CC BY
43
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 57.033+543.9
ШТАММ GLUCONACETOBACTER SUCROFERMENTANS ВКПМ B-11267 КАК ОСНОВА РЕЦЕПТОРНОГО ЭЛЕМЕНТА АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО БИОСЕНСОРА
А.Г. Быков, О.В. Скрипачева, С.Е. Тарасов, Н.А. Кленова,
А.Н. Решетилов
Рассмотрена возможность использования бактерий штамма G. sucrofer-mentans B-11267 в составе рецепторного элемента электрохимического биосенсора. Штамм Gluconobacter oxydans sbsp. industrius ВКМ B-1280 использовали как референтную культуру. Получены сравнительные характеристики двух штаммов. Построены калибровочные зависимости для биосенсоров на основе иммобилизованных бактерий штамма G. oxydans В-1280 и G. sucrofermentans B-11267, а также проведено сравнение субстратной специфичности и импедансных характеристик для данных штаммов. Представлялось важным выяснить, как формирование на поверхности клеток бактериальной целлюлозы влияет на электрохимические характеристики клеток G. sucrofermentans B-11267, в том числе на их общее сопротивление.
Ключевые слова: биорецептор, амперометрический биосенсор, импедансная спектроскопия, электрод Кларка.
Введение
Бактериальная целлюлоза (БЦ) - это перспективный природный полимер, который вырабатывается определенными типами бактерий [1]. БЦ образуется представителями таких родов как Gluconacetobacter (ранее Acetobacter), Aerobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Achromobacter, Rhizobium, Salmonella и Sarcina [2]. Род Gluconacetobacter принадлежит к семейству Acetobacteraceae и классу Alphaproteobacteria [3] и изначально объединяет штаммы, относившиеся к роду Acetobacter и содержащие убихинон Q-10 в качестве основного дыхательного хинона [4]. В него входят грамотрицательные аэробные бактерии, способные к окислению этанола в уксусную кислоту [5], окислению ацетата и лактата до CO2 и воды, отдельные представители рода способны к азотфиксации [6].
Штамм G. oxydans В-1280 представлен грамм отрицательными палочками и является облигатным аэробом, относящимся к семейству Acetobacteraceae [7]. Данный штамм широко применяется при разработке биосенсоров и биотопливных элементов. Это обусловлено особенностью строения бактериальной клетки и связанными с этим особенностями метаболизма бактерий. В частности, представитель рода Gluconobacter способен к окислению широкого спектра субстратов; он обладает низкой
скоростью роста биомассы, характеризуется высокой скоростью образования метаболитов в ростовой среде [7, 8].
Применяемый в работе метод электрохимической импедансной спектроскопии (ЭИС) является эффективным недеструктивным инструментом для исследования электрохимических систем, в частности культур микроорганизмов или биологических тканей [9]. В данном случае метод ЭИС был применен для сравнения общего сопротивления двух штаммов, G. oxydans В-1280 и G. sucrofermentans B-11267 и оценки возможности их использования в качестве биокатализатора в БТЭ.
Цель работы состояла в изучении субстратной специфичности и электрохимических характеристик, в том числе импедансных зависимостей, штамма G. sucrofermentans B-11267 в сравнении со штаммом G. oxydans В-1280. Данная оценка позволяет изучить перспективу использования нового штамма в составе биотопливного элемента (БТЭ) и амперометрических биосенсоров.
Материалы и методы
В работе использованы следующие реактивы и материалы. Хроматографическая стеклобумага (тип GF/A, Whatman, Великобритания), кислородный электрод типа Кларка («Кронос», Россия), центрифуга Eppendorf (Германия), потенциостат/гальваностат «VersaSTAT 4» с модулем FRA (Princeton Applied Research, США). Использованы реагенты Д-сорбит (ООО Диаэм, Россия), дрожжевой экстракт (ООО Диаэм), бактериальный пептон (ООО Диаэм), №ОН (ООО Диаэм), KH2PO4 (Panreac, Испания), 2H2PO4 (Реахим, Россия), лимонная кислота (Реахим, Россия), D+ глюкоза (Panreac, Испания), хлорид кальция (Реахим, Россия), уксусная кислота (Реахим, Россия).
В работе использовали штамм Gluconobacter oxydans sbsp. industrius ВКМ B-1280 (Всероссийская коллекция микроорганизмов). Культивирование проводили в течение 18 - 20 ч в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 50 мл ростовой среды (сорбит - 10 %, дрожжевой экстракт - 0.2 %, дистиллированная вода - 100 мл, pH 6.5) при перемешивании (200 об/мин, 28 °С). Культуру поддерживали на скошенной агаризованной среде, содержащей сорбит (100 г/л или 10 %), дрожжевой экстракт (5.0 г/л или 0.5 %) и агар (15 г/л или 1.5 %).
