СИНТЕЗ И АНАЛЬГЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ 2-АРИЛ-3-(БЕНЗО[D][1,3]ДИОКСОЛ-5-ИЛ)-2-АЗАСПИРО[3.5]НОНАН-1-ОНОВ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

_ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА_

Том 9 Химия Вып. 1

546.47+547.466.33-318+547.288.2 DOI: 10.17072/2223-1838-2019-1-82-88

Е.А. Никифорова1, Н.Ф. Кириллов1, Р.Р. Махмудов1'2, Д.В. Байбародских1

'Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия 2ФГУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения»

СИНТЕЗ И АНАЛЬГЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ 2-АРИЛ-3-(БЕНЗО[й?][1'3]ДИОКСОЛ-5-ИЛ)-2-АЗАСПИРО[3.5]НОНАН-1-ОНОВ

Взаимодействием реактива Реформатского, полученного из метилового эфира 1-бромциклогексанкарбоновой кислоты и цинка, с азометинами на основе бен-зо^][1,3]диоксол-5-карбалъдегида синтезированы соответствующие замещенные спи-роазетидиноны. Установлено, что данные соединения проявляют аналъгетическую активность, превышающую таковую для препарата сравнения - метамизола натрия.

Ключевые слова: реактивы Реформатского; метил 1-бромциклогексанкарбоксилат; основания Шиффа; спироазетидиноны; анальгетическая активность

Е. А. Nikiforova, N. F. Kirillov, R.R. Makhmudov, D.V.Baibarodskikh

Perm State University, Perm, Russia

SYNTHESYS AND ANALGESIC ACTIVITY OF 2-ARYL-3-(BENZO [d] [1,3] DIOXOL-5-YL)-2-AZASPIRO [3.5] NONAN-1-ONES

The interaction of the Reformatsky reagent, obtained from methyl 1-bromocyclohexanecarboxylate and zinc, with azomethines of benzo[d][1,3]dioxole-5-carbaldehyde and arylamines, the corresponding substituted spiroazetidinones were synthesized. It is established that these compounds exhibit analgesic activity that exceeds that for the reference drug, metamizole sodium.

Keywords: Reformatsky reagents; methyl 1-bromocyclohexanecarboxylate; Schiff bases; spiroazetidinones; analgesic activity

© Никифорова Е.А., Кириллов Н.Ф., Махмудов Р.Р., Байбародских Д.В., 2019

Известно, что реактивы Реформатского присоединяются к двойной углерод-азотной связи оснований Шиффа с последующей циклизацией с образованием азетидинонов [1-3]. Уточним также, что азетидин-2-оновый фрагмент входит в состав природных и синтезированных соединений, которые обладают разнообразной биологической активностью [3-6]. С целью получения новых биологически активных соединений нами было изучено взаимодействие метилового эфира 1-бромциклогексанкарбоновой кислоты (I) с

\-' (

СООМе

/—ч огпВг

Г\=(

\—' (

ОМе

ОМе ,гпВг

цинком и ^арил-1-бензо[а?][1,3]диоксол-5-илметаниминами (Па-д). Как показали наши исследования, реактив Реформатского, полученный из бромэфира (I), присоединяется к двойным углеродным-азотным связям азоме-тинов (Па-е) с образованием промежуточных соединений (Ша-е). Последние в условиях реакции циклизуются с выделением бромцинк-метилата, что приводит к образованию 2-арил-3 -(бензо [^][1,3] диоксол-5 -ил) -2-азаспиро[3.5]-нонан-1-онов (1Уа-е).

О

(О/ \\

С=1Ч-Аг =/ Н Па-е

- МеОгпВг \=

1Уа-е

ТТ-ТУ: Аг = РЬ (а), 4-МеС6Н4 (Ъ), 4-ВгС6Н4 (с), 4-МеОС6Н4 (с1), 1-нафтил (е)

Состав и строение синтезированных соединений (ГУа-е) подтверждено данными элементного анализа и ИК и ЯМР :Н и 13С спектроскопии. В ИК-спектрах соединений (ГУа-е) присутствуют полосы поглощения в области 1726-1746 см-1, принадлежащие карбонильным группам азетидиноновых циклов. В спектрах ЯМР 1Н характерными являются сигналы ме-тиновых протонов в области 4.63-5.11 м.д. кроме того, в ЯМР 13С спектрах нужно отметить наличие сигналов углеродов азетидино-новых циклов в областях 58.83-60.35 м.д. (С3), 66.44-67.86 (спироуглеродный атом), 170.91172.03 (углерод карбонильной группы).

