CC BY
12УДК: 544.35; 544.971
С. В. Блохина1, М. В. Ольхович1, А. В. Шарапова1, Е. Д. Жирова2
СИНТЕЗ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НОВОГО БИОАКТИВНОГО ФТОРПРОИЗВОДНОГО ТРИАЗОЛ-3-ТИОНА
'Институт химии растворов им. Г. А. Крестова Российской академии наук, Академическая ул., д. 1, 153045 Иваново, Россия. E-mail: svb@isc-ras.ru 2Ивановский государственный химико-технологический университет, Шереметевский пр., д. 7, 153000 Иваново, Россия
Синтезировано новое фторпроизводное триазол-3-тиона как потенциальный нейропротектор. Строение и чистота вещества подтверждены методами 1НЯМР, 13C ЯМР и элементного анализа. Проведено in vitro исследование биологической активности соединения: оценена кальций-блокирующая способность и влияние на функциональную активность AMPA рецепторов. Методом изотермического насыщения измерена растворимость вещества в растворителях, имитирующих среды организма, в интервале температур 293-313 К. С использованием уравнений Вант-Гоффа и Апельблата выполнено моделирование температурных зависимостей растворимости соединения. Определена липофильность синтезированного производного и сделано заключение, что вещество должно обладать хорошей кишечной абсорбцией. На основе рассчитанных термодинамических функций растворения и распределения соединения выполнен анализ влияния энтальпийных и энтропийных вкладов на энергию Гиббса указанных процессов. Изучена проницаемость полученного производного через искусственные лиотропные фосфоли-пидные мембраны. Установлено, что проницаемость синтезированного производного достаточна для прохождения через биологические клеточные мембраны.
Ключевые слова: синтез, производное триазол-3-тиона, биологическая активность, растворимость, липофильность, лиотропные фосфолипидные мембраны, термодинамика.
DOI: 10.18083/LCAppl.2021.2.35
S. V. Blokhina1, M. V. Olkhovich1, A. V. Sharapova1, E. D. Zhirova2
SYNTHESIS AND PHARMACEUTICAL SIGNIFICANT PHYSICAL AND CHEMICAL PROPERTIES OF A NEW BIOACTIVE FLUORINE DERIVATIVE OF TRIAZOL-3-THIONE
:G. A. Krestov Institute of Solution Chemistry of Solutions of RAS, 1 Akademicheskaya St., Ivanovo, 153045, Russia. E-mail: svb@isc-ras.ru 2Ivanovo State University of Chemical Technology, 7 Sheremetevsky Av., Ivanovo, 153000, Russia
A new fluorine derivative of triazole-3-thione has been synthesized as a potential neuroprotector. The structure and purity of the compound were confirmed by 'H NMR, 13C NMR and elemental analysis. The in vitro study of the biological activity of the compound was carried out: the calcium-blocking ability and the effect on the functional activity of AMPA receptors. The shake flask method was used to measure the solubility of the compound in solvents imitating the body's media in the temperature range of293-313 K. The temperature dependences of the compound solubility were modeled using the Van't Hoff and Apelblat equations. The lipophilicity of the compound was determined and it was concluded that it should have a good intestinal absorption. On the basis of the calculated dissolution and distribution thermodynamic functions, the analysis of the influence of enthalpy and
© Блохина С. В., Ольхович М. В., Шарапова А. В., Жирова Е. Д., 2021
entropy contributions on the Gibbs energy of these processes was carried out. The permeability of the compound through artificial lyotropic phospholipid membranes was studied. It was ^found that the permeability is sufficient to pass through the body's biological cell membranes.
Key words: synthesis, triazole-3-thione derivative, biological activity, solubility, lipophilicity, lyotropic phospholipid membranes, thermodynamics.
Введение
Старение населения является глобальным процессом, затрагивающим все страны мира и в том числе Россию. Поставленный диагноз болезни Альцгеймера кардинально ухудшает жизнь как самого человека, так и членов его семьи. В настоящее время не существует препаратов для лечения этого тяжелого заболевания. Исследователи во всех развитых странах продолжают искать средства против болезни Альцгеймера и других прогрессирующих деменций. Накопленные к настоящему времени данные позволяют рассматривать структурный каркас на основе гамма-карбо-линового ядра в качестве базового элемента новой группы нейроактивных препаратов [1]. Объектом настоящей работы являлся 5-[2-(8-фтор-2-метил-2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо[4,3-b]индол-5-ил) этил]-4-метил-2,4-дигидро-1,2,4-триазол-3-тион, представляющий собой гибрид двух фармакофор-ных фрагментов: карболина и триазол-тиона, соединенных этильным линкером. Кроме основных химических центров, синтезированное соединение содержит атомы серы и фтора, повышающие его биоактивность (рис. 1).
