CC BY
54
zyaistvennykh zhivotnykh (Standards and ration feeding of faim animals), Spravochnoe posobie, Moscow, Rossel'khozakad-emiya, 2003, 456 p.
12. Ovsyannikov A. I. Osnovy opytnogo dela v zhivotnovodstve (Basics of experimental work in animal husbandry), Moscow, «Kolos», 1976, 304 p.
13. Petukhova E. A., Bessarabova R. F., Khaleneva L. D., Antonova O. A. Zootekhnicheskii analiz kormov (Zoo technical analysis of the feed), Moscow, Agropromizdat, 1989, 239 p.
14. Plokhinskii N. A. Rukovodstvo po biometrii dlya zootekhnikov (Guide to Biometrics for livestock), Moscow, Ko-los, 1969, 255 p.
15. Metody veterinarno-klinicheskoi laboratornoi diagnostiki (Methods of veterinary clinical laboratory diagnostics), spravochnik, I.P. Kondrakhin, A.V. Arkhipov, V.I. Levchenko i dr., pod red. I.P. Kondrakhina, Moscow, KolosS, 2004, 520 p.
УДК 637.075
ИССЛЕДОВАНИЕ МЯСА И МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ, ИСКУССТВЕННО КОНТАМИНИРОВАННЫХ БАКТЕРИЯМИ РОДА SALMONELLA
Е. О. Чугунова, канд. ветеринар. наук, доцент;
Н. А. Татарникова, д-р ветеринар. наук, профессор,
ФГБОУ ВО Пермская ГСХА,
ул. Петропавловская, 23, г. Пермь, Россия, 614990
E-mail: [email protected], [email protected]
Аннотация. В бактериологическом отделе ГБУВК «Пермский ветеринарный диагностический центр» в период с 2014 по 2016 год изучали методы выделения сальмонелл с целью изыскания возможности выделения единичных бактерий из мяса и мясных пищевых продуктов. Материалом для искусственной контаминации служили штаммы S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Gallinarum-Pullorum, S. Dublin, S. Choleraesuis, S. Infantis, S. Hamburg, S. Virchow, полученные из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России и выделенные из мясной и яичной продукции (всего 46 штаммов). Испытуемые образцы мясного продукта массой 25 г контаминировали взвесью сальмонелл в количестве от 101 до 108 МТ/см3, гомогенизировали и исследовали как опытными, так и контрольным по ГОСТ 31659-2012 способами. Метод исследования - бактериологический, при этом учитывали чувствительность методов, скорость образования и количество типичных колоний, фаголизабельность, биохимические и серологические свойства выделенных сальмонелл, а также вели учет времени, затраченного на исследование. В результате выполнения исследований установлено, что разработанный способ выделения сальмонелл превосходит классический аналог по ряду показателей. В частности, чувствительность разработанного способа составляет всего 10 микробных тел сальмонелл. При накоплении Salmonella spp. в сконструированной среде формирование типичных колоний на агаре происходит в 2 раза быстрее, чем после использования стандартных сред накопления, а в среднем процедура анализа занимает на 50-70 часов меньше времени в зависимости от количества жизнеспособных клеток сальмонелл в образце. Также необходимо отметить, что данный способ выделения бактерий рода Salmonella практически исключает вероятность получения ложноотрицательных результатов исследований, что, безусловно, способствует повышению качества продукции, выпускаемой в реализацию.
Ключевые слова: сальмонеллы, мясо и мясные продукты, чувствительность, типизация, время.
Введение. Выпуск полноценной и безопасной в ветеринарно-санитарном отношении продукции животноводства и поддержание благополучной эпизоотической ситуации на всей территории РФ - одна из важнейших
задач ветеринарии. Основной критерий продуктов животноводства, поступающих в торговую сеть, - их безопасность, которая, в первую очередь, зависит от степени распространенности различных заболеваний, в том
числе инфекционных (их возбудителей, токсинов, продуктов жизнедеятельности), на всех этапах оборота пищевых продуктов. Согласно исследованиям отечественных и зарубежных авторов, ведущая роль в возникновении пищевых сальмонеллезов принадлежит мясу и мясным продуктам [1, 2]. Gebremedhin E. Z. (2004) выделил сальмонелл преимущественно из тушек куриц (13,9 %), свинины (11,3 %) и баранины (10,8 %). В Америке в январе 2013 года сальмонеллезная инфекция из-за употребления в пищу говядины, не прошедшей соответствующую термическую обработку, была зарегистрирована сразу в нескольких штатах [4, 5].
