CC BY
47
УДК 579.66:547.94
Н. И. Петухова (к.биол.н., доц.), А. В. Митягина (асп.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Синтез полиненасыщенных жирных кислот глицеринустойчивым мутантом Mortierella alpina ГР-1
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
N. I. Petukhova, A. V. Mityagina, V. V. Zorin
Synthesis of polyunsaturated fatty acids by glycerol-resistant mutant Mortierella alpina ГР-1
Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str, 450062, Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
Получены мутанты фикомицета Mortierella alpina 18-1 — продуцента арахидоновой кислоты, способные более эффективно расти на средах с повышенным содержанием глицерина. Исследовано влияние глицерина на рост и липи-дообразование глицеринустойчивого мутанта Mortierella alpina ГР-1. Показано, что данный гриб отличается от исходного штамма более высоким уровнем нелипидных компонентов в клетках. Содержание арахидоновой кислоты в липи-дах обоих грибов сопоставимо (63—65 % от суммы жирных кислот)
Ключевые слова: глицерин; Mortierella alpina; полиненасыщенные жирные кислоты.
The mutant of Mortierella alpina phycomycetes — producer of the arachidonic acid — capable to grow on media with high glycerol content was found. The influence of glycerol on growth and lipid production of glycerol-resistant mutant Mortierella alpina FP-1 was searched. It is shown, that this fungus differs from the original strain by higher level of non-lipid components in cells. The content of arachidonic acid in lipids of both fungi are comparable.
Key words: glycerol; Mortierella alpina; polyunsaturated fatty acids.
Побочным продуктом переработки липи-дов растительного и микробного происхождения, в частности при производстве биодизеля, является глицерин, на основе которого можно получать разнообразные практически важные продукты путем микробного синтеза *'2.
Получение ряда эссенциальных полиненасыщенных жирных кислот, применяемых для лечения и профилактики различных хронических и воспалительных заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания, ревматоидные артриты, астму, экзему, псориаз и рак, также может быть реализовано на основе глицерина 3-9.
Ранее было показано, что при твердофазном культивировании на овсяной среде, содержащей 1% глицерина и 0.01% сульфата
цинка (среда ОГЦ), в липидах фикомицетного гриба Mortierella alpina 18-1 накапливается около 63% арахидоновой кислоты (от суммы жирных кислот) При более высокой концентрации глицерина в среде ускоряется процесс липидообразования, однако рост гриба при этом значительно ингибировался 10.
В настоящей работе на основе гриба Mortierella alpina 18-1 были получены 5 мутантов, образующих на среде с повышенной концентрацией глицерина (3%) более крупные колонии по сравнению с исходным грибом. Исследование выхода биомассы через 20 сут культивирования глицеринустойчивых мутантов показало, что наиболее эффективно в этих условиях рос гриб Mortierella alpina ГР-1 (рис. 1).
Дата поступления 25.10.10
JS
u
СЙ
o %
s
o S
w
35 30 25 20 15105 0
ГР-1 ГР-2
ГР-3 Грибы
ГР-4 ГР-5
35
30 +25 20 15 10 5 -1 0
Рис. 1. Выход двадцатисуточной биомассы грибов при культивировании на среде ОГЦ с 3 % глицерина
В результате исследования влияния глицерина на рост наиболее перспективного гриба Mortierella alpina ГР-1 было установлено, что внесение в среду глицерина в концентрации 1% приводит к увеличению выхода биомассы с
19 до 30.5 г/кг среды (время культивирования —
20 сут). Однако более высокие концентрации глицерина не приводят к дальнейшему увеличению выхода биомассы (рис. 2). В то же время содержание липидов в клетках монотонно увеличивается в области исследуемых концентраций глицерина. Вероятно, липидообразова-ние у данного гриба наиболее активно протекает именно при повышенной концентрации глицерина в среде.
синтеза нелипидных компонентов грибного мицелия является содержание глицерина в среде на уровне 1% (рис. 2).
Следует отметить, что максимальный выход нелипидных компонентов данного гриба оказался почти в 1.6 раза больше, чем у исходного штамма (Morttierella alpina 18-1), тогда как выход липидов, напротив, был ниже в 2.2 раза 10. Это позволяет предполагать, что у исходного гриба менее активен первичный метаболизм, в результате чего большая часть субстрата направляется на синтез запасных веществ (липидов), тогда как у глицери-нустойчивого гриба первичный метаболизм более активен, и субстрат в большей степени расходуется на его обеспечение, чем на синтез запасных веществ.
В результате исследования жирнокислот-ного состава липидов наиболее устойчивого гриба Mortierella alpina ГР-1 методом хрома-томасс-спектрометрии метиловых эфиров жирных кислот были выявлены следующие жирные кислоты: пальмитиновая (16:0), стеариновая (18:0), олеиновая (18:1n9), линолевая (18:2n6), у-линоленовая кислота (18:3n6) и арахидоновая (20:4n6).
