CC BY
57
УДК 616.932:576.8
Р.В.Писанов, Е.В.Монахова, Л.П.Алексеева, О.В.Маркина, Л.А.Гончарова ШТАММ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ZOT-ТОКСИНА VIBRIO CHOLERAE
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
Ген zonula occludens toxin (zot) Vibrio cholerae, амплифицированный с помощью ПЦР, клонирован в составе векторной плазмиды pQE30 по сайтам BamHI-HindIII. Экспрессия гена происходит под контролем Т5-промотора. Штамм Escherichia coli M15[pREP4]pZot69, содержащий рекомбинантную плазмиду, является активным продуцентом белка 6His-Zot, который обладает биологической активностью на модели культур клеток, вызывая разрушение межклеточных плотных контактов в монослое. Продукт присутствует в клетках кишечной палочки в виде телец включения. Штамм-продуцент может быть использован для получения препаратов Zot в целях изучения его значимости как фактора вирулентности холерных вибрионов, как агента, повышающего проницаемость кишечника для некоторых лекарственных препаратов, и как адъюванта при иммунизации.
Ключевые слова: zonula occludens toxin, холерный вибрион, клонирование генов, рекомбинантная плазмида
Zonula occludens toxin относят к числу дополнительных факторов вирулентности холерных вибрионов [7]. Кодирующий его ген zot вместе с генами cep, orfU, ace и ctxAB входит в состав коровой области генома умеренного филаментозного фага СТХф, интегрированного в хромосому Vibrio cholerae и способного к горизонтальной передаче перечисленных генов от штамма к штамму [13]. Zot представляет собой белок с двойной функцией, являясь одновременно необходимой составляющей фагового морфогенеза [6, 13] и аналогом эукариотического модулятора межклеточных плотных контактов (tight junctions, tj) зонулина [7]. Оба белка имеют общий рецептор и механизм действия, состоящий в разрушении tj за счет полимеризации клеточного актина, что приводит к усилению проницаемости тканей и может обеспечивать более свободный доступ других токсинов, в том числе холерогена, к клеточной мембране [8, 9].
Установлено, что первичный продукт гена zot представляет собой белок с молекулярной массой (ММ) 45 кДа, который подвергается процессингу предположительно за счет специфических протеаз, синтезируемых холерными вибрионами, в результате чего образуются две молекулы. Первая из них (N-терминальная часть исходной формы размером 33 кДа) остается связанной с клеточной поверхностью и, скорее всего, является одной из субъединиц капсида СТХф, тогда как вторая (С-терминальный фрагмент размером ~12 кДа) секретируется в просвет кишечника и обусловливает биологическое действие токсина [7].
Вместе с тем роль Zot как в патогенезе типичной холеры, так и в качестве самостоятельного фактора вирулентности нехолерогенных штаммов холерных вибрионов, содержащих неполный (ActxAB) СТХ-элемент [4], в том числе выделяемых от больных острой диареей на территории России и пограничных государств [2], изучена далеко не достаточно.
В последнее десятилетие Zot также широко исследуется в качестве агента, повышающего проницаемость кишечника и других тканей для лекарственных препаратов, обычно оказывающих терапевтическое действие только при парентеральном вве-
дении. Например, у крыс с экспериментальным диабетом пероральное введение инсулина совместно с Zot приводило к снижению содержания глюкозы в сыворотке крови до такого уровня, который наблюдался после парентерального введения гормона [9]; аналогичные данные получены и на приматах [7, 14]. Результаты этих экспериментов обнадеживают в плане возможности замены в недалеком будущем парентерального использования целого ряда терапевтических средств на пероральное [7]. Интересны и экспериментальные данные о применении Zot в качестве адъюванта при интраназальной иммунизации мышей различными белками [10, 12]. В частности, иммунизация мышей столбнячным анатоксином с добавлением Zot обеспечивала полную защиту против столбнячного токсина [11].
Дальнейшие исследования в указанных направлениях требуют наличия очищенных препаратов Zot. Получение их из штаммов V. cholerae представляется малоэффективным и сопряжено с рядом трудностей. Поэтому одним из перспективных решений данной задачи является клонирование гена zot в составе плазмидных векторов и создание продуцентов на основе лабораторных штаммов E. coli.