Рис. 1. Молекулярная структура исследуемого соединения
Fig. 1. Molecular structure of the studied compound
Химическая структура молекулы является не единственным фактором, влияющим на биологическую активность лекарственного препарата. Лекарственное вещество должно обладать комплек-
сом физических и химических свойств, обеспечивающих его распределение в организме, а следовательно, взаимодействие с ферментами и рецепторами. К важнейшим из этих свойств относятся растворимость, липофильность и проницаемость вещества через липидный слой мембран. Растворимость в биологических средах организма является одной из наиболее важных характеристик лекарственных соединений, поскольку в значительной степени определяет ADME свойства препарата и оказывает влияние на терапевтические дозы и возможные побочные эффекты [2]. Общепринятой характеристикой липофильности молекулы является коэффициент распределения в системе 1-октанол/вода. Коэффициенты распределения в указанной системе рассматриваются как важнейшие физико-химические параметры во всех исследованиях, связанных с токсилогическими свойствами веществ и их фармакокинетическим поведением [3, 4].
Другой важный этап в процессе разработки лекарственных веществ предполагает исследование биодоступности, которая показывает способность молекул проникать через клеточные мембраны, чтобы взаимодействовать с внутриклеточными рецепторами [5]. В биофизических исследованиях широкое применение нашли искусственные фосфолипидные мембраны, которые служат моделью биологических клеточных мембран [6]. Фос-фолипидные везикулы в мембране формируют би-липидный слой, который обладает жидкокристаллическими свойствами: дальним ориентационным порядком и текучестью [7]. Считается, что основная масса липидов в биологических мембранах находится в ламелярной жидкокристаллической фазе. Структурное подобие фосфолипидных мембран и лиотропных жидких кристаллов позволяет использовать их для интерпретации молекулярной структуры и функций различных клеточных тканей и органов [8]. Лекарственные препараты, загруженные в везикулы, позволяют предохранить их от нежелательных воздействий организма, а также снижают побочные эффекты [9, 10].
Цель настоящей работы заключалась в синтезе нового фторопроизводного триазол-3-тиона как потенциального нейропротектора и исследовании его фармацевтически значимых физико-химических свойств - растворимости, липофиль-ности и мембранной проницаемости.
Экспериментальная часть
Синтетической целью работы являлось получение нового соединения ряда у-карболинов, обладающего нейрокорректирующей активностью. Пиридо[4,3-Ь]индол, синтезированный методом Фишера, был присоединен по активированной двойной связи акрилонитрила и затем полученный нитрил переведен в тиоамид. 2,4-Дигидро-1,2,4-триазол-3-тион получали по следующей схеме: пиридо[4,3-Ь]индол присоединяли по активированной двойной связи этилакрилата и затем полученный эфир переводили в соответствующий гид-разид. Последний при взаимодействии с изотиоци-анатом дал триазол-3-тион. В результате проведенных работ был получен 2,4-дигидро-1,2,4-триазол-3-тион с фтором в качестве заместителя. Структура и чистота (> 98 %) синтезированного соединения подтверждены методом :H ЯМР, 13С ЯМР и элементного анализа.
5-[2-(8-Фтор-2-метил-2,3,4,5-тетрагидро-Щ-пиридо[4,3-Ь]индол-5-ил)этил] -4-метил-2,4-дигид-ро-1,2,4-триазол-3-тион. Выход 83 %, Тпл = 215218 °С (этанол). Спектр 1H ЯМР (ДМСО-d/CDCb, 1:1, 5, м.д., Дж/Гц):13,49 (уш.с, 1H, NH); 7,26 (дд, 1H, Harom, J = 8,9; J = 4,4); 7,03 (дд, 1H, Harom, J = 9,8; J = 2,2); 6,84 (тд, 1H, Harom, J = 9,2; J = 2,2); 4,43 (т, 2H, CH2, J = 7,0); 3,52 (c, 2H, MeNCH2); 3,16 (c, 3H, Me); 3,05 (т, 2H, CH2, J = 7,0); 2,75 (м, 4H, MeNCH2CH2); 2,48 (c, 3H, Me). Спектр 13C ЯМР (ДМСО-^6, 5, м.д., Дж/Гц): 166,57; 156,82 (д, J = 231,4); 150,16; 135,47; 132,22; 125,32 (д, J = 10); 109,91 (д, J = 9); 108,06 (д, J = 22); 107,75; 102,33 (д, J = 23); 51,76; 50,99; 45,27; 29,34; 25,67; 21,95. Применение процедуры DEPT 135 позволило обнаружить сигнал, скрытый растворителем. Масс-спектр (m/z): 345 (M+).
