА А. Гепатит А (ГА) был и остается повсеместно распространенной инфекцией на территории Российской Федерации. После значительного спада заболеваемости гепатитом А (в 1999 г. 30,2 на 100000 населения), в настоящее время вновь наблюдается период подъема заболеваемости. Это явление отражает волнообразный характер эпидпроцесса, осложненный к тому же нарастанием в стране количества чрезвычайных ситуаций природного характера.
Как известно, фекально-оральный механизм передачи ГА реализуется в основном алиментарным, водным и контактно-бытовым путем. В профилактике ГА-инфекции наряду с активной и пассивной иммунизацией немаловажную роль играет комплекс санитарно-гигиенических мероприятий, целью которых является разрыв механизма передачи инфекции. Первостепенное значение имеет проведение текущей и заключительной дезинфекции, направленных на инактивацию вируса ГА (ВГА).
ВГА относится к семейству Picomaviridae рода Hepatovirus. Инактивационные характеристики ВГА сходны с таковыми для других энтеровирусов, однако он наиболее устойчив к действию неблагоприятных факторов окружающей среды. ВГА устойчив в диапазоне рН 3,0-11,0; к кислотам (рН - 3,0 в течение 3-х часов при +25 С); к органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, фреон, генетрон и др.; при температуре +60° С вирус полностью сохраняется в течение 60 минут; при 44° С вирус устойчив в течение месяца. ВгА остается инфекционным на протяжении 1 месяца после высушивания на твердой поверхности при +25° С и 42%-ой относительной влажности; он сохраняется несколько лет при -20° С.
Вирус ГА инактивируется автоклавированием (+121° С за 20 минут); сухим жаром (+180° за 1 час) и ультрафиолетовым облучением (1,1 Вт на глубину 0,9 см за 1 мин.). Что касается инактивации ВГА химическими веществами, то он инактивируется формалином, перманганатом калия, йодистыми соединениями, хлорамином в высоких концентрациях, 70% этанолом и др.
До настоящего времени в практическом здравоохранении широко используются в качестве дезинфицирующих средств синтетические моющие вещества в сочетании с перекисью водорода и хлорсодержащие растворы с различной концентрацией активного вещества. В то же время известно, что хлорсодержащие вещества представляют собой агрессивную среду и часто вызывают аллергические реакции у человека. Перекись водорода вызывает коррозию металлических компонентов изделий медицинского назначения.
Если к многообразию новых и часто дорогостоящих инструментов и аппаратов современной медицины добавить многочисленные, в большинстве случаев термолабильные полимеры, которые создаются со все новыми свойствами, то можно объяснить увеличение количества исследований в области создания новых дезинфекционных средств.
К сожалению, не так много работ посвящены изучению устойчивости ВГА к действию различных физико-химических агентов и факторов. Отдельные авторы исследовали либо только антигенную, либо только инфекционную активность ВГА. Причем инфекционная активность изучалась также отдельно либо на культуре клеток, либо на экспериментальных животных. К тому же степень очистки вирусных суспензий, состав буферных систем, чувствительность применяемых диагностических методов отличались друг от друга в разных экспериментах, хотя параметры стабильности во многом зависят от вышеперечисленных факторов.
Наша работа может рассматриваться как первый этап разработки комплексного подхода к изучению системы вирусологической оценки действия дезинфектантов на ВГА.
В качестве основных методических приемов, определяющих эффективность воздействия дезинфектантов на стабильность ВГА, нами были выбраны исследования изменений антигенной активности в иммунологических реакциях и инфекционной активности при заражении культуры клеток и лабораторных животных. В работе использовались высокочувствительные методы диагностики: иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР).
В последнее время в ряде стран в качестве дезинфектантов стали применяться более безопасные химические агенты, по своему действию гораздо активнее хлора и не вызывающие аллергических реакций у человека. Это ферментный препарат «Сайдезим», 2% глутаровый альдегид, средство «Сайдекс», препараты, созданные на основе четвертичных аммониевых соединений, -типа «Дезэфект», «Септодор», «Септопол», «Лизоморфин-3000».
