CC BY
26
УДК: 543.55 + 543.554
БИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ МЕМБРАННЫХ ФРАКЦИЙ GL UCONOBA CTER OXYDANS МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ТЕРМОРАСШИРЕННЫМ ГРАФИТОМ
А.Е. Китова, А.С. Медведева, А.Г. Быков, В.В. Колесов, А.Н. Решетилов
Изучены параметры биосенсора на основе мембранных фракций (МФ) бактерий Gluconobacter oxydans ВКМ В-1280 и электрода, полученного методом матричной печати. Поверхность измерительного электрода биосенсора была модифицирована терморасширенным графитом. При анализе этилового спирта чувствительность в области линейного диапазона составляла 2.25 мкА/мМ. Линейный диапазон детекции находился в пределах от 0.1 до 5 мМ. При анализе глюкозы чувствительность составляла 1.75 мкА/мМ, линейный диапазон - 0.5-2.0 мМ. Параметры МФ-биосенсора были сопоставимы с параметрами биосенсора на основе целых клеток. При этом линейный диапазон МФ-биосенсора превосходил в 2 раза данный параметр биосенсора на основе целых клеток.
Ключевые слова: мембранные фракции, Gluconobacter oxydans, печатный электрод, терморасширенный графит.
Введение
При разработке биосенсоров имеет значение выбор материала электрода и его модификация наноматериалами [1]. Материал электрода должен иметь высокую электропроводность, химическую стойкость, большую удельную поверхность и обладать биосовместимостью. Перспективным в этом отношении являются наноуглеродные графеноподобные материалы, например, терморасширенный графит (ТРГ). Ранее было показано, что модификация ТРГ печатных электродов на основе бактерий Gluconobacter oxydans и ферментов глюкозооксидазы или алкогольоксидазы позволяет существенно повысить амплитуду сигнала и чувствительность биосенсора к глюкозе или этиловому спирту [2, 3]. Также было показано, что увеличение амплитуды сигнала для модифицированных ТРГ электродов связано с уменьшением их внутреннего сопротивления [4]. В данной работе исследована возможность модификации с помощью ТРГ печатных электродов, содержащих иммобилизованные в геле хитозана мембранные фракции (МФ) бактерий G. oxydans. Мембранные фракции бактерий G. oxydans представляют собой фрагменты дыхательной цепи, содержащие PQQ-зависимые дегидрогеназы. Эффективное окисление этанола с участием МФ и редокс -медиаторов было показано в работе [5]. Использование ТРГ для создания безмедиаторных биоэлектродов на основе МФ клеток Gluconobacter было показано в работе [6].
Целью данной работы являлось исследование параметров биосенсора на основе мембранных фракций бактерий 01ысопоЬас1ег охуйат и печатного электрода, модифицированного ТРГ.
Материалы и методы
Штамм бактерий О. охуйат ВКМ В-1280 был получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН (Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН). Мембранные фракции выделяли в соответствии с методикой [5]. МФ штамма О. охуйат ВКМ B-1280 иммобилизовали на поверхности измерительного электрода в геле низкомолекулярного хитозана (Sigma-Aldrich, США). Смешивали в соотношении 1:1 биомассу и 2%-й раствор хитозана, 5 мкл смеси наносили на измерительный электрод.
Измерения проводили в кювете объемом 2 мл. В качестве базового раствора использовали 25 мМ калий-фосфатный буфер рН 6.0, содержащий 10 мМ хлорида натрия. В качестве редокс-медиаторов использовали гексацианоферрат(Ш) калия (ГЦФ) или 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) (Sigma-Aldrich, США). Анализируемыми субстратами являлись этиловый спирт и глюкоза. Для регистрации сигналов электрода использовали гальванопотенциостат IPCmicro (OOO "Кронас", Россия). Измерения проводили по трехэлектродной схеме. Хроноамперометрические зависимости регистрировали при потенциале 400 мВ. Циклические вольт-амперные характеристики регистрировали при скорости сканирования потенциала 3 мВ/с в диапазоне от 500 до - 500 мВ.
Результаты
На рис. 1 приведены калибровочные зависимости биосенсора на основе МФ при использовании в качестве медиатора ГЦФ (кривая 1) и ДХФИФ (кривая 2). Чувствительность в области линейного диапазона при использовании ГЦФ составляла 2.25 мкА/мМ. Линейный диапазон детекции находился в пределах от 0.1 до 5 мМ этанола. При использовании ДХФИФ чувствительность составляла 4.4 мкА/мМ, линейный диапазон детекции - 0.1 - 1 мМ. Для дальнейших измерений в качестве медиатора был выбран ГЦФ, так как при его использовании линейный диапазон биосенсора превосходил аналогичный параметр при использовании ДХФИФ.