Растворимость веществ определяли методом изотермического насыщения в диапазоне температур от 293,15 до 313,15 К. Данный метод заключается в определении концентрации соединения в насыщенном растворе. Избыточное количество соединения добавляли к известному количеству
чистого растворителя. Концентрированные суспензии соединения в каждом растворителе непрерывно перемешивали в воздушном термостате в течение 72 ч. Время осаждения твердой фазы после перемешивания составляло 4 ч. После достижения насыщения аликвоту раствора отбирали и центрифугировали в течение 5 мин при фиксированной температуре. Затем растворы фильтровали. Насыщенный раствор разбавляли соответствующим растворителем до необходимой концентрации. Концентрацию в молярности оценивали, измеряя поглощение на длине волны 329 нм с использованием УФ-спектрофотометра (Сагу-50, США) при комнатной температуре.
Эксперименты по измерению коэффициентов распределения соединения в системе 1-окта-нол/буфер рН 7,4 проводили методом изотермического насыщения при пяти температурах: 293,15; 298,15; 303,15; 308,15 и 313,15 К. Одинаковые объемы буфера, насыщенного 1-октанолом и 1-октанола, насыщенного буфером, с определенной концентрацией соединения, добавляли в пробирку, которую помещали в термостат. Полученный раствор перемешивали для достижения состояния равновесия в течение двух дней. Концентрации препарата в обеих фазах определяли с помощью спектрофотометра Сагу-50 (США) в ультрафиолетовой области спектра (^ = 190-400 нм) с точностью 2-4 %.
Проницаемость синтезированного производного гамма-карболина определяли с использованием искусственных фосфолипидных мембран на основе яичного лецитина. Процедура изготовления мембран была опубликована ранее [11] и заключалась в следующем: фосфатидилхолин из яиц растворяли в смеси хлороформа и метанола с последовательным удалением органических растворителей в вакууме. В результате была получена липид-ная пленка, которая была растворена в фосфатном буфере, содержащем 10 % этанола. Суспензии малых и больших липосом получали фильтрованием через поликарбонатные мембранные фильтры с размером пор 0,4 мкм и 0,8 мкм соответственно. Суспензии липосом адсорбировали последовательно на фильтры с помощью центрифуги. В начале процесса адсорбции небольшие липосомы располагались в порах носителя, а затем более крупные - на его поверхности. Далее для создания плотного барьера из липосом использовался цикл замораживания-оттаивания.
Необходимым условием эксперимента являлась сохранность целостности мембран во время проведения опытов в буферном растворе pH 7,4.
Результаты и их обсуждение
В настоящей работе проведены исследования биологической активности и фармацевтически значимых физико-химических свойств синтезированного 5-[2-(8-фтор-2-метил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо[4,3-Ь]индол-5 -ил)этил] -4-метил-2,4-ди-гидро-1,2,4-триазол-3-тиона, молекулярная структура которого представлена на рис. 1. На кривой ДСК образца соединения наблюдается острый эндотермический пик плавления, который характеризуется температурой начала плавления 272 oC и энтальпией 41,1 кДж- моль-1.
Биологическая активность
Поскольку целевая мишень полученного соединения - глутаматэргическая система ЦНС, то были проведены in vitro испытания его физиологической активности. Оценка кальций-блоки-рующих свойств соединения проводилась на культуре Р2 - фракции синаптосом коры мозга крысят, в которой присутствуют NMDA, каинатные и ме-таботропные рецепторы. Изученное соединение проявило высокую ингибирующую активность
(18 %) в широком концентрационном интервале 0,1-1 цМ, сравнимую с действием лекарственного препарата сравнения Латрепирдина.
Исследование влияния структуры нового производного у-карболина на функциональную активность АМРА рецепторов было проведено на одиночных изолированных нейронах Пуркинье, выделенных из мозжечка головного мозга крыс. Добавление в омывающий нейрон раствор изученного соединения приводило к концентрационно-зависимому изменению амплитуды токов. Максимальная позитивная модуляция АМРА рецепторов была достигнута при концентрации вводимого соединения 10-7 М. Изученное соединение проявило высокую активность в данном тесте (~140 % от контроля).
Растворимость в фармацевтически значимых растворителях
Растворимость изученного соединения была измерена в буферном растворе рН 7,4, 1-октаноле и гексане в интервале температур 293,15-313,15 К (табл. 1). Указанные растворители относятся к фармацевтически значимым: буфер рН 7,4 моделирует среду плазмы крови, 1-октанол своей ам-фифильностью имитирует липидный слой биологических мембран, гексан используется как растворитель при очистке лекарственных веществ.
