CC BY
21
Шкиль Н.Н., Тимофеева М. А.Серотипы рода salmonella, выделенные из объектов ветеринарного надзора // Электронный научно-методический журнал Омского ГАУ. - 2021. - № 4 (27) октябрь - декабрь - URL http://e-journal.omgau.ru/images/issues/2021/4/00955.pdf. - ISSN 2413-4066
УДК 619:612
Шкиль Николай Николаевич
доктор ветеринарных наук, доцент ФГБОУВО НГАУ Новосибирск, Россия nicola0 7@mail. ru
Тимофеева Марина Александровна
Руководитель Новосибирской испытательной лаборатории Федеральное государственное бюджетное учреждение центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория Новосибирск, Россия ecspertiza78@mail.ru
Серотипы рода salmonella, выделенные из объектов ветеринарного надзора
Аннотация. В период с 2017 по 2019 год было проведено 6783 исследования продуктов животного происхождения, мяса вынужденно убитых животных, мяса птицы, смывов с объектов ветеринарно-санитарного надзора, фекалий здоровых животных и выделено 157 (2,31%) изолятов штамма Salmonella enterica subsp. enterica. По биохимическим, тинкториальным и серологическим свойствам изолированные микроорганизмы были отнесены к четырем группам (В, С, D, Е), к семи сероварам (S. мoscow, S. typhimurium, S. enteritidis, S. muenster, S. virchow, S. dublin, S. infantis) и 30 (19 %) изолятов оказались не идентифицированными Salmonella spp.
Ключевые слова: Salmonella enterica subsp. enterica, S. мoscow, S. typhimurium, S. enteritidis, S. muenster, S. virchow, S. dublin, S. infantis
Сальмонеллез - инфекционная болезнь разновидность пищевой интоксикации, вызываемая бактериями из рода Salmonella, характеризуется разнообразным спектром клинических проявлений от бессимптомного носительства до септических форм проявления, с преимущественным поражением органов пищеварения.
Нарастающая озабоченность мировой общественности проблемой возникновения вспышек заболеваний у населения, вызванных бактериями из рода Salmonella имеющих растущую тенденцию среди выявляемых в структуре регистрируемых кишечных патогенов (Shigella spp., Escherichia spp., Campylobacter spp., Yersinia spp. и др.) в странах Европы и США варьирует от 35 до 90%. Заболевание регистрируется в виде стихийных, спорадических случаев, но может принимать характер эпидемиологических вспышек [2].
Одна из приоритетных задач ветеринарно-санитарной экспертизы сводится к максимальному снижению вероятности увеличения динамики возникновения пищевых зоонозов, которые напрямую связанные с употреблением животноводческой продукции, предотвращая процесс строгим контролем этапов производства и технологических процессов, где возможен фактор риска. Реальные механизмы контроля на всех этапах производственных процессов подчёркивают необходимость развитие методических подходов к выделению и идентификации сублетально поврежденных микроорганизмов, внедрение эффективных методов дезинфекции. Маркером к проведению усиленных противоэпидемических мероприятий является увеличение появления количества выделенных штаммов сальмонелл одного и того же серовара, возникновение новых или нарастание числа выделенных сальмонелл, эпизодически регистрирующихся на данной территории сероваров: кумуляции процентов штаммов, толерантных к действию антибиотиков и дезинфектантов [3] .
По отчетной статистике медицинских и ветеринарных лабораторий, значимыми сероварианты признаны S. infantis, S. enteritidis, S. typhimurium. Для лечения заболевания птиц вызванными сальмонеллами повсеместно применяется большое количество разных антибактериальных препаратов. Широкое распространение среди сельскохозяйственных животных и птиц получили полирезистентные сероварианты сальмонелл. Толерантные к антибактериальным препаратам штаммы бактерий рода сальмонелла по пищевой цепи в основном с продукцией животного происхождения попадают человеку [1,7,8].
