CC BY
15
Особенно интересна динамика опсоно-фагоци-тарной реакции, которая, по мнению ряда ученых, считается наиболее надежным показателем клеточного иммунитета при бруцеллезе [8]. У большинства морских свинок после проведения вакцинотерапии отмечено нарастание активности фагоцитов, и фагоцитарный показатель составил 52-68.
Бактериологическое исследование внутренних органов животных на наличие бруцелл показало, что монотерапия как вакциной, так и пефлоксацином привела к освобождению от бруцелл в 72 и в 75 % случаев соответственно. В то же время лишь комбинированная терапия способствовала элиминации возбудителя из организма животных в 100 % случаев.
К настоящему времени в НИИМ МО РФ оформлена и утверждена необходимая нормативная документация и освоен промышленный выпуск лечебной бруцеллезной вакцины.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бруцеллез / Под. ред. П.А.Вершиловой. - М., 1972. -2. Бруцеллез сельскохозяйственных животных / Под. ред. И.А.Косилова. - Новосибирск, 1999. - 3. Дрожевкина М.С., Простетова Н.П., Харитонова Т.Н., Хохлова А.М. // Тр. Рост. н/Д гос. н.-и. противочум. ин-та. - 1961. - Т. 17. -
С. 156-169. - 4.Ельчинова Е.А., Журбина М.Д. // ЖМЭИ. - 1973. - №10. - С. 72-76. - 5. Зайцева А.И. // ЖМЭИ. - 1961.-Х» 1. - С. 107-110. - 6. Кайтмазова Е.И., Островская Н.Н. // ЖМЭИ. - 1967. - X® 1. - С. 12-16. -
7. Кайтмазова Е.И., Островская Н.Н. // ЖМЭИ. -1967. - X» 2. - С. 66-70. - 8. Первушин Б.П. Вопросы микробиологической и иммунологической диагностики бруцеллеза у человека. - М., 1962. - 9. Поляков И.И. // Пробл. особо опасных инф. - 1969. - X® 6. - С. 162-166. - 10. Узбекова Б.Р., Кондратьева О.В., Синицын И.Д. // Пробл. особо опасных инф. - 1974. - Вып. 3 (37). - С. 115-119. - 11. Юнусова X. Вакцинотерапия бруцеллеза. Клинико-экспериментальные данные. - Ташкент, 1958. - 12. Феоктистов Г.И., Маркевич А.А. // Докл. Иркут, противочум. ин-та. - Иркутск, 1962.-Вып. 4. - С. 70-72. - 13. Joshi D.V., Prakash О. // Ind. J. Med. Rev. - 1971. - Vol. 59, N 10. - P. 1556. - 14. Joshi
D.V., Prakash 0., .Talvar G.P.//Ind. J. Med. Rev. - 1971. -Vol. 59, N 8. - P. 1225. - 15. Morgan W.J. // Dev. Biol. Standard. - 1984. - Vol. 56. - P. 43-53.
B.A.Shabalin, V.Yu.Okhapkina, L.B.Gavrilova, L.V.Sayapina
A Therapeutic Brucellosis Vaccine is an Efficient Means of Pathogenetic Treatment of Brucellosis
Microbiology Research Institute, RF MD, Kirov;
LA.Tarasevich State Institute for Standardization and Control, Moscow
A new component constitution is offered for the liquid therapeutic brucellosis vaccine with a more perfect procedure for its preparation and control. The production process has been adjusted and furnished with well-developed normative documentation.
Key words', brucellosis, therapeutic .vaccine, the development of the production process, immunologic efficacy.
Поступила 27.07.05.