Использованный в эксперименте штамм G. sucrofermentans B-11267 был любезно предоставлен сотрудниками кафедры биотехнологии, биоинженерии и биохимии Мордовского национального исследовательского университета им. Н.А. Огарева. Штамм G. sucrofermentans ВКПМ B-11267 культивировали в течение 18 - 20 ч в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 50 мл ростовой среды Хестрина и Шрамма (глюкоза - 2.0 %, пептон - 0.5 %, дрожжевой экстракт
-0.5 %, лимонная кислота - 0.115 % и гидрофосфат натрия - 0.27 %, дистиллированная вода - 100 мл, pH 6.0) при перемешивании (200 об/мин, 30 °С). Культуру поддерживали на скошенной агаризованной среде Хестрина и Шрамма, содержащей агар в количестве 15 г/л.
Все питательные среды автоклавировали в течение 30 мин при 0.5 изб. атм. Клетки культуры отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 5.0 мин. Осадок отмывали дважды калий-фосфатным буферным раствором (25 мМ, рН 6.5).
Иммобилизация клеток. Для иммобилизации аликвоту клеточной суспензии центрифугировали при 10 000 g в течение 3.0 мин при комнатной температуре. Клетки отмывали дважды 30 мМ калий-фосфатным буфером, рН 6.5. Иммобилизацию клеток штамма осуществляли методом физической адсорбции. Для этого клеточную суспензию, содержащую 10 мкл калий-фосфатного буферного раствора (30 мМ, рН 6.5) и 1.0 мг сырой биомассы, наносили на полоску хроматографической стеклобумаги («Whatman GF/A», Великобритания), формируя пятно диаметром 3.0 мм. Пятно подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин. Подготовленный биорецептор на основе иммобилизованных клеток изолята фиксировали на измерительной поверхности кислородного электрода типа Кларка («Кронас», Россия) с помощью нейлоновой сетки.
Условия измерений. Измерения биосенсором на основе кислородного электрода типа Кларка проводили в калий-фосфатном буферном растворе (30 мМ, рН 6.5), насыщенном кислородом, при комнатной температуре в открытой кювете объёмом 2.0 мл с помощью потенциостата IPC-Micro («Кронас», Россия). Регистрируемым параметром являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt (нА/с), связанная пропорциональной зависимостью со скоростью изменения концентрации потреблённого кислорода (ответ биосенсора). Объем пробы субстрата составлял 100 мкл.
Для прямой регистрации зависимости тока от времени применяли регистрацию с помощью графитовых электродов, полученных методом матричной печати. Электроды представляли собой систему, состоящую из рабочего, вспомогательного электродов и электрода сравнения на полимерной подложке. В печатных электродах рабочий и вспомогательный электроды изготовлены из графитовой пасты, электрод сравнения - из Ag/AgCl. Измерения с использованием печатных электродов проводились в ячейке объемом 3.0 мл при постоянном перемешивании.
Измерение импеданса электрохимических измерений проводили с помощью потенциостата/гальваностата «VersaSTAT 4» с модулем FRA (Princeton Applied Research, США), обеспечивающим возможность работать в различных вариантах вольтамперометрии и электрохимической
импедансной спектроскопии. Измерения электрохимического импеданса производили в диапазоне частот 40 кГц - 0,02 Гц при постоянном приложенном потенциале +200 мВ с амплитудой 10 мВ.
Результаты и обсуждение
В работе было проведено сравнение данных, полученных с помощью биосенсоров на основе печатных электродов и ответов амперометрических биосенсоров на основе кислородного электрода типа Кларка. На рис. 1 представлены импедансные спектры электродов с двумя типами клеток при добавлении редокс-медиатора (2,6-ДХФИФ) и 1мМ глюкозы, используемой в качестве субстрата. Количество биомассы клеток обоих штаммов в измерениях было одинаково и составляло 1.0 мг сырой массы/мл.
Z реальное, Ом
Рис. 1. Диаграммы Найквиста для электродов с иммобилизованными на скрин-принт электродах клетками штаммов G. oxydans В-1280 и G. sucrofermentans B-11267 при +200 мВ при добавлении ДХФИФ и 1 мМ глюкозы
Общее сопротивление системы определяется как проекция пересечения диаграммы Найквиста в области низких частот с осью реального сопротивления (Zre). Как следует из приведенных зависимостей клетки G. sucrofermentans B-11267 обладают меньшим общим сопротивлением, чем система на основе клеток G. oxydans В-1280. Можно предположить, что различия в значениях общего сопротивления клеток обусловлены различиями в строении данных бактериальных клеток, в
том числе в строении их клеточных мембран. В области низких частот (1 - 0,02 Гц) для штамма О. 8ысто/егтеп1ап8 В-11267 наблюдается резкое изменение наклона диаграммы, что указывает на появившиеся в системе диффузионные ограничения. При этом для системы на основе О. охуйат В-1280 подобных ограничений не наблюдается. Можно предположить, что несмотря на более высокое общее сопротивление клеток О. охуйат В-1280, именно отсутствие диффузионных ограничений позволяет этим клеткам более эффективно производить электронный перенос в составе биосенсоров и биотопливных элементов.