Ранее мы сообщали [3] о конструировании штаммов E. coli, экспрессирующих клонированный в составе векторной плазмиды pUC19 ген zot под контролем собственного промотора и lacZ-промотора, но продукция Zot этими штаммами была недостаточно высокой. В литературе имеются сообщения о рекомбинантных штаммах E. coli BL21 (DE3), экспрессирующем клонированный в составе pET28(+) ген zot под контролем Т7-промотора [15], и E. coli M15[pREP4], содержащем zot в составе pQE30 [5]. Использование этих штаммов позволяет получать искомый белок в препаративных количествах, однако такой продуцент отсутствует в распоряжении отечественных исследователей. Поэтому целью настоящей работы явилось клонирование гена zot с использованием вектора pQE30, обеспечивающего экспрессию чужеродных генов под контролем мощного Т5-промотора, и создание штамма E. coli - продуцента функционально активного белка Zot V. cholerae.
Материалы и методы
Донором ДНК для амплификации гена zot служил штамм V. cholerae О1 569В классического биовара.
В качестве хозяина для трансформации рекомбинантных плазмид использовали штаммы E. coli Jm103 (thi, strA, endA, sbcB15, hsdR4, A(lac-proAB), [F’, traD36, proAB, lacIqZ AM15]) (Pharmacia) и M15[pREP4] (NaIS, StrS, RifS, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-, RecA+, Uvr+, Lon+) (QIAGEN). В качестве вектора для клонирования использовали плазмиду pQE30 (QiAGEN).
Для культивирования штамма E. coli Jm103 использовали жидкую и агаризованную среду LB, для M15[pREP4] к средам добавляли 25 мг/мл канами-цина, а для соответствующих рекомбинантов - дополнительно 50 мкг/мл ампициллина и 0,5 % глюкозы. В качестве индуктора использовали изопропил-ß-D-тиогалактозид (ИПТГ) в конечной концентрации 1 мМ.
Хромосомную и плазмидную ДНК выделяли из клеток холерных вибрионов и кишечной палочки в соответствии с общепринятыми методами [1].
Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей и конструирование праймеров для амплификации клонируемого фрагмента ДНК осуществляли с помощью пакета программ Vector NTI Suit 9, для детекции гена zot использовали праймеры, сконструированные нами ранее [3]; синтез праймеров выполнен ООО «Сиб-Энзим» (г. Новосибирск). Амплификацию проводили на амплификаторе «Терцик МЦ-2» («ДНК-техно-логия»). По окончании реакции смесь подвергали электрофорезу в 0,7 % агарозном геле в трис-ацетат-ном буфере в присутствии 0,5 мкг/мл бромистого этидия, затем просматривали в ультрафиолетовом свете, вырезали участок геля с амплифицированным фрагментом размером 1220 п.н., последний выделяли элюцией, очищали смесью фенол : хлороформ : изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1 и осаждали этиловым спиртом.
ДНК плазмиды и амплификатов гена zot расщепляли эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII (Fermentas UAB) в течение 3-4 ч в соответствующем каждому ферменту буфере. Линейную форму плазмиды и амплификаты после рестрикции очищали в 0,7 % агарозном геле и лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 (Fermentas UAB) согласно рекомендациям изготовителя. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli Jm103, приготовленные с помощью обработки хлористым кальцием [1]. Трансформанты высевали на агар LВ, содержащий 50 мкг/мл ампициллина и 0,5 % глюкозы. Посевы культивировали при 37 °С в течение ночи. Отбирали ампициллинрезистентные колонии и определяли присутствие zot с помощью праймеров для детекции гена. Из позитивных клонов выделяли плаз-мидную ДНК, подтверждали наличие в ней вставки гена zot рестрикцией BamHI и HindIII с последующим электрофорезом в агарозном геле.
Рекомбинантной плазмидой трансформировали компетентные клетки E. coli M15[pREP4]; полученные рекомбинантные клоны проверяли на присутствие гена zot и плазмиды, как описано выше.
Для определения способности рекомбинантов к
продукции Zot их выращивали в жидкой среде LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина (без глюкозы) в течение 3-4 ч и индуцировали 1 мМ ИПТГ в течение 1, 2, 3 и 4 ч при 37 °С с шуттелированием при 150 об/мин. Контролем служил штамм, содержащий векторную плазмиду pQE30 без вставки. Клетки осаждали центрифугированием, лизировали в буфере, содержащем 65 мМ трис-НС1 (pH 6,8), 1 % SDS и 10 мМ 2-меркаптоэтанола, при температуре 96 °С в течение 10 мин. Лизат подвергали электрофорезу в 10 % полиакриламидном геле (ПААГ) с SDS и окрашивали гель Coomassi Blue R250.