Таблица 1. Температурная зависимость растворимости исследуемого соединения С (молыл в буфере рН 7,4, гексане и 1-октаноле
Table 1. Temperature dependences of solubility С (mobL-1) of the studied compound in buffer solution pH 7,4, hexane and 1-octanol
T/K Буфер pH 7,4 Гексан 1-октанол
С-104 С-103 С103
293,15 4,66 2,94 1,63
298,15 5,36 3,39 1,97
303,15 6,19 3,85 2,41
303,15 7,04 4,45 2,87
313,15 8,11 5,05 3,47
На рисунке 2 приведены температурные зависимости растворимости изученного соединения в различных растворителях.
Растворимость органических веществ зависит от их протолитических свойств. Исследован-
ное соединение относится к классу у-карболинов, имеет тетрациклическое строение и содержит Н-акцепторный фрагмент (основной атом N в гетеро-цикле) и Н-донорный фрагмент (кислотная вторичная амино-группа).
буфер
Т, "С
Рис. 2. Температурная зависимость растворимости исследуемого соединения в различных растворителях
Fig. 2. Temperature dependence of solubility of the studied compound in different solvents
Рассчитанное с использованием программы ACD/Labs Software V.11.02 значение рКа, равное 9,62, показывает, что изученное вещество является сильной кислотой, что объясняется наличием NH-группы в триазол-тионовом гетероцикле. Содержание ионизированных и неионизированных форм молекул в зависимости от рН водного раствора было определено на основе значений рКа по уравнению Henderson-Hasselbach [12]. Результаты расчетов показали, что молекулы изученного соединения существуют в нейтральной форме при значениях рН < 7,0, а при рН > 7,0 проявляют себя как кислоты и переходит в депротонированную форму. В использованном нами для измерения растворимости буферном растворе рН 7,4 практически все молекулы вещества находятся в нейтральной форме (99 %), что является одним из факторов, объясняющих низкую водную растворимость синтезированного вещества. Растворимость изученного соединения в гексане почти на порядок выше, чем в буферном растворе, но не превышает величины 3,39-10-3 моль-л-1 при стандартной температуре. Поскольку гексан может взаимодействовать с веществами только посредством сил ван-дер-Ваальса, то наличие полярных заместителей и ге-тероциклов в молекулярной структуре растворенного вещества способствует повышению растворимости за счет образования индуцированных диполей и возникающих вследствие этого сил притяжения между растворенным веществом и растворителем. Приведенные в таблице 1 данные свидетельствуют, что растворимость вещества в
1-октаноле также низкая и имеет значения (1,63-3,47)-10-3 моль^л-1 в исследованной температурной области. Установлено, что растворимость соединения в 1-октаноле ниже, чем в гексане. Следовательно, несмотря на наличие активной гидрокси-группы в молекулах 1-октанола и электроотрицательного атома фтора в структуре растворенного вещества, растворимость определяется не возможным образованием водородных связей с растворителем, а неспецифической сольватацией. Отметим, что низкая растворимость изученного соединения в 1-октаноле обусловлена также увеличением ассоциации и мольного объема молекул спирта по сравнению с гексаном, что противодействует внедрению молекул растворенного вещества в свободную полость растворителя.
Моделирование процесса растворения
Для количественного описания зависимости экспериментальной растворимости от температуры были использованы модифицированное уравнение Апельблата и уравнение Вант-Гоффа. Модифицированное уравнение Апельблата [13] широко применяется для получения данных по растворимости различных веществ и выражается уравнением:
ln х = A + -
B
T / К
+ C ln(T / K)
(1)
где х - мольная доля растворенного вещества, Т - абсолютная температура, А, В и С - параметры эмпирической модели, полученные в результате оптимизации [14].
Согласно модели Вант-Гоффа, растворимость соединения в исследуемых растворителях рассчитывается по уравнению [15]:
В
(2)
ln х = A+-
(T / K) '
где х - мольная доля растворенного вещества, A и B - константы модели, рассчитанные с использованием метода наименьших квадратов.
Растворимость исследуемого соединения в различных растворителях, определенная по уравнениям (1, 2), приведена в табл. 2. Коэффициенты модифицированного уравнения Апельблата и уравнения Вант-Гоффа, а также значения отклонений экспериментальных и рассчитанных величин растворимости (RAD и RMSD) представлены в табл. 3.
