CC BY
39
Пробл. особо опасных инф. 2018; 1:90-93. DOI: 10.21055/0370-1069-2018-1-90-93
УДК 616.932+579.842.11
Е.В.монахова, р.В.Писанов, Г.В.Демидова, н.Б.непомнящая ШТАММ ESCHERICHIA COLI- СУПЕРПРОДУЦЕНТ ГЕМОЛИЗИНА VIBRIO CHOLERAE
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт», Ростов-на-Дону,
Российская Федерация
целью работы явилось клонирование гена hlyA Vibrio cholerae в составе плазмидного вектора, обеспечивающего экспрессию чужеродных генов под контролем Т5-промотора, и создание штамма E. coli - суперпродуцента рекомбинантного гемолизина. материалы и методы. Донором ДНК служил штамм V. cholerae 01, векторной плазмидой - pQE30. Ген амплифицировали с помощью ПЦР, клонирование осуществляли общепринятыми методами, продуктивность рекомбинантов и локализацию искомого белка определяли по результатам электрофореза лизатов клеток. результаты и выводы. Сконструирована рекомбинантная плазмида pHlyA, экспрессирующая клонированный ген hlyA V. cholerae Эль Тор под контролем Т5-промотора при индукции ИПТГ. Содержащий ее штамм E. coli M15[pREP4]pHlyA является суперпродуцентом гемолизина: количество продукта в лизатах его целых клеток достигает 13 %, а в тельцах включения - 17 % суммарных клеточных белков. Продукт клонированного гена несмотря на отсутствие процессинга и присутствие на N-конце гексагистидинового блока (6His-tag) обладает гемолитической активностью по отношению к эритроцитам барана. Наличие 6His-tag позволит выделять очищенный препарат с помощью специфических сорбентов в целях создания диагностикумов, а также изучения значимости гемолизина как фактора патогенности/персистенции. Преимуществами данного продуцента являются высокий выход искомого белка, отсутствие способности к синтезу каких-либо дополнительных биологически активных субстанций, непродолжительный период наращивания биомассы (4-6 ч включая индукцию) и возможность культивирования без соблюдения режима работы с возбудителями особо опасных инфекций.
Ключевые слова: гемолизин Vibrio cholerae, клонирование генов, рекомбинантная плазмида, суперпродуцент.
Корреспондирующий автор: . Монахова Елена Владимировна, e-mail: monakhova_ev@antiplague.ru, unicorn54@mail.ru.
E.V.Monakhova, R.V.Pisanov, G.V.Demidova, N.B.Nepomnyashchaya Escherichia coli Strain - Super-Producer of Vibrio cholerae Hemolysin
Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute, Rostov-on-Don, Russian Federation
Objective of this work was the cloning of Vibrio cholerae hlyA gene in a plasmid vector providing expression of foreign genes under the control of T5 promoter, and construction of E. coli strain - super-producer of Vibrio cholerae recombinant hemolysin. Materials and methods. V. cholerae 01 strain served as a DNA donor, pQE30 - as a vector plasmid. The gene was PCR-amplified, cloning was carried out by means of conventional methods, productivity of recombinants and localization of the required protein was determined based on the results of electrophoresis of cell lysates. Results and conclusions. A recombinant plasmid pHlyA, expressing the cloned hlyA gene of Vibrio cholerae El Tor under the control of T5 promoter after IPTG induction, has been constructed. Carrying this plasmid strain E. coli M15[pREP4]pHlyA is the super-producer of hemolysin: the content of the product in whole cell lysates is up to 13 %, and in inclusion bodies - up to 17 % of the total cell proteins. The product of the cloned gene, in spite of the absence of proteolytic processing and presence of the hexahistidine block (6His-tag) at its N-terminus, possesses hemolytic activity towards sheep erythrocytes. 6His-tag will provide for obtaining a purified preparation on specific sorbents with a view to create diagnosticums as well as to study the significance of hemolysin as a pathogenicity/persistence factor. The advantages of this producer are the high output of the required protein, inability of synthesis of any accessory biologically active substances, short-term period of biomass growing (4-6 h including induction) and possibility of culturing without sticking to the guidelines for work with the agents of particularly dangerous infections.