На рис. 2 представлено сравнение калибровочных зависимостей ответов амперометрических биосенсоров на основе кислородного электрода типа Кларка для двух изученных штаммов. Стоит отметить, что диапазон измеряемых концентраций для обоих штаммов был примерно одинаков, однако у биосенсора на основе клеток О. охуйат В-1280 в области высоких концентраций субстрата сигнал значительно выше.
0,8 о 0,6
к
§ 0,4
н
0,2 0,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Концентрация субстрата в кювете, мМ/л
.•5
О. зысто/егтеМат О. охуйат
Рис. 2. Калибровочная зависимость ответов биосенсора на основе иммобилизованных клеток штаммов С. охуйат В-1280 и С. зисго/вгтвМат В-11267 от концентрации глюкозы
Полученные калибровочные зависимости описывали уравнением Михаэлиса-Ментен. Значение эффективной константы Михаэлиса принимали за верхнюю границу линейного участка определяемых
содержаний [10]. Для штамма G. sucrofermentans В-11267 данная константа составила 0.1, а для штамма G. oxydans В-1280 она равна 0.8.
Оценку субстратной специфичности биорецептора на основе штамма G. sucrofermentans В-11267 провели по девяти субстратам: глюкоза, арабиноза, ксилоза, фруктоза, тирозин, лизин, изопропанол, метанол, этанол. Концентрация каждого субстрата в измерительной кювете составила 0.5 мМ. Результаты представлены на рис. 3.
1,0 0,8 -0,6 -
и
^о 0 4 н
0,2
I
0,0
<
1
Л
G. sucrofermentans G. oxydans
I
д.
I I I
1п
1
I I I I
I
Рис. 3. Субстратная специфичность биосенсора на основе электродов типа Кларка с иммобилизованными клетками штаммов С. охуйат В-1280 и С. зисгв/егтеМат В-11267
В сравнении с референтным штаммом на введение углеводов амплитуда ответа снижена (в 2.5 раза для глюкозы, в 4 раза для ксилозы и арабинозы). Подобной тенденции нет в случае использования спиртов. При введении в качестве субстрата этанола ответ G. oxydans В-1280 превзошел таковой у G. sucrofermentans В-11267 в 4 раза. При этом в случае использования метанола и изопропанола сигналы у электродов на основе клеток G. sucrofermentans В-11267 превышают сигналы биосенсоров на основе клеток G. oxydans в 10 и 1.8 раз, соответственно. Данный факт можно использовать для идентификации субстратов в смесях, используя разность сигналов двух штаммов на одинаковые субстраты.
Была выполнена проверка стабильности ответов биосенсоров на основе бактерий штамма G. sucrofermentans В-11267 и кислородного электрода типа Кларка; результаты представлены на рис. 4.
70
70
50
30
0 2 4 6 8 10 12
0
2 3 4
6
Сутки
Б
Рис. 4. Стабильность ответов биосенсора на основе электродов типа Кларка на основе иммобилизованных клеток штамма С. зисгв/егтеМат В-11267: А - операционная стабильность биосенсора, Б - долговременная стабильность биосенсора
Как видно из графиков, стандартное отклонение биосенсора на основе данного штамма за день работы составляет около 15 %. Штамм достаточно устойчив на относительно длительном промежутке времени (рис. 4, Б). За пять суток работы биосенсора его показания снизились на 23 %, по сравнению с первым измерением.
Проведена сравнительная оценка электрохимических характеристик штамма О. sucrofermentans В-11267 при их иммобилизации на печатном электроде и кислородном электроде типа Кларка. В качестве референтного штамма были использованы бактерии О. oxydans В-1280, относящиеся к тому же семейству уксуснокислых бактерий. Импедансные спектры, построенные для двух штаммов, свидетельствуют о том, что клетки О. sucrofermentans В-11267 обладают меньшим внутренним сопротивлением, однако при их нахождении в системе возникают диффузионные ограничения, которые могут препятствовать их эффективной работе в качестве биокатализатора электрохимических биосенсоров. Для бактериальных клеток двух штаммов в составе рецепторного элемента построены калибровочные зависимости биосенсора на основе кислородного электрода типа Кларка. Проведено сравнение субстратной специфичности двух штаммов и показано, что клетки О. sucrofermentans В-11267 генерируют большую амплитуду сигнала при измерении спиртов (изопропанол и метанол), что может быть использовано при создании
Выводы
амперометрических микробных биосенсоров или микробных топливных элементов.