0,0
40
Таблица 2. Экспериментальная (хЖсп) и расчетная (храсч) растворимость исследуемого соединения в различных растворителях в температурном интервале 293,15-313,15 К
Table 2. Experimental (xexp) and calculated (xcai) solubility of the studied compound in different solvents at the temperatures range of 293,15-313,15 К
Т/К ^эксп Уравнение Апельблата Уравнение Вант-Гоффа
^расч RD ^расч RD
буфер pH 7.4
293,15 8,340 10-6 8,339 10-6 0,0002 8,31410-6 0,0031
298,15 9,600 10-6 9,614 10-6 -0,0014 9,627 10-6 -0,0029
303,15 1,11110-6 1,106106 0,0042 1,10910-6 0,0014
308,15 1,266 10-6 1,27110-6 -0,0040 1,273 10-6 -0,0053
313,15 1,460 10-6 1,458 10-6 0,0015 1,453 10-6 0,0045
Гексан
293,15 3,850 10-4 3,854 10 4 -0,0009 3,840 10-4 0,0026
298,15 4,470 10-4 4,456 10 4 0,0030 4,46110-4 0,0019
303,15 5,11010-4 5,145 104 -0,0068 5,15810-4 -0,0093
308,15 5,960 10-4 5,930 10-4 0,0051 5,935 10-4 0,0042
313,15 6,81010-4 6,823 10-4 -0,0020 6J9910-4 0,0017
1-октанол
293,15 2,51010-4 2,505^10-4 0,0022 2,495 10-4 0,0060
298,15 3,01210-4 3,027^10-4 -0,0058 3,037 10-4 -0,0082
303,15 3,680 10-4 3,653 10-4 0,0072 3,672^10-4 0,0021
308,15 4,390 10-4 4,402 10 4 -0,0028 4,41310-4 -0,0053
313,15 5,299 10-4 5,296 10-4 0,0007 5,273-Ю-4 0,0049
Таблица 3. Параметры модифицированного уравнения Апельблата и уравнения Вант-Гоффа для исследуемого соединения в использованных растворителях
Table 3. Parameters of the modified Apelblat and Van't Hoff equations of the studied compound in the used solvents
Растворитель A B C RMSD 100RAD
уравнение Апельблата
буфер pH 7,4c -75,23 0,6974 10,77 3,29 m-8 0,22
гексан -75,05 0,8126 11,3391 2,23-Ю-6 0,35
1-октанол -111,38 1,7430 17,1008 1,63 m-6 0,37
уравнение Вант-Гоффа
буфер pH 7,4c -2,95 -2564,0 - 4,55 m-8 0,34
гексан 1,08 -2622,2 - 2,54 m-6 0,31
1-октанол 3,42 -3435,1 - 2,05 10-6 0,53
Как следует из представленных данных, значения растворимости, полученные с помощью модифицированного уравнения Апельблата и уравнения Вант-Гоффа, демонстрируют хорошее соответствие экспериментальной растворимости при RAD менее 1 %. Можно сделать заключение, что использованные модели подходят для корреляции растворимости исследуемого соединения в выб-
ранных растворителях. При этом модифицированное уравнение Апельблата имеет меньшие значения ЯМБВ для исследуемых систем.
Коэффициенты активности и избыточные термодинамические функции растворения
Температурная зависимость растворимости вещества описывается следующим термодинамическим соотношением [16]:
ln X = ln xid - ln у =
AH
RT
T - T
_m_
T
f (C - Cs)dT
T J v p P '
■f --^--lny
RT2
(5)
где X, Xid, Y, Tm, AHm, AC = CLv - Cp , R, и T обозна-
чают мольную долю растворенного вещества в растворе, мольную долю растворенного вещества в идеальном растворе, коэффициент активности растворенного вещества, температуру плавления вещества, энтальпию плавления вещества, дифференциальную молярную теплоемкость чистого растворенного вещества, газовую постоянную и экспериментальную температуру. Температура и энтальпия плавления соединения были определены методом дифференциальной сканирующей калориметрии и составили 545,15 К и 41,1 кДж-моль-1, соответственно. Поскольку растворимость или равновесная мольная доля соединения в исследуемых растворителях очень мала, предполагается, что последний член в уравнении (5) равен коэффициенту активности при бесконечном разбавлении 1пуш, который может быть выражен уравнением:
ttE oE ln у»= H--
RT R
(6)
где НЕ и 8Е - избыточная парциальная молярная энтальпия и энтропия.
Поскольку величина АСР может считаться равной нулю, то уравнение (5) упрощается и имеет следующий вид:
AH ,
ln X., =--m ln
RT
T
m
T
(7)
На основании данных, приведенных в табл. 4, можно сделать вывод о положительном отклонении от идеальности (ую> 1,0) во всех исследованных системах. В буферном растворе значения 1пую больше 6, а в гексане и октаноле значения этого параметра немного выше 2 и не превышают 2,7. При более высокой температуре коэффициенты активности соединений в буфере немного увеличиваются, в то время как в органических растворителях они уменьшаются, и процесс растворения становится ближе к идеальному. Такая зависимость значений коэффициентов активности веществ от температуры в водных растворах наблюдалась ранее и обусловлена особенностями структуры воды и ее свойств как растворителя
[17].