Таким образом, литературные данные показывают, что изучение видового состава возбудителей необходимо для разработки комплексных ветеринарно-санитарных мероприятий, от которых зависит благополучие выпускаемой продукции животного происхождения по токсико-пищевым инфекциям.
Цель работы - изучить видовой и групповой состав представителей рода Salmonella выделенных с объектов ветеринарного надзора Новосибирской области.
Материалы и методы
Объектом исследования являются штаммы Salmonella изолированные от продуктов животного происхождения, мяса вынужденно убитых животных, смывов с объектов ветеринарно-санитарного надзора, фекалий здоровых животных в период с 2017 по 2019 год.
Выделение микроорганизмов рода Salmonella в пищевых продуктах животного происхождения проводили согласно ГОСТ 31659-2012 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella» [4]. Для выявления сублетально поврежденных бактерий рода Salmonella высевали 25 г пищевых продуктов в среду неселективного обогащения - забуференную пептонную воду, инкубировании при температуре 37±1°С в течение 18±2 ч. Для обогащения в жидкой селективной среде культуральную жидкость пересевали в среды RVS - бульон и МКТ - бульон. RVS-бульон инкубировали при температуре 41,5±1,0 °С в течение 24±3 ч, а МКТ-бульон - при температуре 37±1 °С в течение 24±3 ч. Микробиологические культуры наносили на поверхность плотных дифференциально-диагностических сред: ВСА и XLD, получая изолированные колонии по методу Дригальского. Интервал инкубирования 24±3 ч при температуре 37±1 °С. Характерные колонии с черным центром и полупрозрачной зоной красного оттенка предположительно отнесенные к бактерия рода Salmonella, выросшие на XLD-arape, а также
колонии с металлическим блеском выросшие на ВСА переносили на поверхность предварительно подсушенного питательного МПА.
Изоляция бактерий рода Salmonella из продукции птицеводства проводили по ГОСТ 31468-2012 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Метод выявления сальмонелл». Навеску массой 25 г вносили в пептонно-буферную среду, предварительно доведенную до температуры 37±1 °С. Посевы инкубировали при температуре 37±1 °С в течение 18±2 ч. Культуры из сред неселективного обогащения 0,1 см пересевали в среды селективного обогащения RVS-бульон и селенит-цистиновый накопительный бульон. Инкубировали RVS-бульон и при температуре 41,5±1,0 °С в течение 24±3 ч, селенит-цистиновый накопительный бульон при температуре 37±1°С в течение 24±3 ч. Для выделения чистой культуры проводили посев на дифференциально-диагностические среды: ВСА и XLD. Чашки Петри с посевами переворачивали вверх дном и инкубировали в течение 24±3 ч при температуре 37±1 °С. Характерные колонии бактерий рода Salmonella, переносили на поверхность предварительно подсушенного питательного ГРМ. Выделение изолятов бактерий рода Salmonella из фекалий и объектов окружающей среды проводили согласно МУ 4.2.2723-10 «Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды» [5,6].
Пробы фекалий массой 1 г суспендировали в среде обогащения в забуференной пептонной воде в соотношении 1:5. Инкубацию проводили при температуре 37 °С в течении 18-20 ч. Затем пересевали на селенитовую среду селективного обогащения. Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 18-20 ч. Для выделения чистой культуры проводили посев на дифференциально-диагностические среды: ВСА и XLD. Чашки Петри с посевами переворачивали вверх дном и инкубировали в течение 18-20 ч при температуре 37 °С. Колонии, характерные для бактерий рода Salmonella, переносили на поверхность предварительно подсушенного питательного ГРМ.
Смывную жидкость заливали 5 мл селенитовой среды обогащения и помещали в термостат при 37 °С на 18-20 ч. После инкубации делали высев на среду Эндо и висмут-сульфит агар. Отбирали колонии, характерные для бактерий рода Salmonella, для их дальнейшей идентификации. Делали посев на поверхность ГРМ агара, инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 ч.
Тинкториальную идентификация проводили из суточной колонии выросших на ГРМ агаре, отобранных для дальнейшей идентификации, готовили мазки и окрашивали по Граму, в модификации Хукера. Подсушенные мазки на воздухе в зоне пламени спиртовки с соблюдением асептики, после предварительной фиксации над пламенем спиртовки, окрашивали раствором кристаллического фиолетового с щавелевокислым аммонием экспозиция 1 минута, затем мазок промывали водопроводной водой, с последующем нанесением йодного раствора по Бурке. Спустя одну минуту мазок промывали 96%-ным этиловым спиртом, последовательно погружая несколько, до тех пор, пока не перестал стекать окрашенный спирт. Мазок выдерживали 3 мин в растворе сафранина, после промывали водой и высушивали. Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (цвет основного красителя) за счет образования стойкого соединения с основным красителем. Окрашенные мазки просматривали под микроскопом Olympus CX41 со светосильным объективом с масляной иммерсией. К колониям рода Salmonella предположительно относили мазки в которых микроорганизмы были в виде палочек с закругленными концами красного цвета (Грам -).
Сахаролитическая активность микроорганизмов определяли при засевании штрихом на скошенную поверхность агара среды Олькеницкого и уколом - столбик. Инкубируют при температуре (37±1)°С в течение (24±3)ч. Интерпретировали изменения среды: столбик агара Олькеницкого под действием культуры приобрел желтый цвет с разрывами (ферментируют глюкозу с образованием газа) с почернением большой части -образование сероводорода.
Биохимические свойства бактерий рода Salmonella проводили с использованием наборов тест-систем (MIKROLATEST ENTEROtest 16 производитель Erba Lachema Индия). Набор ЭНТЕРОтест 16 предназначен для идентификации наиболее важных для патологии человека микроорганизмов семейства энтеробактерий в течение 24 часов.
Схема идентификации:
1. Приготавливали бактериальную взвесь из суточной 24 часовой в стерильном физиологическом растворе.
2. Гомогенизировали суспензию, с доведением мутности суспензии по шкале мутности равной 1 McFarland.
3. Инокулировали суспензию бактерий по 0,1 мл в 16 лунки. Исключая контаминацию соседних лунок.
4. Инкубировали инокулированную пластину в течение 18-24 ч. при температуре 3537 °C.
5. Составляли числовой профиль в зависимости от результата реакции.
6. Идентификацировали в Книге кодов.
К бактериям рода Salmonella относили грамотрицательные культуры, давшие устойчивый биохимический профиль 98% ЭНТЕРОтест -16.
Определение подвижности культуры проводили при пересевании уколом в полужидкий мясо-пептонный агар, инкубировании при температуре 37,0±1,0 °С в течение 24±3 ч. Отмечали диффузный рост по всему столбику агара.
Серологическая идентификация антигенного профиля бактерий рода Salmonella для определения серотипа внутри рода по классификации Кауфмана - Уайта, проводили с набором сальмонеллёзных сывороток ПЕТСАЛ по РА на стекле, в соответствии с инструкцией изготовителя.
Определение присутствия соматического О-антигена, жгутикового Н-антигена в изолированных колониях проводили с помощью реакции агглютинации на предметном стекле с соответствующими сыворотками после исключения самоагглютинирующих штаммов. Серологическую идентификацию для подтверждения принадлежности к бактериям рода Salmonella проводили с суточными с культурами, предварительно пересеянными на поверхность мясо-пептонного агара или ГРМ-агара.
Для исключения самоагглютинирующих штаммов, помещали каплю физиологического раствора на предметное стекло. Диспергировали в этой капле часть тестируемой колонии, до получения гомогенной суспензии. В течении 30-60 секунд покачивали стекло. С помощью лупы на темном фоне, оценивали реакцию. При появлении осадка в виде разной интенсивности склеивания бактериальной массы считали, что изолят обладают самоагглютинацией, в дальнейшем такие изоляты не подвергались дальнейшей серологической идентификации. У штаммов, у которых не выявлена самоаглютинация, проводили реакцию агглютинацию с различными сыворотками.