В нашей работе представлены результаты комплексной вирусологической оценки действия препарата «Септодор» на вирус гепатита А.
Для эксперимента были приготовлены 3 рабочих раствора дезинфектанта в концентрациях 0,05%, 0,1%, 0,5%.
На первом этапе определяли оптимальные концентрации дезинфектанта, уменьшающие антигенную активность культурального ВГА и ВГА, находящегося в фекальном экстракте, полученном от больного.
Для получения культурального ВГА использовали перевиваемую культуру клеток (линия 4647), зараженную адаптированным к ней штаммом ВГА. Отобранные пробы культурального ВГА, обладающие антигенной активностью и специфичностью, были обработаны дезинфектантом в трех разведениях. Полученные смеси инкубировали 1 час при +37° С. Образовавшийся осадок центрифугировали 10000 g 20 минут при +4° С. Осветленный препарат наносили на колонку с SephadexG-100, уравновешенную фосфатно-солевым буфером, и собирали по 1 мл.
Проверка антигенной активности методом ИФА показала, что под воздействием дезинфектанта уже в концентрации 0,1 % она практически снижается до уровня отрицательного контроля, а при концентрации 0,5% антигенная активность всех образцов культурального ВГА соответствует показателям отрицательных контролей (незараженные клетки 4647 и буфер вместо антигена). Образцы были дополнительно исследованы методом ПЦР. Отсутствие РНК ВГА после обработки дезинфектантом является доказательством полной инактивации вируса.
В то же время наличие вирусного генома не обязательно свидетельствует о сохранении патогенных свойств вируса, так как особенностью метода ПЦР является то, что в качестве источника генетического материала для репликации может быть использован любой, даже деструктивный биологический материал.
Аналогичные эксперименты по определению изменений антигенной активности вируса были проведены в эксперименте с ВГА, полученным от больного ГА (вспышка ГА в организованном детском коллективе). Была произведена частичная обработка нативного материала для получения 10% фекального
экстракта, который в дальнейшем был обработан дезинфектантом в трех разведениях (0,5%, 0,1%, 0,05%), также как и культуральный ВГА.
Анализ антигенной активности методом ИФА показал, что под действием препарата «Септодор» в концентрации 0,5% она снижается до уровня отрицательных контролен.
Таблица 1
Влияние дезинфектанта на антигенную активность культурального ВГА и ВГА, выделенного из фекалий больного ГА человека (ИФА и ПЦР)_
концентрация препарата «Септодор»
Образцы 0% 0,05% 0,1% 0,5%
ИФА ПЦР ИФА ПЦР ИФА ПЦР ИФА ПЦР
Культуральный ВГА № 1 + + + + - + - -
Культуральный ВГА № 2 + + + + - +/- - -
Культуральный ВГА № 3 + + + + + + - -
Негативные клетки 4647 - - - - - - - -
PBS-TW - - - - - - - -
ВГА от больного + + + + + + - -
Негативные фекалии - - - - - - - -
PBS-TW - - - - - - -
Снижение антигенной активности культурального ВГА происходит уже при концентрации дезинфектанта 0,1%, тогда как снижение антигенной активности нативного ВГА до уровня отрицательных контролен наступает при более высокой концентрации препарата- 0,5%. Это может быть связано с тем, что вирус в фекальном экстракте дополнительно защищен белковым материалом и находится в агрегированном состоянии.
На втором этапе изучалось изменение инфекционной активности ВГА, обработанного дезинфектантом при заражении культуры клеток 4647 и экспериментальных животных.