Key words: Vibrio cholerae hemolysin, gene cloning, recombinant plasmid, super-producer.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Corresponding author: Elena V. Monakhova, e-mail: monakhova_ev@antiplague.ru.
Citation: Monakhova E.V., Pisanov R.V., Demidova G.V., Nepomnyashchaya N.B. Escherichia coli Strain - Super-Producer of Vibrio cholerae Hemolysin. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2018; 1:90-93. (In Russian). DOI: 10.21055/0370-1069-2018-1-90-93
Растворимый гемолизин (Н1уА) холерных вибрионов Эль Тор является одним из факторов пато-генности холерных вибрионов Эль Тор [4], а также, по всей видимости, может способствовать их перси-стенции в объектах окружающей среды, поскольку подавляет рост других бактерий и беспозвоночных [5, 9]. В нашей стране способность к его продукции до настоящего времени используется в качестве показателя отсутствия токсигенности и эпидемической опасности возбудителей [3]. Обычно гемолитич-
ность штаммов проверяют в пробе Грейга. Данный метод имеет ряд существенных недостатков в связи с нестандартностью и необходимостью постоянно иметь в распоряжении свежие эритроциты барана, что возможно далеко не во всех диагностических лабораториях, а консервированные, как показывает практика, дают нестабильные результаты. Это обусловливает актуальность разработки альтернативных диагностикумов на основе специфических антител. в свою очередь, для их создания требуются
препаративные количества искомого антигена, наиболее эффективным способом получения которых остается использование лабораторных штаммов E. coli - эффективных продуцентов рекомбинант-ных белков. Ранее нами был сконструирован штамм E. coli D1210pES4H, содержащий в составе рекомби-нантной плазмиды pES4H, помимо гена hlyA, гены hlyB и lipA и экспрессирующий их под контролем собственных промоторов [1]. Неконтролируемая экспрессия и наличие в клетках нецелевых продуктов дополнительных генов затрудняли очистку искомого белка. Такими же недостатками обладали и плазмиды, сконструированные другими авторами - pPM431 [7] и pSG1012 [6], содержащие в составе векторной плазмиды pBR322 фрагменты ДНК V. cholerae длиной соответственно 6,2 и 3,6 т.п.н., включающие ген hlyA, хотя выделение препарата не входило в задачи исследований авторов, и продуктивность содержащих эти плазмиды штаммов (трансформантов E. coli K-12) осталась неизвестной.
Поэтому целью настоящей работы явилось клонирование гена hlyA в составе плазмидного вектора, обеспечивающего экспрессию чужеродных генов под контролем мощного Т5-промотора, и создание штамма E. coli - суперпродуцента рекомбинантного гемолизина V. cholerae.
Материалы и методы
Донором ДНК для клонирования гена hlyA служил высокогемолитичный нетоксигенный штамм V. cholerae 01 9337 биовара Эль Тор, реципиентами - штаммы E. coli HB101, C600, BW, Jm101, Jm103, JM109, Stratagen, M15[pREP4].
Геномную ДНК выделяли с помощью комплекта реагентов «Проба-НК» (ДНК-Технология, Россия), плазмидную - методом Бирнбойма, как описано ранее [1, 2].