Расчет кинетических констант в результате аппроксимации калибровочных зависимостей уравнением Хилла показал, что при использовании ГЦФ Ктах составляла 13.0 мкА, Км - 2.5 мМ. При выборе ДХФИФ в качестве медиатора Ктах составляла 6 мкА, KМ - 0.8 мМ.
На рис. 2 приведена калибровочная зависимость биосенсора на основе МФ при использовании в качестве медиатора ГЦФ и субстрата
глюкозы. Чувствительность в области линейного диапазона составляла 1.75 мкА/мМ. Линейный диапазон детекции находился в пределах от 0.5 до 2.0 мМ глюкозы. Кинетические константы Утях и Kм были равны, соответственно, 8.9 мкА и 2.8мМ.
14 -12 -
0 -
0 2 4 6 8 10 12
Этанол, мМ
Рис. 1. Калибровочные зависимости биосенсора на основе МФ при использовании в качестве медиатора ГЦФ (кривая 1) и ДХФИФ (кривая 2) для детекции этилового спирта
На рис. 3 приведены циклические вольт-амперные (ЦВА) характеристики биосенсора на основе МФ при использовании в качестве медиатора ГЦФ. ЦВА МФ-биосенсора (рис. 3, кривая 3), имела выраженные области окисления и восстановления медиатора при внесении этилового спирта и ГЦФ. При внесении субстрата (кривая 3) анодный ток возрастал в 3 раза, по сравнению с ЦВА в отсутствие субстрата (кривая 2) Ток анодного пика составлял 12 мкА при потенциале 200 мВ.
На рис. 4 приведены циклические вольт-амперные (ЦВА) характеристики биосенсора на основе МФ при использовании в качестве медиатора ДХФИФ. При внесении субстрата (кривая 3) анодный ток возрастал в 2 раза, по сравнению с ЦВА в отсутствие субстрата (кривая 2), ток анодного пика составлял 4 мкА при потенциале 500 мВ.
10
и
я
(-Н
О ев
Н
Ч С
10
12
Глюкоза, мМ
Рис. 2. Калибровочная зависимость биосенсора на основе МФ при использовании в качестве субстрата глюкозы
0.015
0.010
0.005 -
2 0.000
-0.005 -
-0.010 -
-0.015
-600
-400
-200
200
400
600
и, мВ
Рис. 3. ЦВА характеристики биосенсора на основе МФ при использовании в качестве медиатора ГЦФ: 1 - ЦВА в буферном растворе, 2 - ЦВА при добавлении ГЦФ, 3 - ЦВА при внесении этилового спирта и ГЦФ
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
0.006 -0.004 -0.002 -
0.000 -
§
М -0.002 --0.004 --0.006 --0.008 -
-600 -400 -200 0 200 400 600
и, мВ
Рис. 4. ЦВА характеристики биосенсора на основе МФ при использовании в качестве медиатора ДХФИФ: 1 - ЦВА в буферном растворе, 2 - ЦВА при добавлении ДХФИФ, 3 - ЦВА при внесении этилового спирта и ДХФИФ
В таблице приведены параметры МФ-биосенсора и биосенсора на основе целых клеток G. oxydans. Как следует из таблицы, характеристики биосенсоров отличались незначительно. При этом линейный диапазон МФ-биосенсора превосходил линейный диапазон биосенсора на основе целых клеток. Амплитуда сигнала МФ-биосенсора также превышала амплитуду клеточного биосенсора. Также следует отметить, что биосенсор на основе целых клеток также характеризовался в несколько раз более длительным откликом.
Параметры МФ-биосенсора и биосенсора на основе целых клеток
Биорецептор Чувствительность, мкА/мМ Линейный диапазон детекции, мМ Vmax, мкА мМ
МФ 2.2 0.1-5.0 13.0 2.5
Целые клетки G. oxydans 3.1 0.5-2.0 10.1 1.6
Выводы
Исследованы параметры биосенсора на основе мембранных фракций G. oxydans. Поверхность измерительного электрода биосенсора была модифицирована графеноподобным материалом терморасширенным графитом, имеющим высокую удельную поверхность и низкое удельное
сопротивление. Иммобилизацию МФ на поверхность электрода осуществляли путем их нанесения в геле хитозана. Методами циклической вольтамперометрии и хронопотенциометрии изучены характеристики биоэлектродов. Проведено сравнение МФ-биосенсора с параметрами биосенсора на основе целых клеток. Показано, что мембранные фракции обладают некоторыми преимуществами в качестве биокатализатора по сравнению с целыми клетками G. oxydans.