Так как ранее полученные спироазетидино-ны обладали анальгетической активностью [3], нами была изучена эта активность синтезированных соединений. Данные эксперимента представлены в таблице. Как видно из таблицы, исследуемые соединения обладают аналь-гетической активностью, которая колеблется от 18,80 до 20,90 с против 10,20 с в контроле. Они вызывают увеличение времени оборонительного рефлекса на пике действия более чем на 50 % по сравнению с исходными данными. Анальгетическая активность соединений (ГУа-е) превышает на 15, 20, 27, 26, 28 % соответ-

ственно анальгетическую активность эталон- мг/кг, и по классификации К.К. Сидорова [7]

ного препарата - метамизола натрия. соединения относятся к малотоксичным.

Изучение острой токсичности соединений (1Уа-е) показало, что их ЛД50 превышает 1500

Таблица

Анальгетическая активность 2-арил-3-(бензо[^][1,3]диоксол-5-ил)-2- азаспиро[3.5]нонан-1-онов

№ Соединение Время оборонительного рефлекса на пике действия, с

1 IVa 18,80±0,68

2 IVb 19,60±0,89

3 IVc 20,70±0,62

4 IVd 20,50±0,57

5 IVe 20,90±1,08

8 Контроль, 2 %-ная крахмальная слизь 10,20±0,72

9 Метамизол натрия 16,33±3,02

Примечание: достоверность различий по сравнению с контролем p < 0,05

Таким образом, исследования показали, что перспективен поиск анальгетической активности в ряду производных азетидинонов, содержащих бензо[й?][1,3]диоксольный заместитель.

Экспериментальная химическая часть

ИК-спектры соединений (IV) были сняты на ИК-Фурье спектрофотометре Spectrum Two фирмы PerkinElmer в вазелиновом масле. Спектры ЯМР 1Н и 13C записывали на спектрометре Bruker Avance III HD 400 (рабочая частота 400 (1Н) и 100 (13С) МГц) в CDCb, внутренний стандарт - ГМДС. Элементный анализ выполняли на анализаторе vario MICRO cube. Температуру плавления измеряли на приборе MP-70 фирмы Mettler Toledo.

Общая методика синтеза. Смесь 1,5 г измельченного в мелкую стружку цинка, каталитического количества сулемы, 30 мл безводного бензола, 3 мл ГМФТА, 10 ммоль метилового эфира 1-бромциклогексанкарбоновой кис-

лоты и 6 ммоль ^арил-1-бензо[^] [ 1,3]диоксол-5-илметанимина кипятили 4 ч, охлаждали, гидролизовали 5 %-ной уксусной кислотой, выделившийся продукт отфильтровывали, органический слой отделяли, из водного слоя продукты реакции дважды экстрагировали этилацетатом. После высушивания экстракта безводным сульфатом натрия растворители отгоняли и продукт перекри-сталлизовывали из смеси этанола и этилацета-та.

3-(Бензо[^][1,3]диоксол-5-ил)-2-фенил-2-азаспиро[3.5]нонан-1-он (ГУа). Выход: 1.47 г (73%), т.пл. 124-125°С. ИК спектр, V, см-1: 1738 (С=0). Спектр ЯМР !Н, 5, м.д.: 1.09-2.12 м [10Н, (СШ)5], 4.70 с (1Н, СН), 5.97 дд (2Н, ОСН2О, Т 6.0 Гц, 7 1.2 Гц), 6.75 д (1НАг, Т 1.6 Гц), 6.77 дд (1НАг, Т 8.0 Гц, Т 1.6 Гц), 6.81 д (1НАг, Т 8.0 Гц), 7.04 т, 7.26 т, 7.30 д (5Н, Т 7.6 Гц). Спектр ЯМР 13С, 5, м.д.: 22.36, 23.55, 25.40, 27.63, 33.58, 59.88 (Сциклогексан); 66.44

(С3); 101.35 (ОСН2О), 107.51, 108.48, 117.33, 120.79, 123.62, 129.08, 129.36, 138.06, 147.63, 148.11 (САг); 171.47 (СО). Найдено, %: С -75.31; Н - 6.21; N - 4.09. С21Н21Ш3. Вычислено, %: С - 75.20; Н - 6.31; N - 4.18.

3-(Бензо[й?][1,3]диоксол-5-ил)-2-(4-метилфенил)-2-азаспиро[3.5]нонан-1-он (ГУЬ). Выход: 1.30 г (62 %), т.пл. 135-136°С. ИК-спектр, V, см-1: 1733 (С=0). Спектр ЯМР 1Н, 5, м.д.: 1.09-2.07 м [10Н, (СШЬ], 4.65 с (1Н, СН), 5.95 дд (2Н, ОСН2О, 3 6.0 Гц, 3 1.2 Гц), 6.72 д (1НАг, Т 1.6 Гц ), 6.74 дд (1НАг, Т 8.0 Гц, Т 1.6 Гц), 6.78 д (1НАг, Т 8.0 Гц), 7.04 д, 7.18 д (4Н, 4-МеС6Й4, Т 8.4 Гц). Спектр ЯМР 13С, 5, м.д.: 20.97 (Ме), 22.40, 23.62, 25.46, 27.66, 33.61, 59.86 (Сциклогексан); 66.45 (С3); 101.36 (ОСН2О), 107.59, 108.49, 117.31, 120.84, 129.56, 129.61, 133.20, 135.66, 147.62, 148.11 (САг); 171.26 (СО). Найдено, %: С - 75.55; Н -6.71; N - 4.14. С22Н23Ш3. Вычислено, %: С -75.62; Н - 6.63; N - 4.01.

3-(Бензо[й?][1,3]диоксол-5-ил)-2-(4-бромфенил)-2-азаспиро[3.5]нонан-1-он (ГУс). Выход: 1.72 г (69 %), т.пл. 150-151°С. ИК-спектр, V, см-1: 1736 (С=0). Спектр ЯМР 1Н, 5, м.д.: 1.10-2.10 м [10Н, (СЩ5], 4.64 с (1Н, СН), 5.97 дд (2Н, ОСН2О, Т 4.8 Гц, Т 1.2 Гц), 6.68 д (1НАг, Т 1.6 Гц), 6.72 дд (1НАг, Т 8.0 Гц, Т 1.6 Гц), 6.79 д (1НАг, Т 8.0 Гц), 7.17 д, 7.35 д (4Н, 4-ВгС6Н4, Т 8.8 Гц). Спектр ЯМР 13С, 5, м.д.: 22.36, 23.56, 25.38, 27.61, 33.58, 60.35 (Сциклогек" сан); 66.60 (С3); 101.46 (ОСН2О), 107.43, 108.60, 116.31, 118.94, 120.82, 128.84, 132.13, 147.02, 147.17, 147.58 (САг); 171.43 (СО). Найдено, %: С - 60.95; Н - 4.77; Вг - 19.42; N - 3.49. С2:ШВгШ3. Вычислено, %: С - 60.88; Н -4.87; Вг - 19.29; N - 3.38.