Для выявления О-антигена проводили реакцию агглютинации с адсорбированными поливалентными сальмонеллезными О-сыворотками основных группах А, В, С, D, Е. Реакция агглютинации проявлялась в виде мелких хлопьев (склеивания бактериальной массы) с частичным просветлением жидкости. Затем последовательно использовали, поли- и моновалентные сыворотки. При отрицательной реакции агглютинации, культура после диспергирования с каплей сыворотки образовывала гомогенную смесь. После установления О- антигена устанавливали Н- антиген при проведении реакции агглютинации с сыворотками Н- фазы.
Результаты исследований
В период с 2017 по 2019 год было проведено 6783 исследования продуктов животного происхождения, мяса вынужденно убитых животных, мяса птицы, смывов с объектов ветеринарно-санитарного надзора, фекалий здоровых животных и выделено 157 (2,31%) изолятов штамма Salmonella enterica subsp. enterica (табл. 1).
Таблица 1 - Количество изолятов Salmonella, выделенных в период 2017-2019 гг.
Вид продукции Количество Количество Соотношение,
образцов изолятов %
Образцы мясо говядина, полуфабрикаты, субпродукты 320 12 3,8
Образцы из мяса свинины (в т.ч. вынужденный убой), полуфабрикаты, субпродукты 2003 50 2,5
Образцы мяса курицы, полуфабрикаты, субпродукты, яичный порошок 2298 78 3,4
Фекалии от здоровых животных 48 9 18,8
Смывы с объектов ветеринарно-санитарного 2114 8 0,4
надзора
Всего 6783 157 2,3
У 157 изолированных штаммов Salmonella enterica subsp. еntericа выделенных при исследовании продуктов животного происхождения, мяса вынужденно убитых животных, продукции птицеводства, смывов с объектов ветеринарно-санитарного надзора, фекалий здоровых животных был составлен антигенный профиль (табл. 2).
Таблица 2 - Антигенный профиль выделенных изолятов
Серологический вариант /антигенная структура Количество Удельный вес от общего
изолятов числа изолятов, %
Salmonella spp. / 0-АВСДЕ 30 19
Salmonella moscow / О-9,12 H1-g,q 1 1
Salmonella typhimurium / 0-1,4,5,12 H1-i Н2-1,2 7 4
Salmonella enteritidis / 0-1,9,12 H1-g,m 11 7
Salmonella muenster / 0-3,10 H1-e,h Н2-1,5 2 1
Salmonella virchov / 0-6,7 H1-r Н2-1,2 3 2
S. dublin / 0-1,9,12 H1-g, p 4 2
Salmonella infantis / 0-6,7 H1-r Н2-1,5 25 16
Salmonella гр. B / 0-1,4,5,12 4 3
Salmonella гр. C / 0-6,8 39 25
Salmonella гр. D / 0-1,9 20 13
Salmonella гр. Е / 0-3,10 11 7
Для каждого вида продукции был характерен свой спектр серологических вариантов, выделяемых Salmonella. Из 2298 образцов, поступивших на исследование продукции птицеводства (мясо кур, яичный порошок, полуфабрикаты, субпродукты) было изолированно 78 штаммов Salmonella, принадлежащих к серологическим вариантам В, С, D, Е, а также нетипируемые штаммы Salmonella spp. На рисунке 1 представлено соотношение серологических вариантов Salmonella.
Salmonella гр. D
7%
Salmonella гр.