В качестве векторной плазмиды использовали pQE30 (QIAGEN). Праймеры для клонирования конструировали с помощью Vector NTI Advance 11 (Invitrogen). Фрагмент и вектор гидролизовали эн-донуклеазами BamHI и PstI и лигировали Т4-ДНК-лигазой в прилагаемых буферах согласно рекомендациям изготовителя (ThermoScientific, USA). Лигазными смесями трансформировали компетентные клетки E. coli Jm103, приготовленные накануне обработкой хлористым кальцием. После стандартной процедуры трансформации (0 °С - 40 мин, 42 °С -2 мин, 0 °С - 5 мин) клетки разводили в 10 раз средой LB с 0,5 % глюкозы, подращивали в течение 1 ч и высевали на агар LB, содержащий 50 мкг/мл ампициллина и 0,5 % глюкозы. Посевы инкубировали при 37 °с и на следующие сутки отбирали ампициллин-резистентые колонии.
Рекомбинантные клоны идентифицировали по результатам ПЦР и наличию гемолитической активности по отношению к эритроцитам барана в лунках кровяного агара. Далее из них выделяли плазмид-
ную ДНК и подтверждали наличие вставок рестрикцией BamHI и PstI с последующим электрофорезом в 0,7 % агарозном геле.
Для оценки уровней экспрессии гена в разных штаммах E. coli, трансформированных рекомбинант-ной плазмидой, их выращивали в бульоне LB, содержащем 50 мкг/мл ампициллина, с шуттелированием в течение 4 ч, затем добавляли индуктор ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и продолжали шутте-лирование в течение еще 1,5 ч. Затем клетки осаждали центрифугированием, растворяли осадок в лизис-буфере при 100 °С и подвергали SDS-электрофорезу в 10 % полиакриамидном геле (ПААГ). Процентное содержание искомого продукта относительно суммарных клеточных белков оценивали с помощью программы Quantity One. Для определения локализации рекомбинантного белка клетки продуцентов разрушали ультразвуком на дезинтеграторе QSonica Q700 в течение 10 мин (40 импульсов по 5 с, 357 Дж с перерывами в 10 с; амплитуда 50) и подвергали электрофорезу растворимую (н/о) и нерастворимую (ос) фракции клеток, разделенные центрифугированием.
Результаты и обсуждение
На основе анализа нуклеотидной последовательности гена VCA0218 (в составе малой хромосомы) V. cholerae N16961 (AE003853) нами были сконструированы специфические праймеры для ПЦР-амплификации гена hlyA (5'-3'): прямой -TGAGGGATCCATGCCAAAACTCAATCGTTGC и обратный - CCTGCTGCAGCAGGGCATGCTTC CATTGTT. Поскольку амплификат необходимо было встроить в pQE30 в ориентации, обеспечивающей направление транскрипции под контролем Т5-про-мотора, на 5'-конце каждого праймера был внесен сайт рестрикции для эндонуклеазы, образующей липкие концы: BamHI для прямого праймера и PstI -для обратного (в приведенных последовательностях выделены жирным шрифтом и подчеркнуты) в соответствии с порядком расположения сайтов рестрикции в полилинкере векторной плазмиды.
схема конструирования рекомбинантной плаз-миды pHlyA показана на рис. 1. На электрофоре-грамме ее BamHI-PstI-рестрикта присутствовало два фрагмента размерами ~3,5 и ~2,3 т.п.н., что соответствовало таковым вектора и гена hlyA. Затем эта плазмида была трансформирована в несколько штаммов E. coli: HB101, C600, BW, Jm101, Jm103, JM109, Stratagen, M15[pREP4]. Тестирование бульонных культур трансформантов, выращенных с ампициллином и индуктором иПТг в лунках кровяного агара, показало, что наилучшая продукция гемолизина обеспечивалась клонами штаммов E. coli M15[pREP4] pHlyA и Jm103pHlyA, и именно они были выбраны для дальнейшего тестирования.