3-(Бензо[^][1,3]диоксол-5-ил)-2-(4-метоксифенил)-2-азаспиро [3.5] нонан-1-он

Выход: 1.49 г (68 %), т.пл. 101-102°С. ИК-спектр, V, см-1: 1726 (С=0). Спектр ЯМР 1Н, 5, м.д.: 1.06-2.05 м [10Н, (СШЬ], 3.74 с (3Н, МеО), 4.63 с (1Н, СН), 5.95 дд (2Н, ОСН2О, Т 4.8 Гц, Т 1.2 Гц), 6.71 д (1НАг, Т 1.6 Гц), 6.73 дд (1НАг, Т 8.0 Гц, Т 1.6 Гц), 6.77 д (1НАг, Т 8.0 Гц), 6.78 д, 7.23 д (4Н, 4-МеОС6Ш, Т 9.2 Гц). Спектр ЯМР 13С, 5, м.д.: 22.39, 23.60, 25.43, 27.64, 33.57, 59.90 (Сциклогексан); 55.58 (МеО), 66.53 (С3); 101.34 (ОСН2О), 107.57, 108.47, 114.46, 118.55, 120.85, 129.51, 131.67, 147.61, 148.09, 155.96 (САг); 170.91 (СО). Найдено, %: С - 72.24; Н - 6.41; N - 3.78. С22Н23Ш4. Вычислено, %: С - 72.31; Н - 6.34; N - 3.83.

3-(Бензо[^][1,3]диоксол-5-ил)-2-(1-нафтил)-2-азаспиро[3.5]нонан-1-он (ГУе). Выход: 1.23 г (53 %), т.пл. 204-205°С. ИК-спектр, V, см-1: 1746 (С=0). Спектр ЯМР 1Н, 5, м.д.: 1.16-2.20 м [10Н, (СЩ5], 5.11 с (1Н, СН), 5.89 дд (2Н, ОСН2О, Т 12.0 Гц, Т 1.6 Гц), 6.69 дд (1НАг, Т 8.4 Гц, Т 2.0 Гц ), 6.77 д (1НАг, Т 2.0 Гц), 6.80 д (1НАг, Т 8.4 Гц), 7.20 д, 7.35 т, 7.56 т 7.60 т, 7.67 д, 7.83 д, 8.34 д (7Н, 1-нафтил, Т 8.0 Гц). Спектр ЯМР 13С, 5, м.д.: 22.46, 23.48, 25.48, 28.25, 33.46, 58.83 (Сциклогексан); 67.86 (С3); 101.24 (ОСН2О), 107.55, 108.41, 118.22, 120.94, 124.67, 125.31, 126.26, 126.49, 126.58, 127.88, 128.31, 129.65, 133.25, 134.72, 147.60, 147.97 (САг); 172.03 (СО). Найдено, %: С -78.02; Н - 5.97; N - 3.78. С25Н23Ш3. Вычислено, %: С - 77.90; Н - 6.01; N - 3.63.

Экспериментальная биологическая

часть

Анальгетическую активность синтезированных соединений (1Уа-е) изучали на беспородных белых мышах-самцах массой 18-22 г

по методу термического раздражения («горячая пластинка» по N.B. Eddy and D.J. Leimbach [8]). В опытах использовали животных с исходным временем наступления оборонительного рефлекса не более 15 с. В качестве препарата сравнения антиноцицептивного действия использовали коммерчески доступную субстанцию метамизола натрия ООО «Фармхим-комплект». Исследуемые соединения вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг, а метамизол натрия в дозе 93 мг/кг, соответствующей ЕД50 по тесту «горячая пластинка» [9], за 0,5 ч до помещения мышей на нагретую до 53,5оС металлическую пластинку. Показателем изменения болевой чувствительности служила измеряемая в секундах длительность пребывания животных на горячей пластине до момента облизывания ими задних лапок. Эффект оценивали через 0,5, 1,0, 2,0 и 2,5 ч после введения соединений, чтобы выбрать пик действия. Каждое соединение испытывали на 10 животных. Контрольным мышам вводили эквиобъ-емное количество 2 %-ного раствора крахмальной слизи.

Острую токсичность (ЛД50) определяли по экспресс-методу В.Б. Прозоровского [10] на белых мышах массой 18-22 г при однократном внутрибрюшинном введении соединений с учетом гибели животных в течение 24 ч.

Статистическую обработку экспериментального материала проводили с использованием критериев достоверности Стьюдента [11]. Эффект считали достоверным при p <

0.05.

Библиографический список

1. Кириллов Н.Ф., Щепин В.В. Взаимодействие

реактивов Реформатского, полученных из

метиловых эфиров 1-бромцикло-алканкарбоновых кислот и цинка, с азоме-тинами или азинами // Журнал общей химии. 2005. Т. 75, вып. 4. С. 629-631.