Е л
Salmonella
sPP-19%
Salmonella moscow .1%
Salmonella гр. С 28%
Salmonella гр. B 1%
Salmonella infantis 22%
Salmonella typhimurium 4%
Salmonella enteritidis 9%
. Salmonella muenster 1%
Salmonella
S. dublin 0%
virchow 3%
Рисунок 1 - Серологические варианты Salmonella, выделенные из птицеводческой продукции
Как видно из рисунка 1, большинство штаммов Salmonella, принадлежали Salmonella группа С (28%), Salmonella spp. (19%), из типируемых штаммов S. infantis (22%), S. enteritidis (9%), S. typhimurium (4%), S. virchow (3%), и незначительное количество S. moscow и S. muenster (1%).
При исследовании 320 образцов мяса говядины и полуфабрикатов из мяса говядины было изолировано 12 изолятов бактерий рода Salmonella принадлежащих к серологическим вариантам групп В и D. На рисунке 2 удельный вес типируемых штаммов S. dublin составляет 17%, штаммы второго по значимости серологического варианта S. enteritidis, имели удельный вес 8%. Значительная часть выделенных изолятов приходиться на нетипируемый штамм Salmonella spp. 34% и на штамм типируемые до группы Salmonella группа С 33 %.
Salmonella гр. D_ 8%
Salmonella гр. Е 0%
Salm
Salmonella spp. 34%
Salmonella moscow 0%
Salmonella гр. C 33%
Salmonella typhimurium 0%
lonella гр. В 0%
Salmonella infantis 0%
S. dublin 17%
. Salmonella muenster 0%
Salmonella virchow 0%
. Salmonella enteritidis 8%
Рисунок 2- Серологические варианты Salmonella, выделенные из мяса говядины и полуфабрикатов
При проведении исследований 2003 образцов мяса свинины, полуфабрикатов и субпродуктов, было выделено 50 изолятов бактерий рода Salmonella, которые были отнесены к серологическим вариантам групп В, С, D, E (Рис. 3). По итогам биохимической и серологической идентификации установлено преобладающие значение в инфицированных продуктах серотипа Salmonella группа С (26%) а, также Salmonella spp. (22%). Из типируемых штаммов - S. infantis (16%), S. typhimurium (8%), S. virchow (6%), S. muenster (2%).
Salmonella гр. Е 14%
Salmonella гр. D 0%
Salmonella гр. C 26%
Salmonella гр. В 6%
Salmonella spp. Salmonella 22% moscow
0% Salmonella typhimurium 8%
Salmonella muenster 2%
Salmonella enteritidis
Salmonella 0% virchow 6%
Salmonella infantiS. dublin 16% 0%
Рисунок 3 - Серологические варианты Salmonella, выделенные из мяса свинины, субпродуктов и полуфабрикатов
На рисунке 4 приведены данные по выделению бактерий рода Salmonella из фекалий здоровой птицы исследовании 44 образцов, было выделено 9 изолятов. Наиболее большое количество штаммов принадлежали Salmonella группа D (89%), и S. enteritidis (11%).
Salmonella гр. Е 0%
Salmonella virchow 0%
Salmonella moscow 0%
Salmonella
Salmonella enteritidis 11%
Salmonella typhimurium 0%
Salmonella muenster 0%
Salmonella гр. B 0%
S. dublin 0%
Salmonella гр. D 89%
Salmonella гр. C 0%
Salmonella infantis 0%
Рисунок 4 - Серологические варианты Salmonella, выделенные из фекалий птицы
При анализе результатов 2114 исследований смывов с объектов окружающей среды, было изолировано 8 изолятов бактерий рода Salmonella. При этом, наибольший удельный вес приходится на Salmonella группа D 75%, на долю S. enteritidis приходится 25%.
При исследовании 6783 образцов продуктов животного происхождения, мяса вынужденно убитых животных, мяса птицы, смывов с объектов ветеринарно-санитарного надзора, фекалий здоровых животных и выделено 157 изолятов штамма Salmonella enterica subsp. enterica, наибольший удельный вес выделенных изолятов приходится на штаммы выделенные из мяса (свинины, птицы, говядины), субпродукты и полуфабрикаты 89 % что говорить о значительной обсеменённости бактериями рода Salmonella мяса и мясных продуктов (рис. 5).