Растущий темп жизни общества отражается на его питании. Быстрые способы приготовления еды, полуфабрикаты из супермаркетов требуют все большего внимания к мерам профилактики и гигиены из-за бактериального риска потребления продуктов птицеводства [6]. Особенно остро проблема пищевых сальмонеллезов отмечена в мегаполисах [7, 8]. Например, во Франции в период с 1998 по 2000 гг. отмечено три вспышки сальмонеллеза из-за употребления гамбургеров [9]. При проведении лабораторных испытаний готовых мясных продуктов и полуфабрикатов, произведенных в Пермском крае, стабильно на протяжении ряда лет обнаруживали сальмонеллы [10, 11]. Трудоемкость стандартного бактериологического определения Salmonella spp. в продуктах питания привела к необходимости разработки среды и ускоренного метода индикации сальмонелл (патент РФ № 2570386). Однако, несмотря на успешно проведенные опыты с применением разработанной методики, считаем важным выполнить лабораторные испытания мясной продукции, искусственно контаминированной сальмонеллами.
Цель научных исследований - изыскание возможности выделения единичных сальмонелл из мяса и мясных пищевых продуктов.
Задачи исследований:
1. Определение наличия бактерий рода Salmonella в мясе, субпродуктах, в готовых мясных продуктах и полуфабрикатах путем использования разработанной ранее питательной среды для ускоренного способа выделения сальмонелл.
2. Оценить опыт использования бактериофагов для идентификации сальмонелл, вы-
деленных из испытуемых пищевых продуктов.
3. Установить время, затраченное на испытание мясных продуктов опытных и контрольных образцов.
Методика. Работа выполнена в бактериологическом отделе ГБУВК «Пермский ветеринарный диагностический центр» в период с 2014 по 2016 год. Материалом для искусственной контаминации служили штаммы S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Gallmamm-Pullorum, S. Dublin, S. Choleraesuis, S. Infantis, S. Hamburg, S. Virchow, полученные из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России и выделенные из мясной и яичной продукции (всего 46 штаммов).
Метод исследования - бактериологический. В процессе апробации сконструированной среды и разработанного способа выделения сальмонелл в «чистые» (свободные от сальмонелл) пробы пищевых продуктов вносили определенное количество Salmonella spp., формировали два образца, один из которых служил опытом, другой - контролем. Образцы проб хранили в условиях холодильника при температуре +2...+ 4°С.
В ходе эксперимента было исследовано более 1000 образцов мясной продукции, свободной от бактерий группы кишечной палочки (БГКП), условно-патогенных, патогенных микроорганизмов и микроорганизмов порчи, и содержащей микроорганизмы (КМАФАнМ) не более 105 КОЕ/г. Испытуемые образцы продукта массой 25 г контаминировали взвесью сальмонелл в количестве от 10 до 10 МТ/см , гомогенизировали и исследовали как опытными, так и контрольным способами. А именно, неселективное обогащение, идентификацию и типизацию контрольных образцов проводили согласно ГОСТ 31659-2012. Опытные образцы обогащали в сконструированной накопительной среде, идентификацию и типизацию выделенных бактерий в опыте № 1 проводили по ГОСТ 31659-2012; в опыте № 2 -осуществляли фагоидентификацию с помощью выделенных нами ранее бактериофагов [14] и стандартную серологическую типизацию с применением набора сальмонел-лезных сывороток производства ФГУП «Курская биофабрика-«БИОК» (Россия).
Результаты. При выполнении анализа учитывали чувствительность методов, скорость образования и количество типичных колоний на висмут-сульфит агаре (ВСА) и XLD-
агаре. Особенно интересовала возможность обнаружения и выделения единичных сальмонелл из испытуемой продукции. Для учета времени, затраченного на формирование колоний, просматривали чашки с посевами каждые 2 часа и отмечали время образования типичной для сальмонелл колонии.