Список литературы
1. Veerubhotla R., Das D., Pradhan D. A flexible and disposable battery powered by bacteria using eyeliner coated paper electrodes // Biosensors and Bioelectronics. 2017. V. 94. P. 464-470.
2. Глюкозооксидазный биосенсор на основе печатного электрода, модифицированного терморасширенным графитом / А.Е. Китова., Ю.В. Плеханова, В.В. Колесов [и др.] // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2018. Вып. 2. С. 34-40.
3. Алкогольоксидазный биосенсор на основе печатного электрода, модифицированного терморасширенным графитом / А.Е. Китова., Ю.В. Плеханова, В.В. Колесов [и др.] // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2019. Вып. 1. С. 22-27.
4. Биосенсор на основе клеток Gluconobacter и терморасширенного графита / А.Н. Решетилов, А.Е. Китова, А.В. Мачулин [и др.] // Сенсорные системы. 2016. Т. 30. № 4. С. 351-354.
5. Interaction of ferrocene mediators with Gluconobacter oxydans immobilized whole cells and membrane fractions in oxidation of ethanol / Indzhgiya E., Ponamoreva O., Alferov V. [et al.] // Electroanalysis. 2012. V 24. № 4. P. 924 -930.
6. Mediator-free bioelectrocatalytic oxidation of ethanol on an electrode from thermally expanded graphite modified by Gluconobacter oxydans membrane fractions / A.N. Reshetilov, A.E. Kitova, V.V. Kolesov [et al.] // Electroanalysis. 2015. V. 27. № 6. P. 1443-1448.
Китова Анна Евгеньевна, канд. биол. наук, научный сотрудник, kitova@ibpm.pushchino. ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
Медведева Анастасия Сергеевна, студент, tasiamedvedeva15@yandex. ru, Россия, Самара, Самарский университет,
Быков Александр Геннадьевич, научный сотрудник, agbykov@rambler.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
Колесов Владимир Владимирович канд. физ.-мат. наук, зав. лабораторией, kvv@cplire.ru, Россия, Москва, Институт радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова РАН,
Решетилов Анатолий Николаевич, д-р хим. наук, проф., зав. лабораторией, anatol@,ibpm.pushchino. ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН
BIOSENSOR BASED ON MEMBRANE FRACTIONS OF GLUCONOBACTER OXYDANS MODIFIED BY THERMALLY EXPANDED GRAPHITE
A.E. Kitova, A.C. Medvedeva, A.G. Bykov, V.V. Kolesov, A.N. Reshetilov
The biosensor based on the membrane fractions (MF) of bacteria Gluconobacter ox-ydans VKM B-1280 and screen-printed electrode was studied. The surface of the biosensor measuring electrode was modified by thermally expanded graphite. In the analysis of ethanol, the sensitivity in the linear range was 2.25 /А/mM. The linear range of detection was 0.1-5 mM. In the analysis of glucose, the sensitivity was 1.75 /А/mM, the linear range was 0.5-2.0 mM. The parameters of the MF-biosensor were comparable with the parameters of a biosensor based on whole cells. The linear range of the MF-biosensor exceeded by 2 times the linear range of the biosensor based on whole cells.
Key words: membrane fractions, Gluconobacter oxydans, screen-printed electrode, thermally expanded graphite.
Kitova Anna Evgen'evna, candidate of biological sciences, researcher, kitova@,ibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Medvedeva Anastasiya Sergeevna, student, tasiamedvedeva15@yandex. ru, Russia, Samara, Samara University,
Bykov Alexander Gennad'evich, researcher, agbykov@rambler. ru, Russia, Pushchino, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Kolesov Vladimir Vladimirovich, candidate of of physical and mathematical sciences, manager of laboratory, kvv@cplire.ru, Russia, Moscow, V.A. Kotelnikov Institute of Radio Engineering and Electronics, Russian Academy of Sciences,
Reshetilov Anatoly Nikolaevich, doctor of chemical sciences, professor, manager of laboratory, anatol@ibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences
