CC BY
229
123. Robinson V.L., Oyston P.C., Titball R.W. FEMS Microbiol. Lett. 2005; 252: 251-6.
124. Russell P., Eley S.M., Hibbs S.E. et al. Vaccine. 1995; 13: 1551-6.
125. Sabhnani L., Manocha M., Tomar D. Int. Immunopharmacol. 2003; 3: 1413-8.
126. SchützeH. Br. J. exp. Pathol. 1932; 13: 284-8.
127. SchützeH. Br. J. exp. Pathol. 1939; 19: 293-8.
128. Sebbane F., Jarrett C.O., Gardner D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103: 5526-30.
129. Sha J, AgarS.L., Baze W.B. et al. Infect. Immun. 2008; 76: 1390-409.
130. SkrzypekE., HaddixP.L., Plano G.K, StraleyS.C. Plasmid. 1993; 2: 160-3.
131. SmileyS.T. Immunol. Rev. 2008; 225: 256-71.
132. Sodeinde O.A., Subrahmanyam Y.V., Stark K. Science. 1992; 258: 1004-7.
133. SpivackM.L., FosterL, LarsonA. et al. J. Immunol. 1958; 80: 132-41.
134. Straley S.C., Harmon P.A. Infect. Immun. 1984; 45: 655-9.
135. StrongR.P. J. Med. Res. 1908; 18: 325-46.
136. Sun W., Roland K.L., Branger C.G. et al. PLoS One. 2009; 4: e6720.
137. Sun W., Wang S., Curtiss R. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74: 4241-5.
138. Szaba F.M., Kummer L.W., Wilhelm L.B. Infect. Immun. 2009; 77: 4295-304.
139. Tapping R.I., Omueti K.O., Johnson C.M. Biochem. Soc. Trans. 2007; 35: 1445-8.
140. Taylor J. Indian Med. Res. Memoirs. 1933; 27: 1-125.
141. Taylor V.L., Titball R.W., Oyston P.C.F. Microbiology. 2005; 151: 1919-26.
142. Tidhar A., Flashner Y., Cohen S. et al. PLoS One. 2009; 4: e7023.
143. Tripathi V., ChitralekhaK.T., BakshiA.R. Vaccine. 2006; 24: 3279-89.
144. Turner J.K., McAllister M.M., Xu J.L., Tapping R.I. Infect. Immun. 2008; 76: 4092-99.
145. Une T., BrubakerR.R. J. Immunol. 1984; 133: 2226-30.
146. Van Amersfoort E.S., Van Berkel T.J., Kuiper J. Clin. Microbiol. Rev. 2003; 16: 379-414.
147. ViboudG.I., Bliska J.B. Annu. Rev. Microbiol. 2005; 59: 69-89.
148. Von Metz E., Eisler D.M., Hottle GA. Appl. Microbiol. 1971; 22: 84-8.
149. Wake A.P. In: Skamene E., Landy P.A.L. (eds), Genetic control of natural resistance to infection and malignancy. 1st ed. New York:
Academic Press; 1980: 179-84.
150. WalkerR.V. J. Immunol. 1962; 88: 164-73.
151. Weening E.H., Cathelyn J.S., Kaufman G. et al. Infect. Immun. 2011; 79: 644-52.
152. Welkos S., Pitt M.L.M., Martinez M. et al. Vaccine. 2002; 20: 2206-14.
153. WilliamsonE.D. J. Appl. Microbiol. 2001; 91: 606-8.
154. Williamson E.D., Flick-SmithH.C., Lebutt C. Infect. Immun. 2005; 73: 3598-608.
155. Wimsatt J., Biggins D.E. J. Vector Borne Dis. 2009; 46: 85-99.
156. Wong J.F., ElbergS.S. J. Infect. Dis. 1977; 135: 67-78.
157. World Health Organization. Plague vaccine. Recommendation of the Immunization Practices Advisory Committee. Wkly Epidemiol. Rec. 1982; 43: 332-3.
158. Yersin A. Ann. Inst. Pasteur. 1894; 8: 662-7.
159. Yersin A., Calmette A., Borrel A. Ann. Inst. Pasteur. 1895; 9: 589-92.
160. Zauberman A., Tidhar A., Levy Y. et al. PLoS One. 2009; 4: e5938.
161. Zav'yalov V.P., Denesyuk A.I., Zav'yalova G.A., Korpela T. Immunol. Lett. 1995; 45: 19-22.
162. Zhang S.S., Park C.G., Zhang P. J. Biol. Chem. 2008; 283: 31511-21.
163. Zietz B.P., Dunkelberg H. Int. J. Hyg. Environ. Health. 2004; 207: 165-78.
Поступила 07.07.12
A MOLECULAR BASIS OF THE PLAGUE VACCINE DEVELOPMENT
S. V. Dentovskaya, P. Kh. Kopylov, S. A. Ivanov, S. A. Ageev, A. P. Anisimov
State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Moscow Region, Russia
Molecular mechanisms of the Yersinia pestis pathogenicity and peculiarities ofmaturation of specific immunity to plague are reviewed. The history and modern state of the plague vaccine development are described. Special attention is focused on the prospects in the area of the plague vaccine development. The possible approaches to improvement of vaccine preparations are discussed. Key words: Yersinia pestis, pathogenesis, immunity, vaccine prophylaxis
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 578.891:578.5].083.224:577.21.08
Т.Ю. Бондаренко1,2, В.А. Терновой1,2, С.В. Нетесов1,2
вирус гепатита А: структурно-функциональная организация
ГЕНОМА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА И КУЛьТИВИРОВАНИЕ
1ФБУН ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», пос. Кольцово, Новосибирской области, Россия; ^Новосибирский
государственный университет, Россия
В настоящем обзоре представлен анализ опубликованных данных о вирусе гепатита А (ВГА) - структурно-функциональной организации генома, генотипировании, клинических проявлениях и современных методах диагностики. Обоснована актуальность изучения генетического разнообразия ВГА в связи с возможностью появления новых антигенных вариантов. Рассмотрены и проанализированы результаты культивирования различных штаммов ВГА с прицелом на разработку и производство вакцин и диагностических препаратов. К л ю ч е в ы е с л о в а : вирус гепатита А, РНК, полимеразная цепная реакция с предшествующей обратной транскрипцией РНК - ОТ-ПЦР, культура клеток, вакцина
Гепатит - общее название острых и хронических заболеваний печени, возникающих от различных причин и имеющих разное течение. Инфекционную природу заболевания гепатитом предположил E. Cockayne, анализируя описанные S. McDonald случаи заболевания, сопровождавшиеся желтухой [36, 83]. Разграничение заболеваний печени, характеризующихся разными путями передачи, тяжестью и
длительностью процесса, на гепатит А (ГА) и гепатит В (ГВ) произошло во второй половине XX века [80]. Вирус, вызывающий ГА, был впервые обнаружен с помощью иммуноэлектронной микроскопии в 1973 г. S. Feinstone и соавт. [49]. Адаптировать вирус гепатита А (ВГА) к росту в культуре клеток впервые удалось P. Provost и M. Hilleman [97], что позволило начать детальное исследование вируса и приступить к разработке вакцины.
В РФ большой вклад в изучение ГА и разработку методов лабораторной диагностики и профилактики ГА внесла группа ученых Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН. Промышленное производство диагностических наборов и вакцины от ГА было налажено в начале 90-х годов прошлого века в ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия, Новосибирская обл.,пос. Кольцово), а диагностические наборы на маркеры этого вируса производятся также еще несколькими отечественными компаниями.
В данном обзоре проведен анализ опубликованных данных о структурно-функциональной организации генома ВГА, клинических проявлениях ГА, методах его диагностики и культивирования.
Таксономия
В настоящее время ВГА является единственным представителем рода Hepatovirus, семейства Pi-cornaviridae, порядка Picornavirales [125]. Ранее ВГА относили к роду Enterovirus [63]. Семейство Picornaviridae включает патогены, вызывающие заболевания человека, животных и птиц, такие как полиомиелит и энтерит (полиовирусы и энтеровирусы), энцефаломиокардит у мышей (кар-диовирусы), заболевания верхних дыхательных путей (риновирусы), ящур у животных (афтовирусы) и ГА у людей и некоторых приматов (ВГА). Основная особенность представителей этого семейства - малый размер вирусных частиц, содержащих РНК, откуда и произошло название (pico- очень маленькие, ma -РНК). В диаметре эти вирусы достигают всего 27-32 нм, что соизмеримо с размером рибосом. В настоящее время в семейство включено 13 родов: Enterovirus, Cardiovirus, Rhinovirus, Aphtovirus, Parechovirus, Hepatovirus, Erbovirus, Kobuvirus, Teschovirus, Sapelovi-rus, Senecavirus, Tremovirus, Avihepatovirus и ряд до сих пор неассоциированных в роды вирусов [125].
жизненный цикл ВГА
Основной механизм заражения ВГА - фекально-оральный, реализуемый пищевым, водным и контактно-бытовым путями. Инфекционная доза точно не установлена, но выявлено, что заболевание могут вызвать как минимум 10-100 вирусных частиц [113]. Основная масса вируса реплицируется в печени. Вирус сначала специфично распознает рецепторы клеток, связывается с ними, затем происходят его декапсидация и внедрение РНК в клетку с последующим развитием цикла размножения [67]. Конкретные механизмы данных процессов пока до конца не выяснены.
Рецептор для ВГА (havcr-1) был впервые выявлен G. Kaplan и соавт. в клетках культуры почки африканской зеленой мартышки AGMK (African green monkey kidney). Сам рецептор представляет собой мембранный гликопротеин I класса, который содержит наружный клеточный домен (D1) с иммуноглобулин-подобным районом, богатым цистеинами (Cys-rich), и муциноподобный район (T-cell Ig and mucin domain 1, TIM-1), богатый аминокислотами: треонин, серин и пролин (TSP-rich) [67]. Позднее был найден его гомолог в клетках печени и почки человека - huhavcr-1 [48].
Виремия (вирус в крови) и выделение ВГА с калом наступают раньше появления клинических симптомов и сдвигов в биохимических показателях крови, до разрушения печеночных клеток (рис. 1). Выход новых вирусных частиц из клеток печени происходит с желчью через кишечник в окружающую среду. В фекалиях концентрация может достигать до 109 инфекционных вирионов на 1 г, в крови - до 105 вирионов на 1 мл [113]. Есть информация по выявлению вируса в слюне [81], но надежных эпидемиологических данных о значении слюны в распространении вируса нет. Поскольку виремия при ГА начинается до про-
]Вирус в крови
-1 Вирус в фекалиях
^ Ферменты печени Желтуха
Рис. 1. Динамика развития иммунного ответа анти-ВГА (вверху) и динамика клинических симптомов, лабораторных показателей и детекция вируса в крови и фекалиях в типичном случае заболевания гепатитом А (внизу).
явления клинических симптомов, существует опасность заражения ГА при переливании крови и через препараты крови - иммуноглобулины, факторы свертывания и альбумин [123]. В связи с этим Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов в США (FDA - Food and Drug Administration) предложило проводить обязательное NAT-тестирование (nucleic acid testing - выявление нуклеиновых кислот) донорской крови на ВГА [126].
Таким образом, основным путем распространения ВГА следует считать фекально-оральный, т. е. -через зараженные продукты питания, предметы быта, инфицированную питьевую воду, но иногда отмечается передача вируса и через переливание зараженной крови и ее продуктов, а также через внутривенное введение наркотиков при совместном употреблении шприцев.
Клиническая картина гепатита А
Основными клиническими симптомами ГА являются интоксикация, фебрильная лихорадка, диспепсический синдром (тошнота, рвота, тяжесть в области желудка), гепатомегалия, желтушный синдром (пожелтение кожи и склер, потемнение мочи, обесцвечивание кала).
Степень тяжести течения ГА может варьировать. В раннем возрасте (до 5 лет) ГА протекает легко, часто встречаются безжелтушные и бессимптомные формы. В пожилом возрасте степень тяжести заболевания возрастает, возможны рецидивирующие и затяжные формы, вплоть до смертельного исхода. Доля клинически выраженного ГА среди инфицированных людей увеличивается с возрастом: если у детей до 5 лет она составляет 5-10%, то у взрослых может достигать 50-75% [74]. Для моноинфекции ГА выяснено, что локусы гистосовместимости (HLA) HLA-A1, А10, Cw2 встречаются у пациентов с легкими формами ГА, а тяжелые формы ассоциированы с HLA A2, B5, B8 [1, 6]. При продолжительных формах ГА авторы обнаружили их ассоциацию у носителей аллелей DRB1*1301 [47]. Таким образом, HLA-типирование может быть в принципе использовано для прогнозирования течения заболевания ГА.
Предполагают, что при ГА косвенно стимулируются Т-лимфоциты-помощники 1-го типа, в резуль-
тате чего синтезируются интерлейкин-2, гамма-интерферон, которые запускают лизис инфицированных вирусом гепатоцитов натуральных киллеров [37, 77]. Динамика развития иммунного ответа, клинических симптомов и лабораторных показателей в типичном случае ГА приведена на рис. 1. Ранние антитела (АТ) к ВГА класса ^М появляются спустя 2 нед от контакта с возбудителем, а АТ класса IgG появляются после 21-го дня и служат показателем перенесенной инфекции в прошлом.
ГА, как правило, протекает остро, и по мере выздоровления происходит снижение концентрации вируса в крови до его исчезновения. Длительная экскреция вируса (до 6 мес) наблюдалась у детей раннего возраста, а также у больных с коинфекцией вирусами гепатитов В или С [3, 102]. Известны и редкие случаи длительного и рецидивирующего течения ГА, когда РНК ВГА определялась в сыворотке в течение 6-12 мес и более [23, 39].
Смертельные исходы при ГА редки и наступают, как правило, у больных с фулминантной (молниеносной) формой заболевания [62]. Наиболее часто фулминантный ГА регистрируется на фоне предшествовавших заболеваний, нарушающих нормальное функционирование печени, особенно совместно с заболеванием гепатитом С [115, 116]. Летальный исход при ГА не превышает 0,1% у детей, 0,3% у подростков и взрослых моложе 40 лет, но его процент существенно возрастает у людей старше 40 лет - до 2,1% [116]. В последнее время ввиду появления семейных случаев фулминантного ГА рассматривается возможность генетической предрасположенности [16, 44]. К сожалению, пока широко не проводится HLA-типирование, которое могло бы помочь в прогнозировании течения ГА и применении рациональных схем лечения.
Диагностика
При всех вирусных гепатитах клинические проявления и биохимические показатели, как правило, сходны и уточнение диагноза необходимо проводить лабораторно с помощью специфических иммунодиаг-ностических методов (иммуноферментного анализа -ИФА), позволяющих выявлять антиген (АГ) и АТ к ВГА, и генодиагностических методов (полимеразная цепная реакция с предшествующей обратной транскрипцией РНК - ОТ-ПЦР).
Метод ИФА позволяет выявлять либо анти-ВГА ^М или IgG, либо тотальные антивирусные АТ классов ^М, ^А и IgG.
Последние версии ОТ-ПЦР-тест-систем для выявления РНК ВГА являются высокочувствительными, специфичными и весьма надежными. Существующие тест-системы для генотипирования пока недостаточно специфичны. Поэтому для достоверного генотипирования необходимо определение ну-клеотидной последовательности вирусного генома или его районов. Сравнительный анализ нуклео-тидных последовательностей геномов выявленных изолятов часто позволяет установить источник и даже путь распространения ВГА. Ввиду того что вире-мия наступает ранее клинических проявлений, метод ОТ-ПЦР позволяет выявить вирусную РНК непосредственно при появлении первых симптомов и позволяет выявить возбудителя у вторично зараженных кон-
тактировавших лиц еще до появления симптоматики. При смешанных инфекциях проведение ОТ-ПЦР является особенно актуальным для точной диагностики возбудителя заболевания [4].