В культуральную жидкость, содержащую аттестованный штамм ВГА, добавляли дезинфектант в трех разведениях; смесь инкубировали 1 час при +37° С. Затем проводили гель-фильтрацию на колонке с 8ерИаёех 0-75 с целью отделения компонентов дезинфектанта от вирусных частиц. Элюат, содержащий вирусные частицы, подвергали стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр (МШроге) и вносили во флаконы на клеточный монослой. В общей сложности было заражено 12 флаконов: 3 флакона - ВГА, не обработанным дезинфектантом, 3 флакона -вируссодержащей жидкостью, обработанной дезинфектантом в концентрации 0,5%, 3 флакона - вируссодержащей жидкостью, обработанной дезинфектантом в концентрации 0,1%, 3 флакона - вируссодержащей жидкостью, обработанной дезинфектантом в концентрации 0,05% препарата «Септодор».
Контролем служили нативный ВГА, необработанный дезинфектантом, и негативные клетки 4647. На 21-й день после заражения клетки снимали и после соответствующей обработки проверяли на наличие в них AgBrA методом ИФА.
Таблица 2
Влияние дезинфектанта на инфекционную активность культурального ВГА (метод ИФА)_
Образиы, обработанные методом ИФА Концентрация дезинфектанта
0% 0,05% 0,1% 0,5%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12
Культуральный ВГА + + + + +/- - +/- +/- - - - -
Негативные клетки 4647
Как видно из таблицы, ВГА полностью утрачивает инфекционную активность после обработки вируса дезинфектантом в концентрации 0,5%.
В качестве чувствительных к ГА животных были использованы Callitrix Jaccus (мармозеты). Были отобраны серонегативные в отношении ГА животные со стабильными, на уровне нормы, биохимическими показателями (ALT, AST, Icd). Животные были разделены на 3 группы (по два животных): 1 группа - контрольные; 2 группа - зараженные ВГА, обработанным дезинфектантом; 3 группа - зараженные нативным ВГА. Для заражения обезьян был выбран ВГА, выделенный от больного ГА и аттестованный в ИФА и ПЦР. В качестве рабочего разведения дезинфектанта была выбрана 0,5%-ая концентрация. Животных из 2-ой группы заражали внутривенно. От момента заражения дважды в неделю, в течение 4-х недель, далее один раз в неделю производили взятие крови у животных с целью определения уровня
активности сывороточных аминотрансфераз и изоцитратдегидрогеназы, антител к ВГА класса М (анти-ВГА IgM). Фекальные пробы собирали с 4-го по 90-й день после заражения и исследовали их на наличие AgBrA методом ИФА. В течение указанного периода у двух обезьян из 2-ой группы не было обнаружено ни анти-ВГА IgM, ни экскреции ВГА с фекалиями.
Отсутствие вышеперечисленных диагностических маркеров однозначно свидетельствовало об отсутствии ГА инфекции. Однако у одной из двух обезьян наблюдался на ранних сроках подъем активности биохимических показателей, не связанных с развитием инфекционного процесса.
Возможно, подъём связан с наличием некоторого количества дезинфектанта в инокуляте, использованном для заражения. 3-я группа обезьян была внутривенно заражена вируссодержащим 10 % фекальным экстрактом, необработанным дезинфектантом. Процедура заражения, периодичность взятия крови и сбор фекальных проб были идентичными описанным выше. У одной из обезьян наблюдался подъём уровней активности трех исследованных биохимических показателей, превышающий в 2 и более раз фоновый уровень в конце первой и в течение второй недель после заражения.У данного животного на 5-6 день была выявлена кратковременная экскреция ВГА с фекалиями. Анти-ВГА IgM в пробах сывороток крови выявлялись, начиная с 14-го дня после заражения. Перечисленные диагностические маркёры свидетельствуют о развитии инфекционного процесса, связанного с ГА у данного животного. Контрольные обезьяны из 1-й группы оставались серонегативными в отношении ГА, а также по показателям уровня активности ALT, AST, Icd в пределах нормы в течение всего срока эксперимента.
В дальнейшем необходимо применить комплексный подход при изучении системы вирусологической оценки действия дезинфектанта на ВГА, находящийся в естественных условиях окружающей среды.
Н.А.Замятина, В.В.Куприянов, В.Ф.Полещук, Л.И.Николаева, Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, г. Москва.
СОВРЕМЕННЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ГЕПАТИТА А у ВЗРОСЛЫХ. В настоящее время гепатит А (ГА) продолжает оставаться одним из наиболее распространенных вирусных гепатитов в мире. Его удельный вес в суммарной заболеваемости вирусными гепатитами колеблется в весьма широких пределах, составляя в развитых странах 10-30%, в развивающхся странах, эндемичных по гепатиту А, - 70-80%.
В России за последние 5 лет в динамике заболеваемости гепатитом А отмечались противоположные тенденции: в 1998-99гг. имело место значительное сокращение заболеваемости, тогда как в 2000 г. уровень заболеваемости возрос по сравнению с предыдущим годом - на 90.1%, а в 2001г, еще на 38,3%. В связи с резким ростом заболеваемости доля ГА в структуре вирусных гепатитов увеличилась с 31% в 1999г. до 58% в 2001г.
Аналогичные закономерности динамики заболеваемости ГА наблюдались и в г.Москве. Так, если уровень заболеваемости ГА в г.Москве в 1997г. составлял 24,5, то к 2001г. заболеваемость ГА выросла до 50,3 на 100 тыс. населения. Такой рост заболеваемости оживил интерес к гепатиту А как эпидемиологов, так и клиницистов.
Вирусный гепатит А достаточно хорошо изучен, его клинико-эпидемиологические особенности хорошо известны. Это острое антропонозное заболевание с фекально-оральным механизмом передачи. Источниками инфекции являются больные желтушными и безжелтушными формами в ранней стадии болезни - в конце инкубационного периода, в преджелтушный период и в первые дни появления желтухи. Гепатит А протекает в виде спорадических случаев с выраженным сезонным подъемом заболеваемости в осенний период. При неблагоприятных условиях возможно развитие массивных эпидемий. Гепатитом А чаще болеют в раннем и молодом возрасте, за исключением детей первого года жизни. Течение гепатита А, в основном, нетяжелое, характеризуется сравнительно коротким преджелтушным периодом, чаще с острым лихорадочным началом, умеренной выраженностью клинических симптомов, достаточно быстрым обратным их развитием и полным выздоровлением с формированием стойкого пожизненного иммунитета. При гепатите А не наступает хронизация. Такой благополучный отдаленный прогноз при гепатите А определил достаточно спокойное отношение клиницистов к этому заболеванию, особенно на фоне растущей проблемы парентеральных вирусных гепатитов.
Однако в последние годы гепатит А все чаще привлекает к себе внимание клиницистов. Изменение ряда социально-экономических и эпидемиологических условий повлияло на течение гепатита А и обусловило появление некоторых особенностей этого заболевания на современном этапе.
Так, в России в последние годы отмечается снижение популяционного иммунитета к гепатиту А. У значительной части населения отсутствуют антитела к вирусу ГА, которые прежде формировались в детском возрасте за счет интенсивного, зачастую скрытого вовлечения детей в эпидемический процесс. Сохраняющийся риск заражения взрослого населения на этом фоне обусловил в последние 5 лет перемещение максимальных возрастных показателей заболеваемости на более старшие возрастные группы. Если ранее удельный вес лиц старше 14 лет среди больных ГА составлял менее 40%, то в 2001 году он приблизился к 60%. Известно, что у детей ГА протекает в основном в легкой, зачастую в безжелтушной, форме. С возрастом же вероятность развития тяжелого течения ГА возрастает. Данные английских исследователей (Kyrlagkitsis I, Cramp M.E., Smith H. et al., 2002), проанализировавших течение острого гепатита А за 25-летний период, свидетельствуют о наличии прямой зависимости тяжести заболевания от возраста.
Существует определенная связь между характером клинических проявлений ГА и способом инфицирования. Несмотря на то, что гепатит А является кишечной инфекцией, в ряде случаев может быть реализован и парентеральный путь передачи. Наиболее грозное течение ГА возникает при посттрансфузионной передаче вируса ГА. В научной