Количественная оценка состава липидов 21-суточных препаратов мицелия, полученных выращиванием гриба на среде ОГЦ, содержащей 1% глицерина, показала, что основной жирной кислотой является арахидоновая (рис. 3). На долю этой кислоты приходится около 65% от суммы жирных кислот, что сопоставимо с ее содержанием в липидах исходного штамма
—о— необезжиренная
биомасса —Л— обезжиренная
биомасса —липиды
0 12 3 4 Глицерин, %
Рис. 2. Влияние глицерина на рост и липидообразо-вание гриба Mortierella alpina ГР-1 при культивировании на среде ОГЦ
При низких концентрациях глицерина наблюдалось увеличение содержания нелипид-ных компонентов в мицелии гриба, тогда как при высоких концентрациях, напротив, их доля в клетках снижалась. Оптимальным для
н о
-а
н о
4
о
5 W
(D
и а s
Я
70
60
50-
40
fr 30Н
20
10
¡II
ÍI - _
р
р
р ¿о
о\ й
2
6 6 6 СП
й й й й
сп ^ Tí
¿0 о © о
1 2 2 (N
Рис. 3. Жирно кислотный профиль липидов 21-су-точного мицелия гриба Mortierella alpina ГР-1 на среде ОГЦ, содержащей 1% глицерина
0
Таким образом, в результате проведенного исследования получен новый перспективный продуцент арахидоновой кислоты, отличающийся от исходного штамма более высоким уровнем нелипидных компонентов в клетках.
Экспериментальная часть
Выращивание грибов проводили методом поверхностного культивирования на плотной питательной среде ОГЦ (овсяная крупа — 120 г/л, глицерин 10—40 г/л, сульфат цинка 0.1 г/л) при температуре 25 °С на чашках Петри в течение 21 сут. Питательную среду стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 оС.
Для засева использовали суспензию спор и фрагментов мицелия (2—3-106 фрагментов мицелия и спор/см3), полученную смывом культуры стерильной водопроводной водой со скошенной в пробирках среды Чапека.
Выращенную биомассу собирали, трижды промывали дистиллированной водой и высушивали в сушильном шкафу до постоянного веса при температуре 65 оС. Липиды экстрагировали из сухого мицелия трехкратной обработкой гексаном.
Для определения жирнокислотного состава грибных липидов получали метиловые эфи-ры жирных кислот, как описано в работе 5.
Идентификацию метиловых эфиров ЖК поводили на хроматомасс-спектрометре «НР-5896» с масс-селективным детектором НР-5972А, стеклянной капиллярной колонкой длиной 50 м, 5 % фенилметилсиликона на НР-5, температура ионного источника 120 оС, ускоряющее
напряжение 3 кВ, энергия ионизации 70 еВ. Pe-жим изменения температуры колонки программировали со скоростью 10 град/мин от 50 до 250 оС. Относительное количество жирных кислот в пробе определяли по отношению к внутреннему стандарту — бегеновой кислоте (0.1 мкг/мл в пробе).
Литература
1. Зорин В. В. Петухова H. И., Прищепов Ф. А., Вершинин С. С., Халимова Л. X. и др. // ^ф-тегазовое дело.— 2008.— Т.6, №2.— С. 245.
2. Плетнев M. Ю. // Биотехнология.— 2009.— №1.— C. 3.
3. Paxмaтyллинa Ю. P., Петухова H. И., Авдеева E. H.,. Зорин В. В. // Баш. хим. ж.— 2005.— Т. 12, №1.— С. 49.
4. Петухова H. И., Paxмaтyллинa Ю. P., Яхуто-ва Я. P., Спирихин Л. В., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.— 2006.— Т. 13, №1.— C. 95.
5. Петухова H. И., Paxмaтyллинa Ю. P., Пантелеева С. H., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.—
2007.— Т. 14, №1.— C. 141.
6. Hou C. T. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.—
2008.— V. 35.— P. 501.
7. Ceron Garca M. C., Fernandez Sevilla J. M., Acien Fernandez F. G., Molina Grima E., Garca Camacho F. // J. Appl. Phycol.— 2000.— V. 12.— P. 239.
8. Chi Z., Pyle D., Wen Z., Frear C., Chen S. // Process Biochemistry.— 2007.— V. 42.— P. 1537.
9. Athalye S. K., Garcia R. A., Wen Z. // J. Agric. Food Chem.— 2009.— V. 57.— P. 2739.
10. Paxмaтyллинa Ю. P. Paзpaбoткa метода получения полиненасыщенных жирных кислот: Авто-реф. ... канд. техн. наук.— Казань, 2007.— 20 с.
11. А. С. 968072. СССP / Султанович Ю. А., Шчаев А. П., Барсукова И. А. // Б.И.— 1982.— №39.— С 223.