Анализ значений Ое, НЕ и ТБЕ исследуемых систем, представленных в табл. 5, позволяет получить информацию о межмолекулярных взаимодействиях в изученных растворах, а также оценить влияние энтальпийного и энтропийного термов на величину GE.
Таблица 4. Температурные зависимости идеальной растворимости (lrnrM<>) и коэффициентов активности при бесконечном разбавлении (ln^) соединения в исследуемых растворителях
Table 4. Temperature dependences of the ideal solubility (lnxid) and activity coefficients at the infinite dilution (ln^) of the compound in studied solvents
T/K 1пХид lnym
буфер pH 7,4 гексан 1-октанол
293,15 -5,630 6,064 2,245 2,660
298,15 -5,477 6,077 2,238 2,631
303,15 -5,326 6,081 2,233 2,581
308,15 -5,178 6,099 2,230 2,553
313,15 -5,032 6,102 2,225 2,510
A 6,67 ± 0,06 1,94 ± 0,10 0,29 ± 0,11
B -179±20 87 ± 6 693± 35
R 0,9805 0,9919 0,9961
Таблица 5. Избыточные термодинамические функции растворимости соединения в выбранных растворителях при 298,15 К
Table 5. Excess thermodynamic solubility functions of the compound in selected solvents at 298,15 K
Растворитель GE, кДж-моль-1 HE, кДжмоль-1 TSE, кДжмоль-1 SE, кДж-моль-1 •K-1 aÇH, % bÇTS,%
буфер pH 7,4 15,1 + 0,3 -1,5 + 0,2 -16,6 -55,7 + 2,2 8,3 91,7
гексан 5,6 + 0,1 0,7 + 0,1 -4,9 -16,4 + 0,8 12,5 87,5
1-октанол 6,5 + 0,2 5,8 + 0,3 -0,7 -2,3 + 0,01 89,3 10,7
aÇH = (HE /( HE + TSE))• 100 %; bçre = (TSE /(HE + TSE)) 100 %
Установлено, что основным термодинамическим фактором, ответственным за положительное отклонение от идеальности в водной среде и гек-сане, является высокое отрицательное значение энтропии: 1НЕ1 < 175е |. Напротив, в растворе 1-октанола доминирующий вклад в изменение энергии Гиббса растворения вносит энтальпийная составляющая: 1НЕ1 > 175е!. Энтальпийный (НЕ) и энтропийный (75е) вклады в энергию Гиббса, приведенные в табл. 5, показывают, что в 1-октаноле энтропийная составляющая незначительна (75е < 11 %), а в буфере и гексане этот вклад является определяющим (> 80 %).
Распределение в водно-органической системе
Коэффициент распределения изученного соединения в системе 1-октанол/буфер рН 7,4 равен отношению равновесных молярных концентраций вещества в органической (С°) и водной (Св) фазах:
Р = Со/Св . (8)
Экспериментально полученные коэффициенты распределения производного приведены в табл. 6. Следует отметить, что эмпирическим путем установленная граница липофильности лекарственных препаратов выражается неравенством: -0,5 < ^Р < 5 [6] и значение коэффициента распределения полученного соединения входит в этот рекомендуемый интервал. Из этого следует, что синтезированное производное должно иметь хорошую кишечную абсорбцию благодаря оптимальному балансу растворимости и проницаемости путем пассивной диффузии. С повышением температуры коэффициенты распределения возрастают, что свидетельствует об увеличении содержания вещества в октанольной фазе, которая имитирует липидный слой мембран.
Таблице 6. Экспериментальные концентрации и коэффициенты распределения для исследуемого соединения в системе 1-октанол/буфер pH 7,4
Table 6. Experimental concentrations and partition coefficients of the studied compound in the 1-octanol/buffer pH 7,4 system
T (K) C0-104 C -105 logP x0-105 хЛ07 logP*
293,15 1,97 3,74 0,72 3,11 6,74 1,66
298,15 1,99 3,45 0,76 3,15 6,22 1,71
303,15 2,02 3,21 0,80 3,19 5,78 1,74
308,15 2,05 3,05 0,84 3,23 5,27 1,79
313,15 2,07 2,72 0,88 3,27 4,89 1,82
Значения стандартной энергии Гиббса переноса вещества из буферной фазы в органическую были рассчитаны по уравнению:
АО° = -ДТ1пР*, где Р*= Хо/хв , (9)
где Хо и Хв - мольные доли соединения в водной и октанольной фазах, соответственно.