Кроме этого, изучали фаголизабельность, биохимические и серологические свойства выделенных сальмонелл, а также вели учет времени, затраченного в целом на исследование контрольных и опытных образцов продукции (табл. 1).
Таблица 1
Результат выделения сальмонелл из мясной продукции опытными и контрольным способами
Количество внесенных в образцы сальмонелл, МТ/см3 Образование типичных для сальмонелл колоний на ВСА, час Процент положительных проб Общее время исследований, час
опыт контроль опыт № 1 и 2 контроль опыт № 1 опыт № 2 контроль
Говядина + Salmonella spp. *
101 24±0,0 - 100,0 0,0 87±0,0 63±0,0 -
102 24±0,0 - 100,0 0,0 87±0,0 63±0,0 -
103 24±0,0 - 100,0 0,0 87±0,0 63±0,0 -
104 24±0,02 48±0,0 100,0 40,0 87±0,02 63±0,02 138±0,0
105 24±0,02 47,0±3,36 100,0 95,0 87±0,02 63±0,02 137,1±3,28
106 24±0,02 35,7±8,80 100,0 100,0 87±0,02 63±0,02 130,5±9,68
10' 24±0,02 33,0±7,06 100,0 100,0 87±0,02 63±0,02 123,0±7,06
108 24±0,0' 27,0±5,92 100,0 100,0 87±0,02 63±0,02 117,0±5,92
Свинина + Salmonella spp. **
101 - - 0,0 0,0 - - -
102 - - 0,0 0,0 - - -
103 - - 0,0 0,0 - - -
104 29,54±10,522 48,0±0,0 25,0 20,0 92,54±10,522 68,54±10,522 138,0±0,0
105 36,0±12,311 47,4±2,68 100,0 100,0 99,0±12,312 75,0±12,312 137,4±2,68
106 33,0±10,21 37,8±4,40 100,0 100,0 96,0±10,212 72,0±10,212 127,8±4,40
10' 25,8±4,40 25,8±4,40 100,0 100,0 88,8±4,402 64,8±4,402 115,8±4,40
108 25,2±3,69 25,2±3,69 100,0 100,0 88,2±3,702 64,2±3,702 115,2±3,70
Мясо птицы + Salmonella spp. ***
101 24±0,0 - 100,0 0,0 87±0,0 63±0,02 -
102 24±0,0 - 100,0 0,0 87±0,0 63±0,02 -
103 24±0,02 48,0±0,0 100,0 10,0 87±0,02 63±0,02 138,0±0,0
104 24±0,02 47,52±2,40 100,0 50,0 87±0,02 63±0,02 137,52±2,40
105 24±0,02 44,88±5,32 100,0 98,0 87±0,02 63±0,02 134,88±5,32
106 24±0,02 37,2±8,49 100,0 100,0 87±0,02 63±0,02 122,16±8,20
10' 24±0,02 28,8±6,41 100,0 100,0 87±0,02 63±0,02 118,80±6,41
108 24±0,02 27,36±5,44 100,0 100,0 87±0,02 63±0,02 117,36±5,44
ММО + Salmonella spp. ** *
101 24,24±1,71 - 100,0 0,0 87,45±3,14 63,45±3,14 -
102 24,49±2,40 - 100,0 0,0 87,90±4,40 63,90±4,40 -
103 24±0,02 48,0±0,0 100,0 10,0 87±0,02 63±0,02 138,0±0,0
104 24±0,02 47,08±3,33 100,0 26,0 87±0,02 63±0,02 137,0±3,46
105 24±0,02 42,61±6,95 100,0 98,0 87±0,02 63±0,02 131,54±8,05
106 24±0,02 35,51±7,73 100,0 100,0 87±0,02 63±0,02 125,76±7,85
10' 24±0,02 29,63±6,97 100,0 100,0 87±0,02 63±0,02 119,65±6,94
108 24±0,02 28,41±5,84 100,0 100,0 87±0,02 63±0,02 118,56±5,88
2
При Р<0,001
* S. Dublin, S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Infantis ** S. Choleraesius, S. Typhimurium
*** S. Enteritidis, S. Infantis, S. Gallinarum-Pullorum, S. Virhow, S. Hamburg
Из таблицы 1 видно, что чувствительность разработанного способа значительно выше, чем классического бактериологическо-
го анализа. В результате проведенных лабораторных испытаний в большинстве образцов с помощью созданной накопительной среды
нам удалось обнаружить сальмонеллы в искусственно контаминированных мясных продуктах при посевной дозе всего 10 МТ. Чувствительность метода по ГОСТ 31659-2012 была на уровне 103...104 МТ сальмонелл, а 100 % положительный результат получали при внесении в контрольные образцы не менее 105...106 МТ/25 г. При посевной дозе всего 10 МТ разработанная среда для обогащения сальмонелл способствовала образованию на плотных питательных средах (III 1С) типичных колоний искомых микроорганизмов после 24 часов инкубации, в контроле при аналогичной посевной дозе рост колоний сальмонелл не зафиксирован. При внесении 103 МТ в контрольные образцы формирование характерных
для сальмонелл колоний отмечено после 48 часов инкубации.