Структурно-функциональная организация вириона ВГА
Вирионы ВГА представляют собой сферические частицы диаметром 27-32 нм, состоящие из белковой оболочки (капсида) и упакованной в нее одноцепо-чечной молекулы РНК, и имеют плавучую плотность 1,32-1,34 г/см3 в градиенте плотности хлористого цезия [49]. Капсид пикорнавирусов имеет икосаэдриче-ский тип симметрии и состоит из 180 белковых субъединиц, содержащих по 60 копий каждого из трех белков VP1, VP2 и VP3. Предполагается, что белок VP4 находится внутри капсида [119]. Рентгенострук-турный анализ кристаллов вирусных препаратов позволил установить строение вирионов нескольких пикорнавирусов: риновируса человека (тип 14) [103], вируса Менго [79], вируса ящура [14], вируса Тейле-ра [60] и полиовируса [61]. Для ВГА таких опубликованных данных пока нет. Вместе с тем опубликованы данные рентгеноструктурного анализа кристалла вирусной протеазы 3С ВГА [17].
При сборке капсида мономеры трех структурных белков VP2-VP3-VP1 образуют 5Б-тримеры (про-томеры), которые далее организуются в 14Б-пентамеры [20]. Затем 12 пентамерных блоков собираются в 80Б-провирион. В процессе образования зрелого вириона 155Б происходит частичный процессинг ряда полипептидов. В частности, происходят процесс расщепления VP0 ^Р4^Р2) с высвобождением отдельных белков VP2, VP4 и расщепление связи VP1/2A, однако детали этого процесса пока не установлены. Показано, что с расщепления VP1/2A начинается процесс окончательной сборки капсидов. При превращении прокапсида в капсид белки подвергаются значительным конформационным изменениям. Белок VP1 сгруппирован вокруг осей симметрии 5-го порядка и значительно выступает над поверхностью капсида. Белки VP2 и VP3 из различных пентамеров чередуются вокруг осей симметрии 3-го порядка [127]. Стадии процесса упаковки РНК также пока не изучены.
Организация генома ВГА
РНК ВГА, состоящая из примерно 7500 н., имеет скорость седиментации 33Б и относительную плотность 1,64 г/см3 [35, 109]. К 5'-концу РНК ковалентно присоединен белок VPg, а 3'-конец РНК полиадени-лирован - (полиА). Плюс-РНК ВГА выполняет матричные функции для синтеза белков и для синтеза минус (-) цепей РНК. Нуклеотидный состав генома ВГА характеризуется самым низким среди представителей семейства пикорнавирусов содержанием GC - 38% [91]. Схема строения генома и процессинга белков ВГА приведена на рис. 2. Геном содержит 5'-и 3'- нетранслируемые области (НТО). Единственная открытая рамка считывания кодирует полипротеин с молекулярной массой около 250 кД, длиной около 2228 а. о., который котрансляционно расщепляется клеточными и вирусспецифической протеазами 3С-рго (3С-рго выщепляется автокаталитически) на структурные (УР1, VP2, VP3 и VP4) и неструктур-
1000
—h-
2000
—h"
3000
—h-
4000
—h"
5000
—h"
6000
—h-
7000
—b-
P1
P2
P3
5'UTR
> VS'I
1В VP2> 1С VP3 я 1DVP1
1AVP4
2A
2C
3C
3D
2B ЗА 3B
Рис. 2. Схема организации генома ВГА.
ные (2А, 2В, 2С, 3A, 3B, 3C и 3D) белки. Существует 2 близкорасположенных AUG-кодона (735-737 н., 741-743 н.), при этом у ВГА трансляция начинается с первого кодона [15, 70]. После стоп-кодона (UGA) начинается 3'-НТО длиной 60-80 н., заканчивающаяся полиА-трактом [29].
Гидроксильная группа тирозина белка VPg (3 В) образует фосфодиэфирную связь с фосфатом первого уридина РНК ВГА [119]. Синтез комплементарной (-) цепи вирусной РНК на матрице начинается с образования нуклеопротеинового комплекса: к затравочному белку VPg сначала нематричным способом присоединяется динуклеотид UU, находящийся на 5'-конце вирусной РНК. Белок 3D-pol (вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза) катализирует ко-валентное связывание уридин-монофосфата с вирусным белком VPg (3В) с использованием первых двух аденинов (АА) консервативной последовательности AAACA цис-элемента репликации. Комплекс 3D-pol и VPgpUpU далее высвобождается и транслоцируется к 3'-концу матрицы с полиА-последовательностью. Предшественник VPgpUpU, таким образом, служит праймером для синтеза (-) цепи [89]. Затем с помощью 3D-pol синтезируется множество копий (+) цепей на матрице новосинтезированной (-) цепи.
Цис-действующие элементы репликации РНК (ЦДЭР) образуют высоконсервативные шпилечные структуры. Известна их локализация в 5'-НТО цис-элемент репликации правый (oriR, origin - начало, Right - правый); в 3'-НТО цис-элемент репликации левый (oriL, origin - начало, Left - левый) и в кодирующей части генома. При этом ЦДЭР в кодирующей части генома имеют разную локализацию у представителей семейства. ЦДЭР у полиовируса локализуется в районе, кодирующем белок 2С [56]. Риновирус содержит ЦДЭР в районе, кодирующем белок VP1 [84]. В отличие от них у ВГА ЦДЭР найден в районе, кодирующем 3D-pol, где был идентифицирован шпилечно-петлевой комплекс из 110 н. с ЦДЭР-мотивом AAACA/G на вершине петли [121].
Нетранслируемые области генома ВГА
10% генома ВГА занимает 5'-НТО, содержащая конформационные структуры РНК с функционально-значимыми участками. Так, с 148 н. от 5'-конца находится IRES (internal ribosome entry site, внутренний сайт посадки рибосом), который обеспечивает кэп-независимое связывание рибосом с РНК ВГА. 5'-НТО является наиболее богатым по содержанию GC районом генома. Первые три петли 5'-НТО РНК ВГА образуют важные и значимые для репликации конфор-мационные домены I, IIa и IIb.
Кроме того, в составе 5'-НТО выделяют полипи-римидиновый тракт (pY1), локализующийся между
(VPg)
99 и 138 н. В нем содержится 95% пиримидиновых оснований. У кардиовирусов и афтовирусов 3'UTR pY1 представлен только полици-у тидиновым трактом [31, 43]. Было показано, что делеция pY1-тракта не приводит к выключению репликации [107]. В то же время делеция района генома 140-144 н. перед IRES оказалась критичной, и без нее репликация не шла [106]. Моделирование pY1-тракта с помощью синтетического олиго-нуклеотида и анализ методом ядерного магнитного резонанса показали неканоническое связывание пар U-U оснований в этом участке генома [65]. У эукари-от часть полипиримидинового тракта - мотив (CCU) n - S. Mitchell рассматривает как сайт, разрешающий взаимодействие IRES с рибосомой [86].
Район 99-204 н. генома ВГА является гипервариабельным среди различных штаммов ВГА, а консервативными считают районы 66-95, 227-267 и 681— 721 н. [15].
Второй пиримидиновый тракт (pY2), называемый олигопиримидиновым (712-720 н.), расположен непосредственно перед инициирующим кодоном [15, 73].
IRES состоит из нескольких консервативных петель и стеблей (домены III, IV и V) и обеспечивает связывание с рибосомой, а также является площадкой для связывания с факторами инициации трансляции хозяина (eIF) [104, 122]. Внутри семейства IRES подразделяют на типы: I тип - у энтеровирусов и ринови-русов; II тип - у кардио-, афто-, парехо- и эрбовиру-сов, а у ВГА он - III типа. Для трансляции с IRES ВГА требуются все факторы инициации, включая eIF4E. Однако в случае проникновения ВГА в клетку фактор инициации eIF4G остается интактным и таким образом не происходит блокирования трансляции белков хозяина. Следует отметить, что в случае проникновения в клетку представителей других родов семейства происходит расщепление eIF4G вирусной протеазой с последующей его инактивацией [22].
У пикорнавирусов репликация направленно инициируется с помощью клеточного полиА-связывающего белка (PABP), который опосредует замыкание РНК-матрицы в кольцо [50]. Некоторые клеточные белки хозяина: полиС-связывающий белок (PCBP2), белок-связывающий полипиримидиновый тракт (PTB) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) задействованы в трансляции. Было показано связывание белка PCBP2 с РНК полиовируса в районе IV домена IRES [58]. Выявлено, что РНК-связывающие домены 1 и 3 KH (K-homologous) белка PCBP2 взаимодействуют с pY1-трактом ВГА [124]. Обнаружено, что протеины PTB и GAPDH конкурируют за связывание с петлей IIIA домена IRES ВГА и могут влиять на трансляционную активность [104].