Энтальпию переноса АН° получали из температурной зависимости коэффициентов распределения:
d(1n Р*)ШТ = АЯ7ДТ2. (10)
Энтропия переноса А5о определена по уравнению: А5° = (АН° - АО°) /Т. (11)
Рассчитанные на основе экспериментальных данных термодинамические функции переноса соединения в системе 1-октанол / буфер рН 7,4 имели следующие значения: AG0 = -9,7 кДж-моль"1, AH = 14,2 кДж-моль-1 и AS° = 23,9 Дж-моль^-К-1. Согласно полученным результатам, значения энергии Гиббса отрицательны, и это свидетельствует о самопроизвольности процесса переноса соединения из водной фазы в органическую среду. Установлено, что значения AH° положительны и, следовательно, процесс распределения соединения является эндотермическим, что связано с гидрофобной гидратацией фенильных и алкильных фрагментов молекул изученного соединения. Изменения энтропии также положительны, что указывает на понижение упорядоченности системы в результате переноса вещества.
Мембранная проницаемость
Раствор изученного соединения был приготовлен путем растворения в буфере pH 7,4. Затем 100 мкл раствора помещали в донорные камеры измерительной ячейки. В акцепторных камерах находился раствор фосфатного буфера (600 мкл). Эксперименты по определению проницаемости соединения проводили при комнатной температуре без перемешивания, и ячейки перемещали в лунки, содержащие равные количества свежего буферного раствора, в течение 6 ч. Образцы по 200 мкл из каждого акцепторного отсека переносили в планшеты с УФ-излучением (Costar) и определяли концентрацию вещества спектрофотометрически на приборе (Cary-50, США). Линейная часть наклона кривой стандартной зависимости кумулятивного количества соединения от времени представляет собой интенсивность потока в установившемся состоянии. Полученные значения плотности потока использовались для расчета коэффициента кажущейся проницаемости.
Эксперименты по исследованию мембранной проницаемости соединения были проведены с использованием искусственных фосфолипидных мембран, которые обладают свойствами лиотроп-ных жидких кристаллов. На начальном этапе было выполнено тестирование сформированных мембран путем определения коэффициента проницаемости кофеина как модельного лекарственного соединения. Эксперимент показал, что коэффициент мембранной проницаемости кофеина хорошо согласуется с литературным значением 12,5^10-6см^с-1 [11].
В соответствии с разработанной методикой был определен кажущийся коэффициент мембранной проницаемости изученного фторпроиз-водного триазол-3-тиона через сформированные фосфолипидные мембраны в буфере рН 7,4, имитирующем среду плазмы крови. Установлено, что значение кажущегося коэффициента проницаемости синтезированного производного равно 3,7-10-7 см-с-1, что на порядок ниже, чем у соединения сравнения кофеина.
Выводы
Разработаны методики синтеза и получено новое биоактивное фторпроизводное триазол-3-тиона как потенциальное лекарственное соединение, обладающее нейрокорректирующей активностью. Строение и чистота вещества подтверждены методами :Н ЯМР, 13С ЯМР и элементного анализа. Биологические тесты показали, что изученное соединение может модулировать глутамат-индуцированный захват ионов кальция в синапто-сомы коры мозга крыс. Кроме того, установлено, что синтезированное производное способно оказывать влияние на функциональную активность АМРА рецепторов.
Методом изотермического насыщения измерена растворимость изученного триазол-3-тиона в фармацевтически значимых растворителях: буферном растворе рН 7,4, гексане и 1-октаноле, в интервале температур 293,15-313,15 К. Показано, что исследуемое производное в указанных растворителях имеет низкую растворимость, которая не превышает значения 5•Ю-3 моль л-1. Уравнения Вант-Гоффа и Апельблата применены для моделирования изменения растворимости соединения от температуры в указанных растворителях.
Исследована липофильность синтезированного производного и сделано заключение, что вещество должно обладать хорошей кишечной абсорбцией благодаря оптимальному балансу растворимости и проницаемости путем пассивной диффузии. На основе рассчитанных термодинамических функций выполнен анализ влияния энталь-пийных и энтропийных факторов на процессы растворения и распределения соединения в использованных растворителях.
Проведены эксперименты по изучению проницаемости соединения через сформированные искусственные фосфолипидные мембраны, обладающие свойствами лиотропных жидких кристаллов. Определено, что проницаемость синтезированного производного достаточна для прохождения через биологические клеточные мембраны организма.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 18-43-370016_регцентра).