В целом на испытание контрольных образцов, включая биохимическую и серологическую идентификацию, потребовалось от 115,2±3,70 до 138,0±0,0 часов; на исследование образцов опыта № 1, включая биохимическую идентификацию и серотипизацию, ушло от 87,0±0,0 до 99,0±12,31 часов; лабораторные испытания образцов опыта № 2, идентификацию которых осуществляли с помощью выделенных бактериофагов, продолжались всего 63,0±0,0...75,0±12,31 часа.
Среднее время анализа опытных и контрольных образцов в разрезе разных видов мясной продукции показано на рисунке 1.
Рис. 1. Время, затраченное на определение сальмонелл в искусственно контаминированных продуктах, часы
Общая картина времени, затраченного на анализ мясных продуктов, отражена на рисунке 2.
Рис. 2. Среднее время, затраченное на определение сальмонелл в искусственно контаминированном мясе опытными и контрольными способами, часы
Необходимо отметить, что в части кон- обнаружить бактерии рода Salmonella, т.е. бы-трольных проб с содержанием клеток сальмо- ли получены ложноотрицательные результаты нелл в количестве от 101 до 103 нам не удалось исследований (рис. 3).
Рис. 3. Количество положительных результатов исследований при определении сальмонелл опытными и контрольными способами, %
Выводы. В результате выполнения исследований установлено, что разработанный способ выделения сальмонелл превосходит классический аналог по ряду показателей. В частности, чувствительность разработанного способа составляет всего 10 МТ сальмонелл. При накоплении Salmonella spp. в сконструированной среде формирование типичных колоний на ВСА происходит в 2 раза быстрее, чем после использования стандартных сред
накопления, а в среднем процедура анализа занимает на 50-70 часов меньше времени в зависимости от количества жизнеспособных клеток сальмонелл в образце. Также необходимо отметить, что данный способ выделения бактерий рода Salmonella практически исключает вероятность получения ложноотрица-тельных результатов исследований, что, безусловно, способствует повышению качества продукции, выпускаемой в реализацию.
Литература
1. Загаевский И. С. Справочник по ветеринарно-санитарной экспертизе животноводческой продукции. Киев : Урожай, 1976. 160 с.
2. Acha P. N., Szyfres B. Salmonellosis // Zoonoses and communicable diseases common to man and animals. Pan American Health Organization. Washington, 2001. P. 223-246.
3. Gebremedhin E. Z. Prevalence, distribution and antimicrobial resistance profile of Salmonella isolated from food items and personnel in Addis Ababa, Ethiopia; Addis Ababa University, Faculty of Veterinary Medicine. Addis Ababa, 2004. 123 р.
4. Food-related illness and death in the United States / P. S. Mead [et al.] // Emerg. Infect. Dis. 1999. Vol. 5. P. 607-625.