Для определения локализации искомого продукта осадки клеток ресуспендировали в 50 мМ Na-фосфатном буфере (pH 8,0), содержащем 1 мМ фе-нилметилсульфонилфторида (PMSF) и 2 мг/мл ли-зоцима, инкубировали на льду в течение 30 мин, добавляли тритон X-100 до 1 % и ДНКазу до 5 мкг/мл, продолжали инкубацию на льду в течение 10 мин, затем замораживали в жидком азоте. После размораживания разделяли растворимую и нерастворимую фракции центрифугированием, добавляли к обеим лизис-буфер, прогревали при 100 °С в течение 10 мин и исследовали в электрофорезе. Процентное содержание Zot по отношению к суммарным клеточным белкам определяли с помощью программы Quantity One.
Для получения препарата-сырца Zot нерастворимую фракцию клеток рекомбинантного штамма, выращенного с индукцией ИПТГ, растворяли в 8 М мочевине, разбавляли равным объемом 10 мМ трис-HCl (рН 8,0), осветляли центрифугированием и подвергали многоступенчатому диализу с постепенным снижением концентрации мочевины в диализном буфере. Содержание общего белка в полученном таким образом препарате определяли методом Лоури.
Для оценки биологической активности Zot использовали культуры клеток эпителия тонкого кишечника человека СаСо2 и фибробластов мышей L-929 из Российской коллекции клеточных культур (Санкт-Петербург). Клетки культивировали соответственно в среде DMEM (Sigma) с 10 % сыворотки плода коровы в течение 5-7 сут и RPMI-1640 (Sigma) с 1 % сыворотки плода коровы в течение 12 сут (до образования плотного монослоя). Испытуемый препарат в разведениях 1:10 - 1:1600 вносили в 96-луночные планшеты с плотным клеточным монослоем и инкубировали в ССЬ-инкубаторе (Sanjo) при 37 °С. Морфологическое изучение культуры проводили в течение 2 дней с помощью инвертированного микроскопа (Reichert). Для фотографирования клетки фиксировали формалином и окрашивали по Романовскому-Гимза.
Результаты и обсуждение
На основе анализа нуклеотидной последовательности гена VC1458 (AE0038852) нами были сконструированы праймеры для ПЦР -синтеза гена zot (AF220606, AF414369, AF542088, AF542089):
прямой -
5'-CGTTGGATCCATGAGTATCTTTATTCATC-3 '
и обратный -5'-AAATAAGCTTTCAAAATATACTATTTAGTC-3'.
Поскольку амплификат необходимо было
встроить в плазмидный вектор pQE30 в ориентации, обеспечивающей направление транскрипции под контролем Т5-промотора, на 5'-конце каждого праймера внесен сайт рестрикции для эндонуклеазы, образующей липкие концы: BamHI для прямого праймера и HindIII - для обратного (в приведенных последовательностях выделены жирным шрифтом и подчеркнуты) в соответствии с порядком расположения сайтов рестрикции в полилинкере векторной плазмиды.
ПЦР-амплификат гена zot длиной 1,2 т.п.н. был встроен в плазмиду pQE30, как описано в разделе «Материалы и методы». Использованный нами плазмидный вектор несет ген устойчивости к ампициллину (bla) и содержит промоторно-операторную область, включающую Т5-промотор и два расположенных тандемом 1ас-оператора, обеспечивающих максимальную репрессию синтеза Zot в присутствии глюкозы, а также синтетический сайт связывания рибосомальной РНК, старт-кодон, последовательность триплетов, кодирующих синтез гексагистидина (6His), полилинкер (MCS) и два терминатора транскрипции (t0 фага лямбда и Т1 из rrnB-опе-рона E. coli). Экспрессия клонированных генов происходит при индукции ИПТГ и начинается с плаз-мидного старт-кодона, при этом образуется гибридный белок, перед первой аминокислотой которого располагается гексагистидиновый блок (6His-tag). В ожидаемом продукте на N-конце должно было содержаться 12 дополнительных аминокислотных остатков, первые 6 из которых представляли 6His-tag.