Как известно, в клетках E. coli, в отличие от V. cholerae, гемолизин не подвергается протеолити-
Рис. 1. Схема конструирования реком-бинантной плазмиды pHlyA
ческому процессингу и синтезируется в виде про-гемолизина (proHlyA) с молекулярной массой (ММ) около 82 кДа, обладающего, тем не менее, гемолитической активностью, хотя и пониженной по сравнению со зрелой формой HlyA (65,6 кДа) [4, 8]. Кроме того, рекомбинантный белок должен содержать на N-конце гексагастидиновый блок (6His-tag) и иметь MM ~83 кДа. Поэтому после электрофореза лизатов клеток в ПААГ мы фиксировали наличие мажорной полосы в этом диапазоне. Как видно из рис. 2А, значи-
Рис. 2. Продукция proHlyA рекомбинантными штаммами E. coli, выращенными с индукцией ИПТГ (SDS-электрофорез в 10 % ПААГ):
А - лизаты целых клеток: 1 - Jm103pQE30, 2 - Jm103pHlyA, 3 -M15[pREP4]pHlyA, 4 - M15[pREP4]pQE30; Б - растворимая (н/о) и нерастворимая (ос) фракции ультразвуковых дезинтегратов
тельное увеличение количества белка с ММ ~83 кДа (соответствующей ММ 6His-proHlyA) наблюдалось только в лизате клеток E. coli M15[pREP4]pHlyA, в отличие от таковых Jm103pHlyA и обоих контрольных штаммов, содержащих векторную плазмиду без вставки. По данным программы Quantity One, количество продукта в лизате M15[pREP4]pHlyA составляло ~13 % суммарных клеточных белков. Для определения локализации рекомбинантного белка электрофорезу подвергали растворимую (н/о) и нерастворимую (ос) фракции клеток, разделенных центрифугированием. Искомый белок выявлен в нерастворимой фракции (тельцах включения) штамма M15[pREP4]pHlyA (рис. 2Б), где его содержание составляло ~17 % суммарных клеточных белков.
Таким образом, нами сконструирован штамм E. coli - суперпродуцент рекомбинантного белка proHlyA. В случае необходимости получения зрелой формы HlyA с ММ 65 кДа, обладающей повышенной гемолитической и цитолитической активностью, прогемолизин может быть подвергнут протеолити-ческому процессингу с помощью обработки трипсином либо гемагглютинин/протеазой [4, 8].
преимуществами полученного продуцента по сравнению с холерными вибрионами является высокий выход искомого белка, отсутствие способности к синтезу каких-либо дополнительных биологически активных субстанций, которые могли бы затруднить
его выделение и очистку, возможность культивирования без соблюдения режима работы с возбудителями особо опасных инфекций, а по сравнению с известными рекомбинантными штаммами E. coli [1, 2, 6, 7] - непродолжительный период наращивания биомассы (4-6 ч включая индукцию), что обеспечит ускоренное получение препарата.
Штамм E. coli M15[pREP4]pHlyA депонирован в ГКПБ «Микроб» под номером КМ 2028.
конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Власов В.П., Монахова Е.В., Ушакова И.Е., Михась Н.К., Данилкина Е.Б., Ломов Ю.М. Гемолизин Vibrio cholerae eltor: клонирование и экспрессия генов в Escherichia coli. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1992; 7-8:14-20.
2. Монахова Е.В., Писанов Р.В., Гончарова Л.А., Михась Н.К., Непомнящая Н.Б., Асеева Л.Е., Каграманов В.С. Клонирование и экспрессия гена гемагглютинин/протеазы (hapA) Vibrio cholerae в Escherichia coli. Биотехнология. 2006;
3. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М.: ЗАО «Шико», 2013. 560 с.
4. Banerjee K.K., Mazumdar B. Vibrio cholerae hemolysin: an enigmatic pore-forming toxin. In: T. Ramamurthy, S.K. Bhattacharya, eds. Epidemiological and molecular aspects on cholera . Springer Science+Business Media; 2011. P. 277-90.
5. Cinar H.N., Kothary M., Datta A.R., Tall B.D., Sprando R., Bilecen K., Yildiz F., McCardell B. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuola-tion in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 2010; 5(7):e11558. DOI: 10.1371/journal.pone.00n558.