Короткая 3'-НТО (60-80 н.) с последующим полиА-трактом образует характерные вторичные структуры, в том числе ЦДЭР; она тоже участвует в репликации и связывании с PABP [50, 90]. Было показано, что в клетках, находящихся в разных фазах клеточного цикла, репликационная активность вируса различается. Так, оказалось, что клетки в состояния покоя (G0, G2/M) продуцировали меньшее количество инфекционного
ВГА, чем клетки в G1-фазе (синтез РНК и белков). Варианты ВГА без полиА-трактов имели более короткий период жизни, чем с полиА, и в покоящихся клетках не были способны к репликации. Те же варианты в делящихся клетках вели себя иначе: происходило восстановление полиА-трактов и способности к репродукции потомства [71]. Ввиду вариабельности размеров полиА-тракта существует неопределенность в оценке его длины, и поэтому, как правило, говорят о средней длине полиА-тракта (20-40 н.).
Транслируемые области генома ВГА
Структурные белки ВГА
Стратегия трансляции схожа у всех изученных представителей семейства Picornaviridae. Однако ВГА имеет ряд отличий: отсутствует белок L, у белка 2А не найдено протеазной активности и не происходит расщепления фактора инициации трансляции eIF4G.
Образующийся в результате трансляции вирусный полипротеин расщепляется клеточными протеазами и котрансляционно вирусной протеазой 3С-рго, которая сама выщепляется автокаталитически. По данным A. Rachow, за расщепление VP1/2A ответственна про-теаза хозяина, так называемый фактор Ха - фермент, участвующий в каскаде свертываемости крови [99]. Первичное расщепление VP1/2A происходит в участке 2А/2В, а затем образуются белки VP4-VP2 (VP0), VP3, VP1-2A, которые после расщепления идут на построение капсида. Природа расщепления VP4-VP2 пока до конца не выявлена.
1А-район генома кодирует маленький белок VP4 (23 а. о., 2.5 кД), который участвует в процессе упаковки вирионов; в зрелом вирионе его не находят. Для большинства представителей семейства пикорнави-русов было показано, что остаток глицина на N-конце белка VP4 ковалентно связан с миристиновой кислотой [28]. Хотя последовательность VP4 ВГА содержит консенсусную последовательность для миристиляции (Gly-X-X-X-Ser/Thr), миристиляции у ВГА не обнаружено [114].
Район генома 1D кодирует белок VP1 (263 а. о., 30-33 кД), район генома 1B - белок VP2 (222 а. о., 2430 кД), район генома 1С - белок VP3 (246 а. о., 21-28 кД). Пространственная структура капсидных белков пикорнавирусов имеет архитектуру, известную как «вирусная бета-складка/бочка» (viral beta-barrel fold), и содержит 8 антипараллельных бета-тяжей со специфической топологией их соединения по типу греческого ключа [76]. Предполагаемая модель третичной укладки VP1 ВГА была рассчитана по аналогии со структурой белка VP1 риновируса и приведена в [85]. К сожалению, пока нет опубликованных данных рентгеноструктурного анализа кристалла ВГА, чтобы уверенно судить о структуре вириона.
Белок VP1 является наиболее поверхностно-доступным в созревшем вирионе. С помощью моно-клональных АТ были выявлены аминокислоты, образующие основной иммунодоминантный участок в белке VP1 [94, 95, 110]. Также много работ было посвящено поиску антигенных детерминант ВГА с помощью синтетических пептидов и рекомбинантных белков [8, 69]. В последнее время появились работы об обнаружении новых антигенных вариантов ВГА. Так, вари-
ант ВГА иги-3 из Уругвая имел делецию (45 а. о.) в белке VP1 [32]. В Албании были найдены аллельные варианты ВГА с отличиями в 46 а. о. в белке VP3 у 7 изолятов, и 23 а. о. в белке VP1 у 6 изолятов [53]. Вариант Тип31-03 из Туниса имеет большую делецию (38 а. о.) в белке VP1, локализующуюся между 150 и 187 а.о. Другой антигенный вариант Тип36-03, выявленный от пациента с фулминантной формой, имел замену ТЫг(10)^-Рго в VP1 в районе предполагаемого антигенного эпитопа [54]. Являются ли они вакциноиз-бегающими, пока неизвестно, но их отличия от обычных вариантов ВГА весьма значительны. Выявление новых антигенных вариантов ВГА требует проведения долговременного молекулярно-эпидемиологического мониторинга и в некоторых случаях экспериментального исследования на обезьянах на устойчивость к существующим вакцинам.
Неструктурные белки ВГА
Белки полипротеинов Р2 - 2А (71 а. о.), 2В (251 а. о.), 2ВС-предшественник и белок 2С играют важную роль в репликации. Белок 2С (335 а. о.) обладает хели-казной активностью, нуклеозидтрифосфат гидролаз-ной, нуклеотидсвязывающей и, по последним данным, серинсвязывающей активностями. Белки 2С и 2ВС обнаруживают связанными с цитоплазматическими везикулами, образующимися в инфицированных клетках в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) [57, 72].
Полипротеин Р3 включает белки 3А (72 а. о.), 3В (23 а. о.), 3С (219 а. о.) и 3D (489 а. о.). Белок 3А играет ключевую роль в образовании репликативного комплекса. Имея гидрофобный домен, погруженный в мембрану, он удерживает репликативный комплекс на мембране ЭПР. Показано связывание белков 3А и 3АВ с 3D-pol [42]. Для 3АВС-предшественника обнаружено взаимодействие с Па-доменом 5'-НТО полиовируса. Белок 3В (У^) образует ковалентную связь с первым уридином 5'-НТО (+) цепи и является частью праймера для инициации репликации [89].
Белок 3С-рго участвует в протеолитическом расщеплении полипротеина, а также задействован в репликативном комплексе. Каталитическая триада фермента состоит из His-40, Asp-71 (для афтови-русов и кардиовирусов) или Glu-71 (энтеровиру-сов и риновирусов) и Cys-147 в отличие от серина в клеточных протеазах. Сайт связывания 3С-рго с РНК- (K/R)(V/F)RDI используется при инициации репликации [89]. Результаты рентгеноструктурного анализа кристалла белка 3С ВГА показали, что он структурирован в виде двух Р-складок, подобно хи-мотрипсину [17, 105].
Белок 3D-pol - вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp, RNA-dependent RNA-polymerase) -является главным ферментом процесса репликации и способен распознавать специфические нуклеотидные последовательности на 3'-концах как (+), так (-) РНК-цепей, обеспечивая инициацию синтеза и элонгацию новых цепей РНК. С помощью рентгеноструктурного анализа была определена третичная структура белка 3D-pol полиовируса [64].
Таким образом, опубликованные данные позволяют выделить определенные районы генома и белки вируса, взаимодействующие между собой и с системами хозяина. Однако необходимы дальнейшие исследования в этом направлении.
Генотипы и географическое распространение ВГА
ВГА считается антропонозным патогеном и встречается повсеместно. Наиболее высокая заболеваемость ГА регистрируется в развивающихся странах Азии и Африки. Важной задачей здравоохранения является предотвращение путей передачи ГА через импорт овощей, фруктов и морепродуктов [128]. По частоте встречаемости выявленных у населения к ВГА АТ Россия относится к странам со средним уровнем заболеваемости ГА [129]. Ввиду наличия только одного сероварианта, регистрируемые у населения к ВГА АТ не позволяют выявлять различий между изо-лятами ВГА.
В 1992-1993 гг. 152 изолята ВГА от больных людей и обезьян были впервые сгруппированы в 7 генотипов на основании данных сравнения последовательностей 168-нуклеотидного фрагмента генома ВГА, кодирующего части белков VP1/2A [75, 101]. В настоящее время различают 6 генотипов ВГА, при этом генотип объединяет штаммы с идентичностью нуклеотидных последовательностей более 85%. Генотипы I—III вызывают ГА у людей, а IV—VI циркулируют у обезьян [34]. В свою очередь генотипы подразделяют на субгенотипы А и B с вариабельностью в пределах 7,5%. Генотип !А считают преобладающим и к нему относят около 80% выявленных у людей изолятов ВГА [93]. В настоящее время это связывают с тем, что именно при ГА, вызванном вирусами генотипа !А, наиболее выражена виремия [33]. Не исключено также, что это может быть связано с чувствительностью имеющихся тест-систем для генотипирования, настроенных в основном на выявление ВГА генотипа !А.