ДИАГНОСТИКА
УДК 616.36-002:616-07
Н.Ф.Василенко1, С.Н.Степанова1, В.И.Ефременко1, Е.Н.Афанасьев1, Е.И.Еременко1, О.И.Цыганкова',
В.АЛетрюк , Н.А.Яценко2, С.М.Безроднова2
ПРИМЕНЕНИЕ СОЧЕТАННЫХ МЕТОДОВ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА А
1Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт,
2Ставропольская государственная медицинская академия
Разработаны сочетанные методы экспресс-диагностики вирусного гепатита А с помощью селективного концентрирования вируса на поверхности магнитных иммунных сорбентов (МИС) и последующего проведения иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Показано, что применение МИС в сочетании с экспрессными методами диагностики (ИФА и ПЦР) увеличивает чувствительность этих методов, одновременно сокращая время проведения исследований за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что повышает эффективность проведения противоэпидемических мероприятий.
Ключевые слова: гепатит А, антиген, РНК вируса, иммуноферментный анализ, полимеразная цепная реакция, магнитные иммунные сорбенты, сочетанный метод.
ре вирусных гепатитов колеблется от 80 до 90 %. В Российской Федерации вирусный ГА занимает ведущее место в этиологической структуре вирусных гепатитов у детей, а уровень заболеваемости этой инфекцией в детском возрасте в России в несколько раз превышает соответствующие показатели в развитых странах мира [4]. В связи с этим актуальна про-
Вирусные гепатиты являются одной из самых актуальных проблем современной медицины. Это определяется как их повсеместным распространением, так и высоким уровнем заболеваемости. Гепатит А (ГА) - наиболее распространенное вирусное заболевание печени у человека. По данным В.Ф.Учайки-на с соавт. [7], доля этого гепатита в общей структу-
\
у 1
блема разработки и усовершенствования современник методов экспресс-диагностики этой инфекции, доступных практическому здравоохранению.
) Целью наших исследований явилась разработка сочетанных методов экспресс-диагностики вирусного гепатита А с помощью селективного концентрирования вируса ГА на поверхности магнитных иммунных сорбентов (МИС) и последующего проведения иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
Материалы и методы
В работе использованы пробы фекалий больных вирусными гепатитами А и В, кишечными инфекциями и пробы фекалий, полученные от лиц, контактировавших с больными ВГА, а также пробы из объектов внешней среды: водопроводной воды, открытых водоемов, смывов с поверхностей (кухонной мебели, посуды и др.), канализационных стоков, очистных сооружений.
Биологическим сырьем при конструировании диагностических препаратов для детекции вируса ГА служили иммунные сыворотки крови больных ВГА в стадии реконвалесценции. Контроль титра специфических антител класса в к вирусу ГА в сыворотках крови осуществляли методом ИФА с помощью диагностической тест-системы «Вектогеп А-1§0-Стрип» (Новосибирск). Иммуноглобулины класса в выделяли методом двойного осаждения сернокислым аммонием [9]: Иммунопероксидазный конъюгат получали' методом перйодатного окисления [11]. Композиционные гепатитные МИС'на основе алюмосиликата) конструировали по способу И.В.Жарниковойисоавт. [2]. Ь'
Селективное концентрирование исследуемого патогена на поверхности МИС осуществляли следующим образом: во флаконы (типа пенициллиновых) вносили по 50 мкл 10 % взвеси гегГатитных МИС и 200 мкл фекалий. Инкубировали при температуре 37 °С в течение 30 мин. Затем МИС/грижды промывали фосфатно-солевым буфером ^|фСБ), pH 7,4, с добавлением 0,05 % твина-20, придерживая постоянным магнитом флакон с сорбентом.) Далее ресуспендировали МИС в 200 мкл ФСБ'й дёли-ли пробу пополам для дальнейшего проведения ИФА и ПЦР.
При проведении сочетанного метода МИС+ИФА аналогичную операцию проводили с положительным и отрицательным контролями, при этом в качестве положительного контроля использовали инактивированный антиген вируса ГА, полученный в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, в качестве отрицательного - фосфатно-солевой буфер.