5. Salmonella linked to ground beef sickens 16 [Ehlektronnyj resurs] / Centers for Disease Control and Prevention; reporting by E. M. Johnson. Retrieved from: http://www.reuters.com/article/2013/01/28/us-usa-salmonella-beef-idUSBRE90R0Z020130128. Zaglavie s ehkrana (accessed: 28.02.2014).
6. Слаусгальвис В. Сальмонеллез : меры борьбы и контроль // Животноводство России. 2010. № 2. С. 60-61.
7. Удавихина Л. С. Современные тенденции в эпидемиологии сальмонеллеза, обусловленного Salmonella enteritidis, и роль отдельных пищевых продуктов и блюд в его распространении : дис. ... канд. мед. наук. Пермь, 2009. 123 с.
8. Филиппова А. А. Информационно-аналитическое обеспечение эпидемиологической диагностики сальмо-неллезов в условиях мегаполиса: дис. ... канд. мед. наук. Москва, 2013. 130 с.
9. Minced beef and human salmonellosis: review of the investigation of three outbreaks in France / S. Haeghebaert [et al.] // Euro Surveillance. 2001. Vol 6 (2). P. 21-26.
10. Зараженность сальмонеллами продукции птицеводства / Е. О. Чугунова [и др.] // Современные проблемы науки и образования : электрон. журн. 2014. № 6. Режим доступа к журн. URL: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=15850 (дата обращения: 27.12.2014).
11. Чугунова Е. О., Татарникова Н. А. Санитарное качество мясопродуктов и мясоперерабатывающих предприятий в отношении бактерий рода Salmonella // Фундаментальные исследования. 2014. Ч. 12. № 12. С. 2691-2694.
12. Способ выявления бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах : пат. № 2570386 RU С1 Рос Федерация. G01N 33/02, М., ФГУ ФИПС; опубл. 10.12.2015. Бюл. № 34.
13. ГОСТ 31659-2012 Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella. Москва : Стандартин-форм, 2014. 24 с.
14. Чугунова Е. О., Сузина Н. Е., Зимин А. А. Морфологический анализ сальмонеллезных бактериофагов // Материалы III Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». Пущи-но, 2016. С. 63- 65.
RESEARCH OF MEAT AND MEAT PRODUCTS ARTIFICIALLY CONTAMINATED BY SALMONELLA SPP.
E. O. Chugunova, Cand. Vet. Sci., Associate Professor
N. A. Tatarnikova, Dr. Vet. Sci., Professor
Perm State Agricultural Academy
23 Petropavlovskaya St., Perm 614990 Russia
E-mail: [email protected], , [email protected]
ABSTRACT
The article presents a comparative analysis of the Salmonella isolation methods from meat and meat products. The aim of research was exploring the possibility of Salmonella isolated from meat and meat food products. The work was performed at the bacteriological department of the Perm Veterinary Diagnostic Center during 2014-2016. The material for the artificial contamination were strains of S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Gallinarum-Pullorum, S. Dublin, S. Choleraesuis, S. Infantis, S. Hamburg, S. Virchow, obtained from the State Organization "Scientific Centre for Expertise of Medical Products" of the Russian Ministry of Health and ones isolated from meat and egg products (n = 46). The test samples of meat products weighing 25 g contaminated by Salmonella suspension consist of 101 to 108 bacterial cell/cm3, homogenized and analyzed as an experienced and control (by GOST 31659-2012) methods. We used bacteriological method of research. During the investigation review, we consider the sensitivity of the methods and the rate of typical colonies formation, possibility of bacteriophages lysis, biochemical and serological properties of Salmonella, and time spent on research. Result of studies show that the developed method for isolating Salmonella exceeds the classical analogue. In particular, the sensitivity of the developed method is only 10 bacterial cells of Salmonella. After Salmonella spp. accumulation by self-constructed medium ones formed typical colonies into agar more quickly than when using standard nutrient broth. Thus, full analysis by our method takes 50 - 70 hours less depending on the number of viable Salmonella cells within the sample. It is important, that this method of Salmonella spp. isolating precludes false-negative results of analysis. This fact certainly contributes to the quality of food.
Key words: Salmonella spp., meat and meat products, sensitivity, typing, time.