Наиболее хорошо изучены представители ВГА субгенотипов IA и Ш. Среди них идентифицирован новый вариант субгенотипа Ш, циркулировавший в 2000—2002 гг. в Южной Италии, который характеризовался тем, что у него, как и у штаммов генотипа IA, в районе 788 а. о. белка VP1 находится Arg вместо Lys [27]. Одновременная циркуляция двух субгенотипов IA и Ш была выявлена во время эпидемий ГА в Болгарии и Бразилии [100, 118].
Исследованы два изолята II генотипа CF53 и SLF88, которые классифицированы на субгенотипы IIA и IIB соответственно [34]. Изолят CF53/Bern ПА генотипа выделен в 1979 г. во Франции и полностью секвенирован группой L. Lu [78]. Изолят SLF88 IIB генотипа выделен в 1988 г. в Сьерра-Леоне; этот вариант был реклассифицирован из VII генотипа после анализа его полной геномной последовательности [32]. Недавно на территории Франции были обнаружены 13 изолятов ПА генотипа, большая часть которых, по-видимому, была завезена из Африки [41].
В ходе расследования ряда вспышек ГА были выявлены изоляты ВГА IIIA генотипа, такие как GA76 (Georgia/GA76/1976) в США, P27 и NOR-21 в Европе [32, 68, 112]. Вирусы IIIA генотипа были причиной вспышек заболевания среди получателей внутривенных лекарств и наркоманов в Швеции (1979—1985 гг.), Норвегии (1997—1998 гг.), США, Великобритании и Эстонии (1998—1999 гг.). Представители данного генотипа были обнаружены в партиях VIII фактора свертываемости крови, который получали больные гемофилией [111]. Изолят PA21, принадлежащий к IIIA
генотипу, был первоначально изолирован от обезьяны (owl monkey) в питомнике Панамы в 1980 г. [26] и изначально рассматривался как ВГА обезьяны, который существенно отличался от известных к тому времени изолятов, выделенных от человека. Но вскоре были выявлены близкородственные ему изоляты у людей, больных гепатитом, в Юго-Восточной и Центральной Азии (Индия, Непал, Шри-Ланка и Малайзия) [66]. Выявлено несколько десятков изолятов ВГА IIIA генотипа в России и Японии [40, 46]. В Японии обнаружено несколько изолятов ШВ субгенотипа ВГА: HAJ85-1, HA-JNG06-90F, KRM003G72, KRM238G59 [46].
Если у обезьян могут встречаться варианты ВГА III генотипа, свойственные человеку, то IV-VI генотипы ВГА циркулируют только у обезьян [32]. Так, изолят CY-145 (Macaca/Philippines/CY-145/1988) IV генотипа обнаружен у макак на Филиппинах [87]. Представителем V генотипа ВГА является изолят AGM-27 из Кении (Cercopithecus/Kenya/AGM-27/1985). Недавно исследован очень схожий с данным вариантом изолят из Индии (2008 г.) IND-SHAV, который был изолирован от макак (Rhesus monkey), при этом гомологии ну-клеотидных и аминокислотных последовательностей изолятов IND-SHAV и AGM27 были 99,8 и 100% соответственно [18].
Представителем VI генотипа ВГА является изолят JM55 (Macaca fascicularis/Indonesia/JM55/1985), который был выделен от макак в Индонезии [87].
Заболеваемость ГА в разных регионах РФ различается, причем она заметно выше в южных и восточных регионах России. На исследованных территориях РФ чаще выявляются изоляты IA субгенотипа ВГА [12, 40]. В течение 1997-2003 гг. молекулярную эпидемиологию ВГА изучали в Санкт-Петербурге и Карелии, где в клинических пробах и образцах из окружающей среды были сначала выявлены изоляты IA субгенотипа. Затем в 2001-2003 гг. у получателей внутривенных лекарств были идентифицированы IA и IIIA субгенотипы ВГА. Среди 88 изолятов I генотипа только один имел субгенотип IB [40]. На территории Сибири (2001-2002 гг.) среди 101 выявленного изолята ВГА был обнаружен только IA субгенотип [12]. В Якутии (2004-2005 гг.) среди 37 исследованных больных ГА у 24 был выявлен IIIA субгенотип ВГА, у остальных 13 был обнаружен IA субгенотип [7].
Остается открытым вопрос о связи тяжести течения ГА с генотипом ВГА и вариациями в различных частях генома ВГА. В Санкт-Петербурге Е.В. Эсаулен-ко и соавт. наблюдали у больных с ГА, вызванным ВГА IA генотипа, различной степени тяжести заболевания [13]. При сравнительном анализе различных форм ГА в Японии, включая фулминантные формы, было отмечено, что тяжесть заболевания ГА ассоциирована с вариациями в 5'-НТО геномов ВГА [52].
Для вирусов, имеющих РНК-геном, характерно одновременное присутствие в инфицированном организме множества близкородственных вирусных популяций - «квазивида». Это происходит из-за отсутствия корректирующей активности вирусной РНК-полимеразы и отсутствия репарации вирусной РНК в хозяйской клетке. При этом в ходе репликации может происходить отбор некоторых вариантов ВГА, часть которых затем может избежать иммунного давления [92]. Известно, что при репликации РНК-вирусов мо-
гут происходить не только образование и расширение «квазивида», но и рекомбинация и другие перестройки вирусных геномов [55]. ВГА присущи оба вида изменчивости: квазивидовое и рекомбинационное, и на сегодняшний день известно несколько рекомбинантов ВГА. Так, изолят 9F94 (здесь и далее в скобках - номер последовательности генома в базе данных GenBank: AJ519487) оказался рекомбинантом, он был обнаружен у девочки из Франции после каникул в Марокко [34]. При филогенетическом анализе района генома, кодирующего весь VPl-белок, штамм 9F94 был высокогомологичен со штаммом SLF88 (VII, ныне II), а при анализе районов, кодирующих VP2+VP3+VP1, был близок к штамму МВВ (IB). Точка рекомбинации была картирована в районе генома, кодирующего начало белка VP1. Результат рекомбинации штаммов МВВ (IB) и GBM (IA), штамм FG (X83302) имеет точку рекомбинации в районе генома, кодирующего 3D [46].
В последнее время для ПЦР-диагностики и дальнейшего генотипирования, кроме района, кодирущего VP1/2A, применяют также ОТ-ПЦР и секвенирование 5'-НТО и районов генома, кодирующих белки VP3 и VP1. Однако выявленные варианты с рекомбинацией геномов вызывают настороженность в достоверности генотипирования по неполной нуклеотидной последовательности геномов ВГА.
Адаптация ВГА к росту в культуре клеток
В начале исследований ВГА его не удавалось нарабатывать на культурах клеток. Первая успешная адаптация ВГА к первичной культуре клеток печени мар-мозеток (Saguinus labiatus) была проведена P. Provost и M. Hilleman, после чего появилась возможность разработки вакцины от ГА [97]. Дальнейшая оптимизация путем подбора типов клеток и температурных условий культивирования позволила повысить уровень наработки ВГА in vitro [21, 98]. Для приготовления вакцинных препаратов в настоящее время апробированы на безопасность и разрешены перевиваемые культуры клеток почки африканской зеленой мартышки (AGMK) [130], клеток фибробластов человека HFS (human fibroblast cell strains) и перевиваемая культура клеток легкого человека MRC-5 (Medical Research Council 5) [38, 51, 108]. В РФ для производства вакцинных препаратов была разработана и аттестована перевиваемая культура клеток «4647» из почки африканской зеленой мартышки (Cercopithecus aethiops), полученная Л.Л. Мироновой и соавт. [10].