В результате трансформации компетентных клеток E. coli Jm103 лигазной смесью получены клоны, несущие рекомбинантную плазмиду, обозначенную pZot69 (рис. 1). Гидролиз этой плазмиды BamHI и HindIII с последующим электрофорезом в агарозном геле подтвердил наличие вставки размером 1,2 т.п.н. Рекомбинантные клоны штамма E. coli Jm103pZot69, однако, не выдерживали длительного хранения на питательных средах даже в присутствии глюкозы и требовали частых пересевов, вероятно, в связи с недостаточно эффективной репрессией Т5-промотора и токсичностью Zot для E. coli. С целью создания более жизнеспособного продуцента мы транформировали pZot69 в штамм M15[pREP4], содержащий низкокопийную плазмиду pREP4, обеспечивающую дополнительную ре-
finftlt
Liiréë* 6) transcrptjonal fc*r»mnjîior r«f ton
mfl Tl tron^or pbonai t»*irnat4>n rt^on
I 4625 n.H. I
Пит l| Ша /
ht
Рис. 1. Схема плазмиды pZot69
прессию Т5-промотора за счет конститутивной экспрессии входящего в ее состав гена lacI. Действительно, трансформанты оказались более жизнеспособными по сравнению с таковыми Jm103pZot69.
Полученный таким образом штамм E. coli M15[pREP4]pZot69 депонирован в ГКПБ «Микроб» под № КМ193.
После SDS-электрофореза лизатов клеток E. coli M15[pREP4]pZot69, выращенных с индукцией, в 10 % ПААГ выявлена белковая линия с ММ ~46 кДа, которая отсутствовала как в лизате клеток, выращенных без индукции, так и у контрольного штамма, содержащего векторную плазмиду (рис. 2А). Увеличение времени индукции от 1 до 4 ч не привело к повышению/снижению количества продукта, которое составляло, по данным программы Quantity One, приблизительно 6-7 % суммарных клеточных белков. Эти данные свидетельствуют о способности рекомбинантного штамма к активной экспрессии клонированного гена в присутствии ИПТГ.
Для определения локализации рекомбинантного Zot электрофорезу были подвергнуты также растворимая и нерастворимая фракции клеток (рис. 2Б). Как видно из рисунка, белок с ММ ~46 кДа был выявлен в нерастворимой фракции (тельцах включения), где его содержание составляло —18—21 % суммарных клеточных белков.
Как было показано выше, рекомбинантный белок Zot, продуцируемый штаммом кишечной палочки, имел ММ —46 кДа, соответствующую рассчитанному значению для 6His-Zot, т.е. он не подвергался протеолитическому процессингу. Тем не менее, из литературных данных известно, что гиб-
А Б
ММ. мм.
12 3 4 # I 2 3 4 кДа
Рис. 2. SDS-электрофорез в 10 % ПААГ:
А - лизатов клеток рекомбинантных штаммов E. coli M15[pREP4], содержащих плазмиды pZot69 (дорожки 1, 2) и pQE30 (3, 4), выращенных без индукции (1, 3) и с индукцией ИПТГ (2, 4);
Б - нерастворимой (1, 3) и растворимой (2, 4) фракций выращенных с индукцией ИПТГ клеток E. coli M15[pREP4], содержащих плазмиды pQE30 (1, 2) и pZot69 (3, 4).
Рекомбинантный белок 6His-Zot указан стрелкой
Рис. 3. Действие препарата-сырца 6His-Zot
на культуры клеток CaCo2 (слева) и L-929 (справа).
Верхний ряд - контроль, нижний - разрушение tj под действием Zot
ридные молекулы Zot, содержащие дополнительные аминокислотные последовательности других белков либо олигопептидов, не утрачивали биологической активности [5, 11, 12]. Поэтому следующим этапом нашего исследования явилось доказательство того, что 6His-Zot, продуцируемый штаммом E. coli M15[pREP4]pZot69, сохраняет свойства, описанные для препаратов, полученных из холерных вибрионов. Мы исследовали его активность по отношению к культурам клеток тонкого кишечника CaCo2 и L-929, поскольку ранее нами была показана адекватность этих моделей для определения биологического действия Zot [3]. Кроме того, T.L.Watts [15] достоверно установлено присутствие на поверхности CaCo2 рецепторов Zot/зонулина. После внесения разведений препарата из нерастворимой фракции клеток E. coli M15[pREP4]pZot69 в лунки с плотным монослоем культуры уже в первые часы границы между клетками становились нечеткими, а на следующие сутки происходило отделение клеток друг от друга и увеличение межклеточного пространства, что постепенно приводило к образованию в монослое многочисленных «дыр» (рис. 3). Данный эффект вызывали разведения препарата Zot с содержанием общего белка >100 нг/мл. Такой же препарат из клеток контрольного штамма не вызывал никаких изменений, т.е. клетки плотно прилегали друг к другу, образуя сплошной монослой (рис. 3). Поэтому мы сочли наиболее вероятным, что разрушение tj происходило именно за счет действия Zot.