Список литературы / References
1. Чичёва М. М., Бовина Е. В., Броновицкий Е. В., Устюгов А. А. Разработка нейропротекторных соединений с мультитаргетным механизмом действия на основе гамма-карболинов // Русский ученый. 2017. T. 1, № 1. C. 31-46. [Chicheva M.M, Bovina E.V., Bronovitsky E.V., Ustyugov A.A. Gamma-carbolines as a structural base for the development of neuro-protective compounds with a multi-target mechanism of action-carbolines as a structural base for the development of neuroprotective compounds with a multitarget mechanism of action. Russian Scientist, 2017, 1 (1), 31-46 (in Russ.)].
2. Avdeef A. Solubility of sparingly-soluble ionizable drugs. Adv. Drug Deliv. Rev, 2007, 59, 568-590. DOI: 10.1016/j.addr.2007.05.008.
3. Tute M.S. Lipophilicity: A History. Lipophilicity in Drug Action and Toxicology / editors V. Pliska, B. Testa, Han van de Waterbeemd. Chichester : John Wiley & Sons, 2008, Ch. 2, 7-26.
4. Sangster J. Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry. Chichester : John Wiley& Sons, 1997, 170 p.
5. Shinoda W. Permeability across lipid membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Biomembranes, 2016, 1858 (10), 2254-2265.
DOI: 10.1016/j.bbamem.2016.03.032.
6. Kerns E., Di L. Drug like Properties: Concepts, Structure Design and Methods. New York : Academic Press, 2008, 552 p.
7. Kim E.B., Lockwood N., Chopra M., Guzman O., Abbott N.L., de Pablo J.J. Interactions of Liquid Crystal-Forming Molecules with Phospholipid Bilayers Studied by Molecular Dynamics Simulations. Biophys J., 2005, 89 (5), 3141-3158.
DOI: 10.1529/biophysj .105.065193.
8. Stillwell W. An Introduction to Biological Membranes: Composition, Structure and Function, 2 ed. Elsevier B.V., 2016.
9. Demetzos C., Pippa N. Advanced drug delivery nanosystems (aDDnSs) : a mini-review. Drug Deliv., 2014, 21 (4), 250-257.
DOI: 10.3109/10717544.2013.844745.
10. Селиванова Н. М., Губайдуллин А. Т., Галяметди-нов Ю. Г. Лиотропные мезофазы на основе биополимера хитозана, уксусной кислоты и неионных ПАВ как системы доставки биоактивных субстанций // Жидк. крист. и их практич. использ. 2018. T. 18, № 3. С. 6-13. [Seiivanova N.M., Gubaidul-lin A.T., Galyametdinov Yu.G. Lyotropic mesophases based on chitosane biopolymer, acetic acid and non-ionic surfactants, as delivery systems of bioactive substances. Liq. Cryst. and their Appl, 2018, 18 (3), 6-13. (in Russ.). D0I:10.18083/LCAppl.2018.3.6].
11. Flaten G.E., Bunjes H., Luthman K., Brandl M. Drug permeability across a phospholipid vesicle-based barrier. 2. Characterization of barrier structure, storage stability and stability towards pH changes. Eur. J. Pharm. Sci., 2006, 28, 336-343.
DOI: 10.1016/j.ejps.2006.03.008.
12. Po H.N., Senozan N.M. Henderson-Hasselbalch Equation: Its History and Limitations. J. Chem. Educ. 2001, 78, 1499-1503. DOI: 10.1021/ed078p1499.
13. Apelblat A., Manzurola E. Solubilities ofo-acetylsalicylic, 4-aminosalicylic, 3, 5-dinitrosalicylic, andp-toluic acid, and magnesium-DL-aspartate in water from T = (278 to 348) K. J. Chem. Thermodyn. 1999, 31, 85-91. DOI: 10.1006/jcht.1998.0424.
14. Atkins P., De Paula J. Physical chemistry for the life sciences, eighth ed. New York, W.H. Freeman and Company, 2006, 590 p.
15. Prausnitz J.M., Lichtenthaler R.N., Gomes de Azevedo E. Molecular Thermodynamics of Fluid-Phase Equilibria, second ed. New Jersey : Prentice-Hall, Englewood Cliffs, 1986, 860 p.
16. Stanley I. Chemical and Engineering Thermodynamics, third ed. New York : John Wiley & Sons, 1999, 763 p.
17. Blokhina S., Sharapova A., Ol'khovich M., Perlovich G. Thermodynamic study of aceclofenac solubility, distribution and sublimation. J. Chem. Thermodynam., 2019, 137, 13-21. DOI: 10.1016/j.jct.2019.05.014.
Поступила 16.03.2021 г. Received 16.03.2021 Принята 15.04.2021 г. Accepted 15.04.2021