Список литературы
1. Mohite B.V., Patil S.V. A novel biomaterial: bacterial cellulose and its new era applications // Biotechnology and Applied Biochemistry. 2014. V. 61. I. 2. P. 101-110.
2. Shoda M., Sugano Y. Recent advances in bacterial cellulose production // Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2005. V. 10. P. 1-10.
3. Gillis M., De Ley J. Intra and intergeneric similarities of the ribosomal ribonucleic acid cistrons of Acetobacter and Gluconobacter free // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 1980. V. 30. I. 1. P. 7-27.
4. Validation list No. 64. Validation of publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSB // International Journal of Systematic Bacteriology. 1998. V. 48. P. 327-328.
5. Swings J. The genera Acetobacter and Gluconobacter // In The Prokaryotes: a Handbook on the Biology of Bacteria - Ecophysiology, Isolation, Identification, Applications. New York: Springer. 1992. V. 3. P. 2268-2286.
6. Novel nitrogen-fixing acetic acid bacteria, Gluconacetobacter johannae sp. nov. and Gluconacetobacter azotocaptans sp. nov., associated with coffee plants / L. E. Fuentes-Ramirez, R. Bustillos-Cristales, A. Tapia-Hernandez [et al]. // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2001. V. 51. P. 1305-1314.
7. Gluconobacter oxydans: its biotechnological applications / A. Gupta, V.K. Singh, G.N. Qazi [et al]. // Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2001. V. 3. P. 445-456.
8. Macauley S., McNeil B., Harvey L.M. The genus Gluconobacter and its applications in biotechnology // Critical Reviews in Biotechnology. 2001. V. 21. P. 1-25.
9. Electrochemical techniques in corrosion science and engineering (1st edn.). / R.G. Kelly [et al]. CRC Press. 2002. P. 244 .
10. Биосенсоры: устройство, классификация и функциональные характеристики / А.А. Карякин, Е.А. Уласова, М.Ю. Вагин [и др.] // Сенсор. 2002. № 1. C. 16-24.
Быков Александр Геннадьевич, мл. науч. сотр., agbykov@rambler.ru, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр "Пущинский научный центр биологических исследований Российской Академии Наук",
Скрипачева Ольга Викторовна, студент, olga.screep@yandex.ru, Россия, Самара, Самарский национальный исследовательский университет им. С.П. Королева,
Тарасов Сергей Евгеньевич, канд. биол. наук, науч. сотр., setar25@gmail.com, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр "Пущинский научный центр биологических исследований Российской Академии Наук",
Кленова Наталья Анатольевна, д-р биол. наук, проф., klenova.ssu@yandex.ru, Россия, Самара, Самарский национальный исследовательский университет им. С.П. Королева,
Решетилов Анатолий Николаевич, д-р хим. наук, проф., зав. лабораторией, anatol@ibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр "Пущинский научный центр биологических исследований Российской Академии Наук"
THE STRAIN GLUCONACETOBACTER SUCROFERMENTANS VKPM B-11267 AS BASIS OF THE RECEPTOR ELEMENT OF AMPEROMETRIC BIOSENSOR
A.G. Bykov, O. V. Skripacheva, S.E. Tarasov, N.A. Klenova, A.N. Reshetilov
The possibility of using bacteria of the strain G. sucrofermentans B-11267 as part of the receptor element of the electrochemical biosensor is considered. Gluconobacter oxydans sbsp strain. industrius VKM B-1280 was used as a reference culture. Comparative characteristics of two strains are obtained. Calibration dependences for biosensors based on immobilized bacteria of the strain G. oxydans B-1280 and G. sucrofermentans B-11267 were constructed, and substrate specificity and impedance characteristics were compared for these strains. It was important to find out how the formation of bacterial cellulose on the cell surface affects the electrochemical characteristics of G. sucrofermentans B-11267 cells, including their general resistance.
Key words: bioreceptor, amperometric biosensor, impedance spectroscopy, Clark electrode.
Bykov Aleksandr Gennadievich, junior research scientist, agbykov@rambler.ru, Russia, Pushchino, Federal Research Center "Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences",
Skripacheva Olga Victorovna, student olga.screep@yandex.ru, Russia, Samara S.P. Korolev Samara National- Research University,
Tarasov Sergei Evgenievich, candidate of biological sciences, research scientist, setar25@gmail.com, Russia, Pushchino, Federal Research Center "Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences",
Klenova Natalia Anatolievna, doctor of biological sciences, professor, klenova.ssu@yandex.ru, Russia, Samara S.P. Korolev Samara National- Research University,
Reshetilov Anatoliy Nikolaevich, doctor of chemical sciences, professor, head of laboratory, anatol@,ibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, Federal Research Center "Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences"