Таким образом, гибридный рекомбинантный белок Zot несмотря на отсутствие процессинга и присутствие в его молекуле дополнительных аминокислотных остатков обладает описанной для него биологической активностью - способностью вызывать разрушение tj в культурах клеток.
Использование рекомбинантного штамма E. coli M15[pREP4]pZot69 (КМ 193) в качестве про-
дуцента Zot в перспективе позволит выделять очищенный препарат с использованием специфически связывающих 6№8-белки сорбентов в целях изучения его значимости как фактора вирулентности холерных вибрионов, как агента, повышающего проницаемость кишечника для некоторых лекарственных препаратов и как адъюванта при иммунизации.
Преимуществом предлагаемого продуцента по сравнению с холерными вибрионами является также то, что его культивирование не требует соблюдения режима работы с возбудителями особо опасных инфекций.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Манниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии: Молекулярное клонирование / Пер. с англ. - М.: Мир, 1984. - 2. Монахова Е.В., Писанов Р.В., Михась Н.К. и др. // Журн. микробиол. - 2004. - № 2. -
C. 23-29. - 3. Писанов Р.В., Гончаров Е.К., Монахова Е.В. и др. // Мол. генет. - 2005. - № 1. - С. 28-32. - 4. Boyd E.F., Heilpern A.J., Waldor M.K. // J. Bacteriol. - 2000. -Vol. 182, N 19. - P. 5530-5538. - 5. Di Pierro M.D., Lu R., Uzzau S. et al. // J. Biol. Chemistry. - 2001. - Vol. 276, N 22. -P. 19160-19165. - 6. Faruque S.M., Albert M.J., Mekala-nos J.J. // Microbiol. Mol. Biol. Rew. - 1998. - Vol. 62, N 4. -P. 1301-1314. - 7. Fasano A. // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2001. -N 915. - P. 214-222. - 8. Fasano A., Baudry B., Pumplin
D.W. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. - Vol. 88. -P. 5242-5246. - 9. Fasano A., Uzzau S. // J. Clin. Invest. -1997. - Vol. 99, N 6. - P. 1158-1164. - 10. Marinaro M., Di Tomasso A., Uzzau S. et al. // Infect. Immun. - 1999. - Vol. 6, N 3. - P. 1287-1291. - 11. Marinaro M., Fasano A., De Magistris M.T. // Infect. Immun. - 2003. - Vol. 71, N 4. -P. 1897-1902. - 12. Rossi M., Maurano F., Luongo D. // Immunol. Lett. - 2002. - Vol. 81, N 3. - P. 217-221. - 13. Waldor M.K., Mekalanos J.J. // Science. - 1996. - Vol. 272, N 5269. -P. 1910-1914. - 14. Watts T.L., Alexander T., Hansen B. et al. // J. Invest. Med. - 2000. - Vol. 48. - P. 185. - 15. Zy H., Zy C., Wang D.N. et al. // Sheng Wu Gong Chen Xue Bao. -2000. - Vol. 16, N 5. - P. 570-573.
R.V.Pisanov, E.V.Monakhova, L.P.Alekseyeva, O.V.Markina, L.A.Goncharova
An Escherichia coli Strain - Producer of the Zot-toxin of Vibrio cholerae
Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute
Vibrio cholerae zonula occludens toxin (zot) amplified with the PCR procedure, was cloned as part of pQE30 vector plasmid at BamHI-Hindlll sites. The expression of the gene was controlled by T5 promoter. Eschericia coli strain M15 [pREP4] pZct69 containing the recombinant plasmid, is an active producer of 6His-Zot protein which manifests a biologic activity on the model of cellular cultures causing destructive injuries in the inter-cellular tight junctions of the monolayers. The product is found within the colibacillus cells as inclusion corpuscles. The producer strain may be used to obtain Zot preparations in order to study its significance as one of the cholera vibrio virulence factors and as an agent facilitating intestinal penetrability for certain medical drugs, as well as an immunization adjuvant.
Key words: zonula occludens toxin, cholera vibrio, genetic cloning, recombinant plasmid.
Поступила 27.07.06.