Далее во флаконы добавляли по 100 мкл имму-нопероксидазного конъюгата, выдерживали 20 мин при температуре 37 °С, затем отмывали 5-6 раз, как огрсано) выше, после чего вносили 200 мкл суб-страт-индикаторного раствора во флакон с отрицательным контролем и засекали время реакции. Как только содержимое флакона начинало слегка желтеть, его в количестве 100 мкл переносили в лунку микропланшета с помощью автоматического дозатора (осторожно, не захватывая сорбент) и останавливали реакцию добавлением 50 мкл 2 М. раствора
серной кислоты. Аналогичную операцию проводили с положительным контролем и опытными образцами. Время инкубации МИС с хромогеном в отрицательном контроле и опыте должно быть строго одинаковым. Время регистрации результатов 1-3 мин. Учет результатов проводили при длине волны 492 нм на регистрирующем устройстве Мультискан. Величина оптической плотности (ОП) положительного контроля составляла не менее 1,0. Положительными считали пробы, если их ОП в 2 и более раз превышала ОП отрицательного контроля. Продолжительность анализа составляла 45-50 мин.
Пробы, полученные из объектов внешней среды с помощью специальных приспособлений - магнитных ловушек, на которые было нанесено 200 мкл гепатитных МИС, отмывали и делили пробу пополам. Продолжительность ИФА при этом составляла 25-30 мин.
Для проведения ПЦР-анализа использовали диагностическую тест-систему «АмплиСенс НАУ-430» (производства ЦНИИЭ, Москва), предназначенную для выявления РНК вируса ГА в плазме периферической крови и фекальных экстрактах.
Результаты и обсуждение
В экспресс-иммуноанализах композиционные магнитные иммуносорбенты, представляющие собой заданную геометрическую структуру с активированной поверхностью и иммобилизованными иммуноглобулинами, выступают в качестве твердой фазы, значительно увеличивая специфичность и чувствительность анализа за счет селективного концентрирования инфекционного агента на своей поверхности. Проведение сочетанного метода МИС+ИФА осуществляли по схеме, представленной на рис. 1.
I Сочетанный метод селективного концентрирования на ^МИС с последующим проведением ИФА Сбыл успешно применен во время крупной вспышки вирусного гепатита А в ст. Зеленчукской Карачаево-черкесской Республики в январе-феврале 2004 г. с общим числом заболевших 192 чел. Массовое заражение вирусом ГА в ст. Зеленчукской произошло в середине декабря 2003 г., когда были все предпосылки для загрязнения водопроводной воды: аварии на водопроводной и канализационной сетях, отклю-
Рис. 1. Схема проведения сочетанного метода МИС+ИФА
чение электроэнергии на водопроводной станции.
После регистрации первого случая заболевания проводилось не только активное выявление больных, но и исследование проб из объектов внешней среды с целью обнаружения источника инфекции. Традиционным методом ИФА и сочетанным МИС+ИФА исследованы 10 проб смывов с поверхности кухонной мебели, дверных ручек и других объектов, 26 проб водопроводной воды, полученных с использованием магнитных ловушек из кафе, детских садов, школ, магазинов, хлебопекарен, и одна проба из канализационного стока. Методом ИФА положительных проб не выявлено, а при проведении сочетанного метода МИС+ИФА в четырех пробах водопроводной воды обнаружен антиген вируса ГА. Такими же методами исследовано 12 проб фекалий контактных лиц декретированных профессий (пищевиков). В «сэндвич-варианте» ИФА антиген вируса ГА не обнаружен. После проведения селективного концентрирования проб фекалий на МИС и последующего проведения ИФА во флаконах специфический антиген выявлен в двух пробах. В последующем на основании дополнительных лабораторных анализов больным был поставлен диагноз «Инаппарантная форма гепатита А».
В последние годы в клинической практике широко используется ПЦР-диагностика, основанная на детекции специфических участков ДНК и РНК возбудителей различных заболеваний. При лабораторной диагностике вирусных гепатитов этот метод является одним из основных. В частности, использование ПЦР при ведении пациентов с вирусными гепатитами позволяет более точно установить клинический диагноз, уточнить активность гепатита [1]. С помощью ПЦР можно не только определить этиологию вирусного гепатита, но и с высокой достоверностью судить о репликативной активности вируса, выявлять момент его интеграции в геном клетки, оценивать механизмы формирования хронического гепатита и вирусоносительства [7].