2. Щепин В.В., Мелехин В.С., Кириллов Н.Ф. Взаимодействие реактивов Реформатского, полученных из метиловых эфиров 1-бромциклобутан- и 1-бромциклогептан-карбоновых кислот и цинка, с основаниями Шиффа // Журнал органической химии. 2007. Т. 43, вып. 11. С. 1637-1639.

3. Singh G. S., D'hooghe M., De Kimpe N. Synthesis and reactivity of spiro-fused ß-lactams // Tetrahedron. 2011. Vol. 67. P. 1989-2012.

4. Benfatti F., Cardillo G., Gentilucci L., Tolomelli A. Synthesis and biological evaluation of unprecedented classes of spiro-ß-lactams and azido-ß-lactams as acyl-CoA:cholesterol acyltransferase inhibitors // Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 2007. Vol. 17, № 7. P. 1946-1950.

5. Singh G. S., Siddiqui N., Husain A. Antibacterial and antifungal activities of spiroazet-idinones // Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 2001. P. 253-255.

6. Turos E., Long T.E., Heldreth B., et al. N-Thiolated ß-lactams: A new family of anti-Bacillus agents // Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 2006. Vol. 16, № 8. P. 2084-2090.

7. Сидоров К. К. Токсикология новых промышленных химических веществ. М.: Медицина, 1973. Вып. 3. С. 47-51.

8. Eddy N. B., Leimbach D. J. Synthetic analgesics. II. Dithienylbutenyl- and dithienylbutyl-amines // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 1953. Vol. 107. P. 385393.

9. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармоко-логических веществ. // М., 2005. 839 с.

10. Прозоровский В. Б. Практическое пособие по ускоренному определению среднеэф-фективных доз и концентраций биологически активных веществ. // СПб.:НПП -Наука, 1992. С. 81-106.

11. Беленький М. Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л.: Медгиз, 1963. 146 с.

References

1. Kirillov, N.F. and Shchepin, V.V. (2005), "Reaction with azomethines or azines of Refor-matsky reagents prepared from methyl 1-bromocycloalkanoates and zinc", Russian Journal of General Chemistry, vol. 75, no. 4, pp.590-592.

2. Shchepin, V. V., Melekhin, V.S., and Kirillov, N.F. (2007), "Reformatsky reaction of methyl 1-bromocyclobutane- and 1-bromocycloheptanecarboxylates with Schiff bases", Russian Journal of Organic Chemistry, vol. 43, no. 11, pp. 1632-1634.

3. Singh, G. S., D'hooghe, M., De Kimpe, N. (2011), "Synthesis and reactivity of spiro-fused P-lactams", Tetrahedron, vol. 67, pp. 19892012.

4. Benfatti, F., Cardillo, G., Gentilucci, L., Tolomelli, A. (2007), "Synthesis and biological evaluation of unprecedented classes of spi-ro-P-lactams and azido-P-lactams as acyl-CoA:cholesterol acyltransferase inhibitors", Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, vol. 17, no. 7, pp. 1946-1950.

5. Singh, G. S., Siddiqui, N., Husain, A. (2001), "Antibacterial and antifungal activities of spi-roazetidinones", Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, pp. 253-255.

6. Turos, E., Long, T.E., Heldreth, B., Leslie, J.M., Reddy, G.S.K., Wang, Y., Coates, C., Konaklieva, M., Dicky, S., Lim, D.V., Alonso,

E., Gonzalez, J. (2006), "N-Thiolated ß-lactams: A new family of anti-Bacillus agents", Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, vol. 16, no. 8, pp. 2084-2090.

7. Sidorov, K. K. (1973), Toksikologiia novikh promishlennikh himicheskikh veshchestv [Toxicology of New Industrial Chemicals], Med-itsina, Moscow, Russia, no. 3, pp. 47-51.

8. Eddy, N. B. and Leimbach, D. J. (1953), "Synthetic analgesics. II. Dithienylbutenyl- and dithienylbutylamines," Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, vol. 107, pp. 385-393.