Для ВГА характерна медленная скорость репликации в клеточной культуре. У полиовируса репликаци-онный цикл в культуре клеток проходит менее чем за 8 ч, и при этом образуется от 500 до 5000 частиц в одной клетке. Культивирование ВГА в культуре клеток до недавнего времени приводило к образованию до 20 частиц вируса на клетку, а максимальное количество вируса достигалось в течение длительного времени - до 2 мес. Однако при проведении серии последовательных пассажей на культуре клеток из исходной популяции вируса постепенно отбирается часть, более быстро растущая в данной культуре клеток, как это описано в [29, 96]. Обычно ВГА не вызывает цитопатического эффекта на культуре клеток в отличие от других представителей семейства, но
в 1985 г. A. Venuti и соавт. [117] был выделен и охарактеризован первый быстрорастущий штамм ВГА - HHA, который вызывал цитопатический эффект на 7-10-е сутки в культуре клеток Frp/3, являющейся сублинией культуры клеток почки эмбриона макаки резус FRhK (fetal rhesus monkey kidney). Нуклеотид-ная последовательность генома этого штамма была зарегистрирована в GenBank под номером X83302, а штамм был назван FG [19]. Впоследствии были выявлены и другие быстрорастущие в культуре клеток FRhK4 цитопатические штаммы HM175/43C [24] и MB-7 [9]. Штамм МВ-7 был получен из изолята, выделенного от больного ГА в Новосибирске в 1988 г. [9]. После адаптации штамма МВ-7 к культуре клеток 4647 штамм назван MB-7/4647, и была определена его полная геномная последовательность [2].
Применение подобных штаммов с высокой скоростью роста целесообразно при промышленном получении профилактических и диагностических препаратов.
Вакцины и штаммы для их получения
Получение препаратов вируса на культурах клеток в достаточных количествах стимулировало создание профилактических, диагностических препаратов и использование данной модели при скрининге и оценке потенциальных антивирусных препаратов [108]. В разное время были изолированы высокопродуктивные варианты ВГА, на основе которых затем были приготовлены эффективные инактивированные вакцины: «Avaxim» («Pasteur Merieux», Франция) - штамм GBM, «Havrix» («GlaxoSmithKline», Бельгия) - штамм HM-175, «Vaqta» («Merck», США) - штамм CR-326. В России в настоящее время выпускается инактиви-рованная вакцина «Геп-А-ин-Вак» с использованием штамма ВГА HAS-15. Для получения вакцины вирус нарабатывают на культуре клеток, потом его концентрируют, очищают и инактивируют формалином или ß-пропиолактоном. В качестве адъюванта в вакцинные препараты обычно добавляют гидроокись алюминия [11]. Показана безопасность и высокая иммуноген-ность инактивированных вакцин от ВГА [5, 68].
Следует отметить, что китайские исследователи разработали живую аттенуированную вакцину на основе штамма H2, применяемую в Китае [82].
Получена также синтетическая вакцина против ВГА с использованием фосфолипидных частиц с гем-агглютинином вируса гриппа (influenza virosomes (IRIVs)) - «EPAXAL» (штамм ВГА RG-SB XA112 (CNCM I-1080)).
В компании «Glaxo SmithKline» для профилактики гепатитов В и А на базе инактивированной вакцины на основе штамма ВГА HM-175 и рекомбинантного поверхностного АГ (HBsAg) вируса ГВ разработана вакцина «Twinrix» («Glaxo SmithKline») [131]. Выпускаются комбинированные вакцины для защиты от ГА и брюшного тифа: «Vivaxim» («Aventis Pasteur») [132] на основе штамма ВГА GBM и Vi-АГ Salmonella typhi; «Hepatyrix» («Glaxo SmithKline») [131] на основе штамма ВГА HM-175.
Для сравнительного анализа геномов ВГА в качестве прототипного принят изолят HM-175 IB субгенотипа (M14707, Австралия). Изолят HM-175 был выделен из фекалий пациента в Мельбурне (Австралия)
в 1976 г. После нескольких месяцев пассирования его удалось адаптировать к культуре клеток AGMK, при этом адаптированный к культуре клеток вариант рос значительно быстрее, чем природный (дикий). Полная геномная последовательность HM-175/wt была определена и проанализирована R. Najarian и соавт. [88]. После ряда пассажей на культуре клеток AGMK и MRC-5 на его основе был получен штамм, который используется для приготовления вакцины «Havrix». Анализ мутационных отличий штамма HM-175/7 выявил 23 замены в сравнении с геномом HM-175/wt [88]. Различия локализовались в следующих областях генома: одно - в 5'-НТО, 16 - затрагивали район, кодирующий структурные белки; 6 - было в генах, кодирующих неструктурные белки 2B (3889) и 2С (4043, 4087, 4222 и 4563).
У изолята GBM (X75215, Германия) 1А субгенотипа ВГА также были исследованы мутационные изменения при его адаптации к культурам клеток FRhK и HFS. Гомология вариантов GBM/FRhK и GBM/HFS с изолятом GBM была 99,3 и 99,6% соответственно. Ну-клеотидные отличия от изолята GBM у адаптированных GBM/FRhK- и GBM/HFS-штаммов были схожи и локализовались в 5'-НТО и 3'-НТО, а также в районах, кодирующих белки 2B, 3B, 3D. Определяющей в адаптации этого штамма ВГА к культуре клеток, по мнению авторов, явилась мутация в районе, кодирующем белок 2B, в позиции 3889 (C^T, Ala^Val) [45]. У штамма GBM/FRhK были обнаружены делеции в белке VP1 - 6 а. о. и белке 3A - 3 а. о. [59]. Гомология изолятов GBM и HM-175 составила 92% [30]. На основе штамма GBM/HFS производится вакцина «Avaxim».
Изолят CR326 (M10033) IA субгенотипа ВГА был выделен из фекалий больного в Коста-Рике в 1973 г. [96]. Пока известна лишь часть нуклеотидной последовательности его генома, что не дает возможности полностью использовать эти данные при сравнительном анализе полных геномов. На его основе компания «Merck» (США) производит вакцину «Vaqta».
Изолят HAS-15 был выделен из фекалий больного ГА в Фениксе, США, в 1976 г. [25]. После адаптации к росту в культуре клеток FRhK-4 штамм HAS-15 был передан в Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР [120]. Затем он был адаптирован к культуре клеток 4647 и был использован для получения отечественной вакцины «Геп-А-ин-Вак».
Таким образом, благодаря адаптации изолятов ВГА к росту в культуре клеток стало возможным нарабатывать вирус в количествах, достаточных для получения профилактических и диагностических препаратов.
заключение
В последнее время появились работы об обнаружении новых антигенных вариантов ВГА, что требует проведения долговременного молекулярно-эпидемиологического мониторинга с целью выявления потенциальных, устойчивых к вакцине вариантов.
Анализ опубликованных данных позволяет выделить определенные районы генома и белки ВГА, взаимодействующие с системами хозяина. Дальнейшие исследования в этом направлении могут выявить системы и белки хозяина, используемые вирусом для его успешной репликации.
Сходство клинической картины острого периода болезни при всех вирусных гепатитах вызывает трудности при постановке диагноза, что решается с помощью специфических иммунодиагностических и генодиагностических методов.
Остается открытым вопрос о связи тяжести течения ГА с генотипом ВГА и вариациями в различных частях генома ВГА. Выявлены некоторые ассоциации различных форм течения ГА с носительством определенных аллелей гистосовместимости у пациентов, что может быть использовано в будущем для прогноза возможной тяжести клинической картины и разработки более эффективных схем лечения.
Использование штаммов ВГА с высокой скоростью роста в культурах клеток целесообразно при промышленном получении профилактических и диагностических препаратов.
Таким образом, целенаправленное молекулярно-биологическое изучение различных изолятов ВГА позволит уточнить механизмы передачи и распространения вируса, вариабельности генома, включая частоту появления рекомбинантов.
Настоящая работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации для научных школ НШ-2996.2012.4, гранта Фонда МФТИ №00012/00049 «Создание региональной референс-лаборатории для ПЦР-диагностики вирусных гепатитов», госконтракта № 02.740.11.0767 «Выявление вирусных возбудителей заболеваний, актуальных для здравоохранения Западной Сибири (гепатиты, гастроэнтериты, серозный менингит), изучение их генетического разнообразия в целях разработки и совершенствования диагностикумов», договора НГУ с Министерством образования и науки РФ № 11.G34.31.0034 «Новые подходы к разработке лекарств: поиск, отбор и конструирование непатогенных для человека штаммов вирусов, перспективных для использования в качестве онколитических препаратов» и госконтракта № 16.М04.12.0028 Министерства образования и науки РФ «Разработка тест-систем для идентификации генетического материала вирусов - возбудителей инфекций в воде объектов питьевого водопользования».