При проведении исследований материала с целью выявления вируса, геном которого представлен РНК, необходимо выполнение дополнительного
Рис. 2. Схема проведения сочетанного анализа МИС+ОТ-ПЦР
этапа получения комплементарной ДНК (кДНК) на матрице РНК - реакции обратной транскрипции (ОТ) [6, 10]. При использовании в качестве проб клинического материала особых трудностей в подготовке образцов для постановки ПЦР не возникает. Более сложной задачей представляется обработка проб из объектов внешней среды (пробы из канализационных стоков, очистных сооружений, смывы с поверхностей и т.д.), так как в этом случае необходимо использовать особые методические приемы, позволяющие избавиться от посторонних примесей и максимально сконцентрировать искомую РНК, но всевозможные примеси, находящиеся в объектах внешней среды, способны значительно снижать чувствительность данного метода [5, 8].
Для устранения этих негативных явлений мы объединили два метода: высокоэффективное избирательное концентрирование инфекционного агента на магноиммуносорбенте с последующей постановкой полимеразной цепной реакции, проведя ряд приемов для адаптации этих методов друг к другу. Схема проведения сочетанного метода МИС+ОТ-ПЦР представлена на рис. 2.
Исследование проб фекалий, полученных от контактных лиц декретированных профессий (работники кафе), показало, что применение селективного концентрирования проб на магноиммуносор-бентах повышало чувствительность ПЦР-анализа и способствовало выявлению РНК вируса ГА в фекалиях в конце инкубационного периода болезни. Так; при исследовании 12 проб фекалий традиционным методом ПЦР специфическая РНК не обнаружена, а при проведении сочетанного метода МИС+ОТ-ПЦР в одной пробе выявлена РНК вируса ГА. Спустя несколько дней после обнаружения РНК вируса Г А, у больной развилась манифестная форма заболевания гепатитом А.
При исследовании 37 проб из объектов внешней среды методами ОТ-ПЦР и МИС+ОТ-ПЦР положительных результатов выявить не удалось. В литературе имеются немногочисленные данные о том, что в элюатах воды методом ПЦР выделена РНК вируса ГА [3].
ИФА МИС+ИФА ОТ-ПЦР МИС+ОТ-ПЦР Методы исследования
Рис. 3. Результаты сравнительного исследования различными методами биологического материала и объектов окружающей среды с целью детекции возбудителя гепатита А
Ц - фекалии от контактных лиц,И- объекты окружающей среды
В результате проведенных исследований показано, что применение сочетанных методов детекции возбудителя ВГА позволило обнаружить инфекционный агент в биологическом материале и объектов окружающей среды, который не удавалось обнаружить без селективного концентрирования проб на МИС (рис. 3). Это дало возможность выявить источник инфекции, своевременно его локализовать, провести эпидемиологическое расследование и определить водный характер вспышки ВГА. На основании полученных данных были оперативно приняты оптимальные решения и реализованы конкретные противоэпидемические мероприятия.