6. Goldberg S.L., Murphy J.R. Molecular cloning of the hemolysin determinant from Vibrio cholerae El Tor. J. Bacteriol. 1984; 160(1Y239-44.
7. Manning P.A. Brown M.H Heuzenroeder M.W. Cloning of the structural gene (hly) of Vibrio cholerae El Tor strain 017. Gene. 1984; 31:225-31.
8. Nagamune K., Yamamoto K., Naka A., Matsuyama J., Miwatani T., Honda T. In vitro processing and activation of the recombinant precursor of El Tor cytolysin/hemolysin (pro-HlyA) of Vibrio cholerae by soluble hemagglutinin/protease of V. cholerae, trypsin and other proteases. Infect. Immun.
9. Ruenchit P., Reamtong O., Siripanichgon K., Chaicumpa W., Diraphat P. New facet oinon-O1/non-O139 Vibrio cholerae hemolysin A: a competitive factor for the environmental niche. FEMSMicrobiol. Ecol. 06 Sept 2017. DOI: 10.1093/femsec/fix113. [Epub ahead of print].
References
1. Vlasov V.P., Monakhova E.V., Ushakova I.E., Mikhas' N.K., Danilkina E.B., Lomov Yu. M. [Hemolysin of Vibrio cholerae El Tor: gene cloning and expression in Escherichia coli]. Mol. Gen. Microbiol. Virusol. 1992; 7-8:14-20.
2. Monakhova E.V., Pisanov R.V., Goncharova L.A., Mikhas' N.K., Nepomnyashchaya N.B., Aseeva L.E., Kagramanov V.S. [Cloning and expression of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease gene (hapA) in Escherichia coli]. Biotechnology in Russia. 2006; 6;8-20.
3. Onischenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Dangerous Infectious Diseases. Practice Guidelines]. Moscow: "Shiko"; 2013. 560 p.
4. Banerjee K.K., Mazumdar B. Vibrio cholerae hemolysin: an enigmatic pore-forming toxin. In: T. Ramamurthy, S.K. Bhattacharya, eds. Epidemiological and molecular aspects on cholera . Springer Science+Business Media; 2011. P. 277-90.
5. Cinar H.N., Kothary M., Datta A.R., Tall B.D., Sprando R., Bilecen K., Yildiz F., McCardell B. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 2010; 5(7):e11558. DOI: 10.1371/journal.pone.0011558.
6. Goldberg S.L., Murphy J.R. Molecular cloning of the hemolysin determinant from Vibrio cholerae El Tor. J. Bacteriol. 1984; 160(1):239-44.
7. Manning P.A., Brown M.H., Heuzenroeder M.W. Cloning of the structural gene (hly) of Vibrio cholerae El Tor strain 017. Gene. 1984; 31:225-31.
8. Nagamune K., Yamamoto K., Naka A., Matsuyama J., Miwatani T., Honda T. In vitro processing and activation of the recombinant precursor of El Tor cytolysin/hemolysin (pro-HlyA) of Vibrio cholerae by soluble hemag-glutinin/protease of V. cholerae, trypsin and other proteases. Infect. Immun. 1996; 64(11):4655-8.
9. Ruenchit P., Reamtong O., Siripanichgon K., Chaicumpa W., Diraphat P. New facet of non-O1/non-O139 Vibrio cholerae hemolysin A: a competitive factor for the environmental niche. FEMS Microbiol. Ecol. 06 Sept 2017. DOI: 10.1093/femsec/fix113. [Epub ahead of print].
Authors:
Monakhova E.V., Pisanov R.V., Demidova G.V., Nepomnyashchaya N.B. Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute. 117/40, M.Gor'kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation. E-mail: plague@aaanet.ru.
об авторах:
Монахова Е.В., Писанов Р.В., Демидова Г.В., Непомнящая Н.Б. Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт. Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117/40. E-mail: plague@aaanet.ru.
Поступила 06.02.18. Принята к публ. 01.03.18.