Рисунок 5 - Удельный вес изолированных бактерий рода Salmonella
Наибольшее количество штаммов сальмонелл выделялось из мяса птицы и свинины, при этом чаще их изолированные из мяса, полуфабрикатов и субпродуктов соответственно 50 % и 43 % (рис. 6).
Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты 50%
Мясо говядина, субпроду
кты и полуфабрикаты 7%
Мясо свинина,субпродук ты и полуфабрикаты 43%
Рисунок 6 - Удельный вес изолированных бактерий рода Salmonella из мяса и мясных продуктов
Выводы
1) При микробиологическом исследовании 6783 проб продуктов животного происхождения, мяса вынужденно убитых животных, мяса птицы, смывов с объектов ветеринарно-санитарного надзора, фекалий здоровых животных и выделено 157 изолятов бактерий рода Salmonella, что составляет 2,3% от числа исследованных проб и подтверждает высокую степень контаминации.
2) По биохимическим, тинкториальным и серологическим свойствам изолированные микроорганизмы были отнесены к четырем группам (В, С, D, Е), к семи сероварам (S. мoscow, S. typhimurium, S. enteritidis, S. muenster, S. virchow, S. dublin, S. infantis) и 30 (19 %) изолятов оказались не идентифицированными Salmonella spp.
Литература
1. Березовская Е.С. Биопленки при бактериальном вагинозе / Е. С. Березовская [и др.] // Акушерство. - 2013. - Т. 7, № 2. - С. 35-36.
2. Витковская О.Н. Анализ эпизоотической ситуации по сальмонеллезу на основании данных ветеринарной статистической отчетности. / О.Н. Витковская // Единый мир - единое здоровье: Тезисы доклада VII Меж. ветер. кон. - Уфа. - Апрель, 2017.
3. Гореляд Х.С. Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии переработки продуктов животноводства / Х. С. Гореляд, В. А. Макаров, И. Е. Чеботарев. - Москва: Колос, 1981. - 584 с.
4. ГОСТ 31468-2012 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Метод выявления сальмонелл».
5. ГОСТ 31659-2012 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella».
6. МУ 4.2.2723-10 «Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды».
7. Шкиль Н.Н., Нефёдова Е.В. Влияние частиц серебра на бактерицидную активность и антибиотикочувствительность Salmonella enteritidis 182 / Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, №3, 2021,С. 82-93.
8. Шкиль Н.Н., Нефедова Е.В. влияние комплексного препарата содержащего наночастицы серебра и диметилсуфоксида на показатели крови коров, больных послеродовым гнойно-катаральным эндометритом с оценкой эффективности лечения Российская сельскохозяйственная наука, 2021, № 2, С.73-76.
N.N. Shkil
Doctor of Veterinary Sciences, Associate Professor Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Novosibirsk State Agrarian University Novosibirsk, Russia nicola07@mail.ru
М.А. Timofeeva
Head of the Novosibirsk Testing Laboratory Federal State Budgetary Institution Central Scientific and Methodological Veterinary Laboratory, Novosibirsk, Russia ecspertiza78@mail.ru
Serotypes of the genus salmonella isolated from objects of veterinary supervision
Annotation. In the period from 2017 to 2019, 6,783 studies of animal products, meat of forcibly killed animals, poultry meat, flushes from veterinary and sanitary surveillance facilities, feces of healthy animals were conducted and 157 (2.31%) isolates of the Salmonella enterica subsp. enterica strain were isolated. According to the biochemical, tinctorial and serological properties, the isolated microorganisms were assigned to four groups (B, C, D, E), to seven serovars (S. moscow, S. typhimurium, S. enteritidis, S. muenster, S. virchow, S. dublin, S. infantis) and 30 (19 %) isolates were not identified by Salmonella spp.
Keywords: Salmonella enterica subsp. enterica, S. moscow, S. typhimurium, S. enteritidis, S. muenster, S. virchow, S. dublin, S. infanti