Сведения об авторах:
Бондаренко Татьяна Юрьевна - канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. молекулярной эпидемиологии ООИ отдела молекулярной вирусологии ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»; e-mail: lemtat@ngs.ru, bondarenko_tyu@vector.nsc.ru;
Терновой Владимир Александрович - канд. биол. наук, зав. лаб. молекулярной эпидемиологии ООИ отдела молекулярной вирусологии ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»;
Нетёсов Сергей Викторович - член-корр. РАН, проф., д-р биол. наук, проректор по научной работе Новосибирского государственного университета.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бондаренко А.Л., Устюжанов В.Н., Вожегова Н.П. и др. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007; 3: 30-4.
2. Бондаренко Т.Ю., Терновой В.А., Святченко В.А. и др. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2010; 1: 33-9.
3. Виноградова Е., Яковлев А.А., Демиденко Т.П. Клиническая медицина. 1996; 74 (9): 29-31.
4. Глухов А.И., Гордеев С.А., АльтшулерМ.Л. и др. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2004; 6: 88-91.
5. Горбунов М.А., Рожков С.Д., Кухарев А.И. и др. Вопросы вирусологии. 1996; 5: 219 -21.
6. ЗмызговаА.В., Тульченецкая Т.А. В кн.: Вирусные гепатиты. М.; 1983: 32.
7. Карандашова И.В., Неверов А.Д., Самсонова В.К. и др. Генотипы вируса гепатита А в Якутии: распространенность и клиническое значение. В кн.: 13-й Международный конгресс по приполярной медицине. Новосибирск; 2006: 126.
8. Кулик Л.Н., Иванов В.С., Чикин Л.Д. и др. Биоорганическая химия. 1994; 20: 709-18.
9. Майданюк А.Г., Тюнников Г.И., Конакова В.Е. и др. Вопросы вирусологии. 1993; 38 (3): 101-5.
10. МироноваЛ.Л., Курбатов А.В., Грачев В.П. и др. Вопросы вирусологии. 1984; 29 (4): 503-6.
11. Таточенко В.К., Озерецковский А.М. Иммунопрофилактика. М.; 2000.
12. Терновой В.А., Чаусов Е.В., Бондаренко ТЮ. и др. Вопросы вирусологии. 2006; 51 (1): 23-7.
13. Эсауленко Е.В., Горчакова О.В., Мукомолов С.Л. и др. Инфекционные болезни. 2006; 7: 541-9.
14. AcharyaR., Fry E., StuartD. et al. Nature. 1989; 337: 709-16.
15. Agol V.I. Adv.Virus Res. 1991; 40: 103-80.
16. Ajmera V., Xia G., Vaughan G. et al. J. Viral Hepat. 2011; 18: e167-74.
17. AllaireM., JamesM. Nat. Struct. Biol. 1994; 1: 505-6.
18. Arankalle V.A., Ramakrishnan J. J.Viral Hepatit. 2009; 16: 214-8.
19. Beneduce F., Pisani G., Divizia M. et al. Virus Res. 1995; 36: 299-309.
20. Bergmann E.M., James M.N.G. Proteolytic enzymes of the viruses of the family Picornaviridae proteases of infectious agents. Alberta, Canada; 1999: 139-63.