References
1. Zagaevskii I. S. Spravochnik po veterinarno-sanitarnoi ekspertize zhivotnovodcheskoi produktsii (Handbook oo veterinary and sanitary examination of livestock products), Kiev, Urozhai, 1976, 160 p.
2. Acha P. N., Szyfres B. Salmonellosis, Zoonoses and communicable diseases common to man and animals, Pan American Health Organization, Washington, 2001, pp. 223-246.
3. Gebremedhin E. Z. Prevalence, distribution and antimicrobial resistance profile of Salmonella isolated from food items and personnel in Addis Ababa, Ethiopia; Addis Ababa University, Faculty of Veterinary Medicine, Addis Ababa, 2004, 123 p.
4. Food-related illness and death in the United States, P. S. Mead [et al.], Emerg. Infect. Dis., 1999, Vol. 5, P. 607-625.
5. Salmonella linked to ground beef sickens 16 [Ehlektronnyj resurs], Centers for Disease Control and Prevention; reporting by E. M. Johnson, Retrieved from: http://www.reuters.com/article/2013/01/28/us-usa-salmonella-beef-idUSBRE90R0ZO20130128. Zaglavie s ehkrana (accessed 28.02.2014).
6. Slausgal'vis V. Sal'monellez : mery bor'by i kontrol' (Salmonellosis: control measures and monitoring), Zhivotnovodstvo Rossii, 2010, No. 2, pp. 60-61.
7. Udavikhina L. S. Sovremennye tendentsii v epidemiologii sal'monelleza, obuslovlennogo Salmonella enteritidis, i rol' otdel'nykh pishchevykh produktov i blyud v ego rasprostranenii (Current trends in the epidemiology of Salmonellosis
caused by Salmonella enteritidis, and the role of certain foods and dishes in its distribution), dis. ... kand. med. nauk nauk: 14.00.30, Perm', 2009, 123 p.
8. Filippova A. A. Informatsionno-analiticheskoe obespechenie epidemiologicheskoi diagnostiki sal'monellezov v usloviyakh megapolisa (Information and analytical support for the epidemiological diagnosis of Salmonellosis in the metropolis conditions), dis. ... kand. med. nauk nauk: 14.02.02, Moscow, 2013, 130 p.
9. Minced beef and human salmonellosis: review of the investigation of three outbreaks in France, S. Haeghebaert [et al.], Euro Surveillance, 2001, Vol 6 (2), pp. 21-26.
10. Chugunova E. O., Tatarnikova N. A., Prokhorova T. S., Maul' O. G. Zarazhennost' sal'monellami produktsii ptitsevodstva (Salmonella contamination of poultry products), Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya, elektron. zhurn., 2014, No. 6, rezhim dostupa k zhurn. URL: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=15850 (data obrashcheniya: 27.12.2014).
11. Chugunova E. O., Tatarnikova N. A. Sanitarnoe kachestvo myasoproduktov i myasopererabatyvayushchikh predpriyatii v otnoshenii bakterii roda Salmonella (Sanitary quality of meat and meat processing plants approach in Salmonella spp.), Fundamental'nye issledovaniya, 2014, No. 12 (chast' 12), pp. 2691-2694
12. Sidorova K. A., Tatarnikova N. A., Chugunova E. O. Sposob vyyavleniya bakterii roda Salmonella v pishchevykh produktakh (Method of detection of Salmonella spp. in food), pat. No. 2570386 RU S1, G01N 33/02, M., FGU FIPS /; 2015, Opubl. 10.12.2015, Byul. No. 34.
13. GOST 31659-2012 Produkty pishchevye. Metod vyyavleniya bakterii roda Salmonella (Food products. Methods of the detection of Salmonella spp.), Moscow, Standartinform, 2014, 24 p.
14. Chugunova E. O., Suzina N. E., Zimin A. A. Morfologicheskii analiz sal'monelleznykh bakteriofagov (Morphological analysis of Salmonella bacteriophage), Materialy III Pushchinskoi shkoly-konferentsii «Biokhimiya, fiziologiya i biosfernaya rol' mikroorganizmov», Pushchino, 2016 g., pp. 63- 65.