9. Rukovodstvo po eksperimentalnomu (do-clinicheskomu) izucheniiu novikh farmokolo-gicheskikh veshchestv [Handbook for Experimental (Preclinical) New Drug Trials] (2005), Moscow, Riussia.

10.Prozorovskij, V. B. (1992), Prakticheskoe posobie po uskorennomu opredeleniju sred-neeffektivnikh doz i koncentratcij biologicheski aktivnikh veshchestv [Practical Aide for Rapid Determination of Mean Effective Doses and Concentrations of Biologically Active Compounds], NPP - Nauka, St. Petersburg, Russia, pp.81-106.

11.Belenkij, M. L. (1963), Elementi kolichestven-noj ocenki farmakologicheskogo effekta [Elements of Quantitative Assessment of Pharmacological Effects], Medgiz, Leningrad, Russia.

Об авторах

Никифорова Елена Александровна, кандидат химических наук, доцент кафедры органической химии

Пермский государственный национальный исследовательский университет Россия, 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15.

Кириллов Николай Федорович, кандидат химических наук, доцент кафедры органической химии

Пермский государственный национальный исследовательский университет Россия, 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15. kirillov@psu.ru

Махмудов Рамиз Рагибович, кандидат фармацевтических наук, доцент Заведующий Научно-исследовательской лабораторией биологически активных соединений ПГНИУ

Пермский государственный национальный исследовательский университет Россия, 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15. bav@psu.ru

Старший научный сотрудник лаборатории исследования метаболизма и фармакокинетики ФГУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» 614045, г. Пермь, ул. Монастырская, 82 bav@fcrisk.ru

Байбародских Даниил Владимирович, ассистент кафедры неорганической химии, химической технологии и техносферной безопасности

Пермский государственный национальный исследовательский университет Россия, 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15. daniil.bay@gmail. com

About the autors

Nikiforova Elena Alexandrovna

candidate of chemistry, associate professor of the

Department of Organic Chemistry

Perm State University

15, Bukireva st., Perm, Russia, 614990

Kirillov Nikolay Fedorovich

candidate of chemistry, associate professor of the

Department of Organic Chemistry

Perm State University

15, Bukireva st., Perm, Russia, 614990

kirillov@psu.ru

Makhmudov Ramiz Ragibovich

candidate of pharmacology, associate professor

The head of the Research Laboratory of Biologically

Active Compounds of PSU

Perm State University

15, Bukireva st., Perm, Russia, 614990

bav@psu.ru

Senior Research Fellow of Metabolism and Pharma-

cokinetics Research Laboratory

FBSI «Federal Scientific Center for Medical and

Preventive Health Risk Management Technologies»

614045, 82, Monastmrskaja St., Perm, Russia

bav@fcrisk.ru

Baibarodskikh Daniil Vladimirovich, Assistant of Inorganic Chemistry, Chemical Technology and Technosphere Safety Dept.

Perm State University

15, Bukireva st., Perm, Russia, 614990

daniil.bay@gmail. com

Информация для цитирования

Никифорова Е.А., Кириллов Н.Ф., Махмудов Р.Р., и др. Синтез и анальгетическая активность 2-арил-3-(беюо[й?][1,3]диоксол-5-ил)-2-азаспиро[3.5]нонан-1-онов // Вестник Пермского университета. Серия «Химия». 2019. Т. 9, вып. 1. С. 81-88. DOI: 10.17072/2223-1838-2019-1-81-88. Nikiforova E.A., Kirillov N.F., Makhmudov R.R., i dr. Sintez i analgeticheskaia aktiv-nost 2-aril-3-(benzo[d][1,3]dioksol-5-il)-2-azaspiro[3.5]nonan-1-onov [Synthesys and analgesic activity of 2-aryl-3-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-azaspiro[3.5]nonan-1-ones] // Vestnik Permskogo universiteta. Seriya «Khimi-ya» = Bulletin of Perm University. Chemistry. 2019. Vol. 9. Issue 1. P. 81-88 (in Russ.). D0I:10.17072/2223-1838-2019-1-81-88.