Таким образом, показано, что применение маг-ноиммуносорбентов в сочетании с экспрессными методами диагностики (ИФА и ПЦР) повышает чувствительность этих методов, одновременно сокращая время проведения исследований за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что позволяет повысить эффективность противоэпидемических мероприятий.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Блохина Н.П. // Матер. VI Рос. съезда врачей-инфекционистов. - СПб, 2003. - С. 38-39. - 2. Жарникова И.В. Разработка технологии композиционных магноиммуно-сорбентов и конструирование на их основе диагностических тест-систем для иммуноанализа возбудителей чумы и туляремии: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Ставрополь, 1995. -24 с. - 3. Кавина Т.В., Русанова А.К., Иванова Т.Г. и др. // Достижения отечественной эпидемиологии в XX веке. Взгляд в будущее: Тр. конф. - СПб, 2001. - С. 109-110. -
4. Каретный Ю.В., Каганов Б.С., Добротворский И. JI. // Вопр. совр. педиатрии. - 2002. - Т. 1, № 1 . - С. 83-92. -
5.Корсуков В.Н., Гаранина С.Б., Куличенко А.Н. и др. // Матер, науч.-практ. конф., поев. 100-летию образования противочум. службы России. - Саратов, 1997. - Т. 2. - С. 186. -
6.Платонов А.Е., Карань Л.С., Родионова Е.Н. и др. // Совр. технол. в диагн. особо опасных инф. бол.: Матер. 4-й Межгос. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. -Саратов, 2003. - С. 144-146. - 7. Учайкин В.Ф., Нисевич Н.И., Чередниченко Т-В. Вирусные гепатиты от А до TTV у детей. - М.: Новая волна, 2003. - 432 с. - 8. Филиппов Н.И., Тихвинский ,М.С., Воробьев А.А. и др. // Диагн., лечение и профил акт. опасных инф. забол. Биотехнология. Ветеринария: Матер, юбил. науч. конф., поев. 70-летию НИИ микробиол. МО РФ. - Киров, 1998. - С. 244. - 9. Фримёль Г. (Friemel Н.). Иммунологические методы / Пер. с нем. - М., 1987. - С. 390-395. - 10. Karan L.S., Sannikova I.V., Platonov А.Е. et at. И Int. Conf. on Emerging Infect. Dis. - Atlanta, 2004. - P. 125. - 11. Nakane P.K., Kawaoi A. // J. Histochem. Cytochem. - 1974. - Vol. 22, N 4. - P. 1084-1091.
N.F.Vasilenko, S.N.Stepanova, V.I.Yefremenko, E.N.Afanasyev, E.I.Yeremenko, O.I.Tsygankova
The Use of Combined Express Methods of Diagnosis to Detect Hepatitis A Virus
Stavropol Anti-Plague Research Institute, Stavropol State Medical Academy
Combined methods of express-diagnosis of viral hepatitis A based on selective concentration of the virus on the surface of magnet immune sorbents (MIS) followed by immuno-enzyme analysis (ША) and polymerase chain reaction with reverse transcription (RT-PCR) tests were developed by the authors. Application of MIS in combination with the express-diagnosis methods (IEA and PCR) was shown to increase the sensitivity of the methods in parallel with reducing the time of the experiments due to introducing more rapid manipulations and elimination of some stages of the analysis, thus enhancing the efficacy of the anti-epidemic measures.
Key words’, hepatitis A, antigen, viral RNA, immuno-enzyme analysis, polymerase chain reaction, magnet immune sorbents, combined method.
Поступила 21.07.05.
УДК 616.24-022-022:616.9:616.07 .
Г.Л.Карбышев1, А.Н.Терентьев1, Е.В.Безуглова1, И.Р.Симонова1, А.П.Кочеткова1,
В.Я.Склярская2, А.А.Матер3
КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА.
Сообщение 2. Испытания легионеллезного серогруппы 1 антигенного полимерного диагностикума для реакции объемной аггломерации в практике лабораторной диагностики пневмоний
1 Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт,
2Городской пульмонологический центр,3Областная клиническая больница, Ростов-на-Дону
В работе обобщены результаты использования реакции объемной агломерации с диагностикумом легионел-лезным серогруппы 1 антигенным полимерным для диагностики заболеваний органов дыхания в пульмонологических стационарах за период с 1997 по 2004 год. Проведен сравнительный анализ трех методов диагностики: реакции непрямой иммунофлюоресценции, иммуноферментного метода й реакции объемной агломерации. Показано, что разработанный в Ростовском НИПЧИ диагностический препарат, для РАО является надежным серологическим методом подтверждения клинического диагноза легионеллеза. ,
Ключевые слова: легионеллез, диагностикум.
Первые случаи заболевания легионеллезом в Ростове-на-Дону были выявлены в 1990 г. [3]. По данным литературы, частота выявления случаев легионеллеза среди больных пневмонией колеблется
от 10,7 до 12,2 % [4, 5, 6, 7]. При обследовании здорового населения пределы таких колебаний значительно шире и связаны как с тактикой эпидемиологического надзора (активный или пассивный), так и