21. Binn L.N., Lemon S.M., Marchwicki R.H. et al. J. Clin. Microbiol. 1984; 20: 28-33.
22. Borman A.M., Kean K.M. Virology. 1997; 237: 129-36.
23. Bower W.A., Nainan O.V., Han X. et al. J. Infect. Dis. 2000; 182: 12-7.
24. BrackK, Frings W, Dotzauer A. et al. J. Virol. 1998; 72: 3370-6.
25. BradleyD.W., Schable C.A., McCaustlandK.A. et al. J. Med. Virol. 1984; 14: 373-86.
26. BrownE.A., Jansen R.W., Lemon S.M. J. Virol. 1989; 63: 4932-7.
27. ChironnaM., LopalcoP., PratoR. et al. J. Clin. Microbiol. 2004; 42: 2825-8.
28. Chow M., Newman J.F., Filman D. et al. Nature. 1987; 327: 482-6.
29. Cohen J.I., Ticehurst J.R., Feinstone S.M. et al. J. Virol. 1987; 61: 3035-9.
30. Cohen J.I., Ticehurst J.R., Purcell R.H. et al. J. Virol. 1987; 61: 50-9.
31. Costa Giomi M.P., Gomes I., Tiraboschi B. et al. Virology. 1988; 162: 58-64.
32. Costa-Mattioli M., Cristina J., Romero H. et al. J. Virol. 2002; 76: 9516-25.
33. Costa-Mattioli M., Monpoeho S., Nicand E. et al. J. Viral Hepatit. 2002; 9: 101-6.
34. Costa-Mattioli M., Di Napoli A., Ferre V. et al. J. Gen. Virol. 2003; 84: 3191-201.
35. Coulepis A.G., Locarnini S.A., Westaway E.G. et al. Intervirology. 1982; 18: 107-27.
36. Cockayne E.A. Quart. J. Med. 1912; 6: 1-29.
37. Cui W., Dong Y., Fang F. et al. J. Tongji Med. Univ. 1998; 18: 247-9.
38. Daemer R.J., Feinstone S.M., Gust I.D. et al. Infect. Immun. 1981; 32: 388-93.
39. Dautovic-KrkicS. Med. Arh. 2005; 59: 91-3.
40. Davidkin I., ZheleznovaN., Jokinen S. et al. J. Med. Virol. 2007; 79: 657-62.
41. Desbois D., Couturier E., Mackiewicz V. et al. J. Clin. Microbiol. 2010; 48: 3306-15.
42. DeStefano J.J., Titilope O. J. Virol. 2006; 80: 1662-71.
43. Duke G.M., PalmenbergA.C. J. Virol. 1989; 63: 1822-6.
44. DurstR.Y., GoldsmidtN., Namestnick J. et al. J. Clin. Gastroenterol. 2001; 32: 453-4.
45. Emerson S.U., Huang Y.K., McRill C. et al. J. Virol. 1992; 66: 650-4.
46. EndoK., TakahashiM., MasukoK. et al. Virus Res. 2007; 126: 116-27.
47. Fainboim L., Canero Velasco M.C., Marcos C.Y. et al. Hepatology. 2001; 33: 1512-7.
48. Feigelstock D., Thompson P., Mattoo P. et al. J. Virol. 1998; 72: 6621-8.
49. Feinstone S.M., Kapikian A.Z., Purceli R.H. Science. 1973; 182: 1026-8.
50. Fernandez-Miragall O., Lopez de Q., Martinez-Salas E. Virus Res. 2009; 139: 172-82.
51. Frosner G.G., Deinhardt F., Scheid R. et al. Infection. 1979; 7: 303-5.
52. FujiwaraK., Yokosuka O., Ehata T. et al. Gut. 2002; 51: P. 82-8.
53. Gabrieli R., Sanchez G., Macaluso A. et al. J. Med. Virol. 2004; 72: 533-7.
54. Gharbi-KhelifiH., SdiriK., HarrathR. et al. Virus Genes. 2007; 35: 155-9.
55. Gmyl A.P., Korshenko S.A., Belousov E.V. et al. RNA. 2003; 9: 1221-31.
56. Goodfellow I., Chaudhry Y., Richardson A. et al. J. Virol. 2000; 74: 4590-600.
57. GosertR., EggerD., BienzK. Virology. 2000; 266: 157-69.
58. Graff J., Cha J., BlynL.B. et al. J. Virol. 1998; 72: 9668 -75.
59. Graff J., Normann A., Feinstone S.M. et al. J. Virol. 1994; 68: 548-54.
60. Grant R.A., Filman D.J., Fujinami R.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992; 89: 2061-5.
61. Grant R.A., Hiremath C.N., Filman D.J. et al. Curr. Biol. 1994; 4: 784-97.
62. Gust I.D. Vaccine. 1992; 10 (Suppl. 1): S56-8.
63. GustI.D., Coulepis A.G., Feinstone S.M. et al. Intervirology. 1983; 20: 1-7.
64. Hansen J.L., Long A.M., Schultz S.C. Structure. 1997; 5: 1109-22.
65. Hardin C., Sneeden J., Lemon S. et al. Nucl. Acids Res. 1999; 2665-73.
66. Hussain Z., Das B.C., Husain S.A. et al. Hepatol. Res. 2005; 32: 16-24.
67. Kaplan G., Totsuka A., Thompson P. et al. EMBO J. 1996; 15: 4282-96.
68. Khanna B., Spelbring J.E., Innis B.L. et al. J. Med. Virol. 1992; 36: 118-24.
69. Khudyakov Y.E., LoparevaE.N., Jue D.L. et al. Virology. 1999; 260: 260-72.
70. Koff R.S. Diseases of the liver. Viral hepatitis. Philadelphia: JB Lippincott; 1993: 492-577.
71. Kusov Y.Y., Gosert R., Gauss-Muller V. J. Gen. Virol. 2005; 86: 1363-8.
72. Kusov Y.Y., Probst C., Jecht M. et al. Arch. Virol. 1998; 143: 931-44.
73. Le S.Y., Chen J.H., Sonenberg N. et al. Nuclro Acids Res. 1993; 21: 2445-51.
74. Lednar W.M., Lemon S.M., Kirkpatrick J.W. et al. Am. J. Epidemiol. 1985; 122: 226-33.
75. Lemon S.M., Robertson B.H. Semin. Virol. 1993; 4: 285-95.
76. LiljasL. Curr. Opin. Struct. Biol. 1999; 9: 129-34.
77. Locarnini S. J. Viral Hepatit. 2000; 7 (Suppl. 1): 5-6.
78. Lu L., Ching K.Z., De Paula V.S. et al. J. Gen. Virol. 2004; 85: 2943-52.
79. LuoM., VriendG., Kamer G. et al. Science. 1987; 235: 182-91.
80. MacCallum F.O., Bauer D.J. Lancet. 1947; 250: 691-2.
81. Mackiewicz V., Dussaix E., Le Petitcorps M.F. et al. J. Clin. Microbiol. 2004; 42: 4329-31.
82. Mao J.S., DongD.X., ZhangH.Y. et al. J. Infect. Dis. 1989; 159: 621-4.
83. McDonaldS. Edinburgh Med. J. 1908; 15: 208-9.
84. McKnight K.L., Lemon S.M. RNA. 1998; 4: 1569-84.
85. Mesyanzhinov V.V., Peletskaya E.N., Zhdanov V.M. et al. J. Biomol. Struct. Dyn. 1987; 5: 447-58.
86. MitchellS.A., SpriggsK.A., BushellM. et al. Genes Dev. 2005: 19: 1556-71.
87. Nainan O.V., Margolis H.S., Robertson B.H. et al. J. Gen. Virol. 1991; 72 (7): 1685-9.
88. Najarian R., Caput D., Gee W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985; 82: 2627-31.
89. NayakA., Goodfellow I.G., Woolaway K.E. et al. J. Virol. 2006; 80: 9865-75.
90. Van OoijM.J., Polacek C., Glaudemans D.H. et al. Nucl. Acids Res. 2006; 34: 2953-65.
91. Palmenberg A.C. Comparative organization and genome structure in picornaviruses. In: Brinton M.A., Rneckert R.R. Positive strand RNA viruses. New York; 1987: 25-34.
92. Pilipenko E.V, Blinov V.M., Agol V.I. Nucl. Acids Res. 1990; 18: P. 3371-75.
93. PinaS., ButiM., JardiR. et al. J. Gen. Virol. 2001; 82: 2955-63.
94. Ping L.H., Jansen R.W., Stapleton J.T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988; 85: 8281-5.
95. PingL.H., LemonS.M. J. Virol. 1992; 66: 2208-16.
96. Provost P.J., Bishop R.P., Gerety R.J. et al. J. Med. Virol. 1986; 20: 165-75.
97. Provost P.J., Hilleman M.R. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1978; 159: 201-3.
98. Provost P.J., Hilleman M.R. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1979; 160: 213-21.
99. Rachow A., Gauss-Muller V., Probst C. J. Biol. Chem. 2003; 278: 29744-51.
100. Reuter G., Juhasz A., Kosztolanyi L. et al. J. Med. Virol. 2006; 78: 1392-7.
101. Robertson B.H., Jansen R.W., Khanna B. et al. J. Gen. Virol. 1992; 73 (6): 1365-77.
102. Rosenblum L.S., Villarino M.E., Nainan O.V. et al. J. Infect. Dis. 1991; 164: 476-82.
103. RossmannM.G., ArnoldE., Erickson J.W. et al. Nature. 1985; 317: 145-53.
104. Schultz D.E., Hardin C.C., Lemon S.M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 14134-42.
105. Seipelt J., GuarneA., BergmannE. et al. Virus Res. 1999; 62: 15968.
106. ShafferD.R., Brown E.A., Lemon S.M. J. Virol. 1994; 68: 5568-78.
107. Shaffer D.R., Emerson S.U., Murphy P.C. et al. J. Virol. 1995; 69: 6600-4.
108. Siegl G., deChastonay J., Kronauer G. J. Virol. Methods. 1984; 9: 53-67.
109. Siegl G., Frosner G.G., Gauss-Muller V. et al. J. Gen. Virol. 1981; 57: 331-41.
110. Stapleton J.T., Lemon S.M. J. Virol. 1987; 61: 491-8.
111. Stene-JohansenK., Jonassen T.O., SkaugK. J. Gen. Virol. 2005; 86: 2739-45.
112. Stene-JohansenK., SkaugK., BlystadH. et al. Scand. J. Infect. Dis. 1998; 30: 35-8.
113. Tassopoulos N.C., Papaevangelou G.J., Ticehurst J.R. et al. J. Infect. Dis. 1986; 154: 231-7.
114. TesarM., JiaX.Y., SummersD.F. et al. Virology. 1993; 194: 616-26.
115. Vento S. J. Viral Hepat. 2000; 7 (Suppl. 1): 7-8.
116. Vento S., Garofano T., Renzini C. et al. N. Engl. J. Med. 1998; 338: 286-90.
117. Venuti A., Di Russo C., del Grosso N. et al. J. Virol. 1985; 56: 579-88.
118. Villar L.M., Morais L.M., Aloise R. et al. Braz. J. Med. Biol. Res. 2006; 39: 873-81.
119. Weitz M., Baroudy B.M., Maloy W.L. et al. J. Virol. 1986; 60: 124-30.
120. Wheeler C.M., Fields H.A., Schable C.A. et al. J. Clin. Microbiol. 1986; 23: 434-40.
121. Yang Y, Yi M., Evans D.J. et al. J. Virol. 2008; 82: 10118-28.
122. Yi M, Schultz D.E., Lemon S.M. J. Virol. 2000; 74: 6459-68.
123. Zayc-Schmidt E.M., PichlL., Laue T. et al. Transfusion. 2005; 45: 1037-8.
124. ZhangB., SeitzS., Kusov Y. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007; 364: 725-30.
125. King A.M. et al., eds. Virus taxonomy: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. 1st ed. London: Elsevier; 2011.
126. URL: http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/NewsEvents/ WorkshopsMeetingsConferences/TranscriptsMinutes/default. htm.
127. URL: http://viralzone.expasy.org/all_by_protein/94.html.
128. URL: http://www.cdc.gov/hepatitis/HAV/index.htm.
129. URL: http://wwwnc.cdc.gov/travel/yellowbook/2012/chapter-3-infectious-diseases-related-to-travel/hepatitis-a.htm.
130. URL: http://www.freepatentsonline.com/.
131. URL: http://www.gsk.com/.
132. URL: http://www.sanofipasteur.com/sanofi-pasteur4/.
Поступила 31.10.12
THE HEPATITIS A VIRUS: STRUCTURAL AND FUNCTIONAL ORGANIZATION OF THE GENOME, ITS MOLECULAR DIAGNOSTIC VALUE AND CULTIVATION
T. Yu. Bondarenko12, V. A. Ternovoi1-2, and S. V. Netesov1-2
1 State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia; 2 Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
The analysis of recently published data on hepatitis A virus (HAV) genome clinical features, molecular diagnostic value and cell culture propagation are reviewed. The growing need in the study of the genetic diversity of HAV isolates and the search of its possible new antigenic variants are underlined. The results of the cultivation of different HAV strains are analyzed for possible application in vaccine and diagnostic kit production.
Key words: hepatitis A virus, RNA, RT-PCR, cell culture, vaccine
