CC BY
25
2014, Т. 4, № 1
Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций...»
ют главным образом за счет изменения рецепторной специфичности гемагглютинина (НА) с типа связи а2-3 на а2-6, чему способствует аминокислотные замены Q226L и G228S в НА1. Адаптацию вирусов гриппа к клеткам млекопитающих можно смоделировать в лабораторных условиях, например, при смене системы культивирования с куриных эмбрионов на культуру клеток. В работе были изучены два варианта вируса А/Сингапур/1/1957 (Н2К2), имеющих разную рецепторную специфичность. Секвенирование их геномов показало наличие аминокислотных различий в НА1 (Е156К, Q226L, G228S) и нейраминидазе (КА) (К19Т), где вариант EQG имел специфичность а2-3, а вариант KLS — а2-6. Адаптация вирусов к культуре клеток МОСК была проведена путем их 5-кратного пассирования. Секвенирование НА и КА пассажных вариантов выявило их гетерогенность, в связи с чем вирусы далее клонировали методом бляшек, и были получены гомогенные клоны обоих вариантов. Вариант KLS приобрел две дополнительные мутации в НА1 ^158Е и L321P), а вариант EQG — мутацию в НА1 в одном клоне (Р22^) и в НА2 во втором клоне (А96У). Для изучения им-муногенности и кросс-реактивности вирусов мышей заражали интраназально вариантами KLS, KLS-EP, EQG, EQG-S и EQG-V в дозе 1050ЭИД50, после чего на 21 день забирали сыворотки и смывы верхних дыхательных путей. Титры ^А и IgG антител определяли в ИФА. Титры сывороточных IgG антител вариантов KLS и KLS-EP были достоверно выше, чем у варианта EQG, тогда как у вариантов EQG-S и EQG-V — достоверно ниже, чем у EQG. Варианты EQG-S и EQG-V вызывали образование более высоких уровней локальных ^А антител, чем вариант EQG. Использование в качестве антигенов вирусов KLS и KLS-EP выявляло достоверно более высокие титры сывороточных IgG антител, чем антиген EQG. Кроме того, использование антигена EQG-S вместо EQG значительно снижало уровни IgG антител у мышей, иммунизированных вариантами KLS, EQG, EQG-S и EQG-V; это может свидетельствовать, что замена P221S является езсаре-мутацией. Таким образом, рецепторная специфичность вируса гриппа влияет на его иммуногенность и антигенность.
Работа поддержана грантом РФФИ № 14-04-32088 мола.
РАЗРАБОТКА ДИАГНОСТИКУМА ЭРИТРОЦИТАРНОГО ШИГЕЛЛЕЗНОГО ЗОННЕ
О.Ю. Кузнецова1, В.Н. Вербов1, В.Л. Львов2
1ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург 2 ООО «Гритвак», Москва
Ежегодно общее число случаев шигеллезов в мире оценивается в 165 млн. Почти 69% всех случаев заболевания и 61% всех летальных исходов приходится на группу детей младше 5 лет. Серологические методы подтверждения дизентерии являются ускоренными методами диагностики. Один из таких методов — реакция пассивной гемагглютинации (РПГА).
Цель работы заключалась в разработке эритро-цитарного О-антигенного диагностикума для выявления специфических антител к шигеллам Зонне.
Диагностикум был получен путем сенсибилизации акролеинизированных эритроцитов кур хро-матографически очищенным липополисахаридным
О-антигеном шигелл Зонне в 0,01 М фосфатном буферном растворе, рН 7,2±0,2, (ФБР). Приготовление раствора антигена осуществлялось 2 методами, позволяющими повысить его сенсибилизирующую активность:
1. растворение навески сухого антигена в ФБР с последующей дробной стерилизацией в автоклаве текучим паром при 100°С, давлении 0,9 атм. по 30 мин в течение 3 дней;
2. растворение навески сухого антигена в 8 М растворе мочевины с последующим нагреванием в кипящей воде до полного растворения хлопьев антигена.
Специфическая активность диагностикумов, полученных из различным образом активированных антигенов, определялась методом РПГА с использованием 2 сывороток:
1. сыворотка диагностическая шигеллезная Зонне адсорбированная сухая для РА «Агнолла» в разведении 1:10 (Санкт-Петербургский НИИВС);
2. сыворотка диагностическая шигеллезная Зон-не неадсорбированная сухая из набора реагентов «Диагностикум эритроцитарный шигеллезный Зон-не антигенный, жидкий» в разведении 1:100 (ООО «Био-Диагностика»).
Титры сывороток при постановке с обоими диа-гностикумами совпали (1:1280 и 1:6400 соответственно). Это позволяет ввести в технологический процесс изготовления диагностикума активацию антигена 8 М раствором мочевины.
СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСА ГРИППА, ЦИРКУЛИРОВАВШЕГО В ПОПУЛЯЦИИ СВИНЕЙ НА ТЕРРИТОРИИ КАЗАХСТАНА В 2013 г.
Т.В. Кузнецова, Т.И. Глебова, М.Г. Шаменова, Г.В. Лукманова, Н.Г. Кливлеева
РГПИнститут микробиологии и вирусологии КНМОН РК, г. Алматы, Казахстан
Проведено серологическое исследование проб сывороток крови, собранных в 2013 г. от свиней в свиноводческих хозяйствах трех областей Казахстана: Кустанайская, Карагандинская и Восточно-Казахстанская. Всего собрано 83 пробы от животных 2—4-месячного возраста (группа доращивания), из них 34 от свиней Восточно-Казахстанской, 30 — Кустанайской и 19 — Карагандинской областей. Пробы крови тестировали в реакции торможения гемаглютинирующей активности (РТГА) на наличие антител против вируса гриппа: А/Iowa/15/30 (Нsw1N1), А/СаПРогша/07/09 (НШ1) и А/^сошт/ 67/05 (Н3К2). Результат считали положительным при титре гемагглютинации > 1:20.
По данным проведенной РТГА, наибольшее количество положительных образцов зарегистрировано в Кустанайской области — восемь (26,6%), причем все они были серопозитивными к подтипу А/ ^а/15/30 (Нsw1N1) (титр РТГА составил 1:40-1:640). Антитела к вирусам гриппа А/СаП£огша/07/09 (НШ1) и А/Wisconsin/67/05 (Н3К2) отсутствовали.
В пробах крови, собранных от свиней в Восточно-Казахстанской области, антитела к подтипу А/ СаП£огша/07/09 (НШ1) были выявлены в одном образце (3%), четыре пробы (11,7%) оказались серопо-ложительными к штамму А/Wisconsin/67/05 (Н3К2). Титры в РТГА варьировали в пределах 1:40-1:160. Все исследуемые пробы из свиноводческих хозяйств
Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций...»
Инфекция и иммунитет
Карагандинской области оказались серонегативны-ми ко всем используемым в РТГА антигенам вируса гриппа.
Таким образом, наибольшее количество серо-позитивных образцов было к штамму A/Iowa/15/30 (Hsw1N1), собранных в свиноводческих хозяйствах Кустанайской области. В образцах Восточно-Казахстанской области антитела обнаружены к вирусам А/Wiseonsin/67/05 (H3N2) и A/California/07/09 (H1N1). Хотя, полученные данные ограничиваются количеством собранных образцов из трех областей Казахстана, в целом, результаты проведенного исследования подтверждают, что на территории республики среди свинопоголовья циркулируют вирусы гриппа H1N1 и H3N2.
Авторы выражают благодарность директорам республиканских областных ветеринарных лабораторий за оказание помощи при сборе образцов.
АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ HELICOBACTER PYLORI В КАЗАХСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ
Г.Н. Кулмамбетова1, Э.Е. Бекенова1, А.К. Туякова1, А.А. Логвиненко2, А.Т. Сукашев2, К.Х. Алмагамбетов1
1 Республиканская коллекция микроорганизмов, Астана, Казахстан
2Национальный научный медицинский центр, Астана, Казахстан
Helicobacter pylori в большинстве случаев является возбудителем заболеваний желудочно-кишечного тракта таких, как гастрит, язва двенадцатиперстной кишки, аденокарцинома и MALT-лимфома. В мире хеликобактером инфицировано 50% людей. В медицинской практике пациентам, инфицированным Helicobacter pylori, принято назначать курс эрадика-ции. Данный курс включает тройную схему терапии с применением ингибитора протонной помпы и двух антибиотиков: амоксициллина, кларитромицина и метронидазола, уровень эрадикации хеликобакте-ра при этом достигает 70—80%. На сегодняшний день существует проблема возрастающей антибиотикоре-зистентности инфекции к назначаемым препаратам. Данных о резистентности Helicobacter pylori, распространенных в казахской популяции, не существует. Поэтому целью нашей работы было изучение спектра мутаций, ассоциированных с резистентностью Helicobacter pylori к кларитромицину, метронидазо-лу, амоксициллину, тетрациклину и рифампицину в штаммах, выделенных от симптоматических казахских пациентов.
Было изучено 16 штаммов H. pylori, выделенных из биопсийных образцов слизистой оболочки желудка симптоматических пациентов Национального научного медицинского центра. H. pylori культивировали на коламбиа агаре в микроаэрофильных условиях. Идентификацию H. pylori проводили с помощью анализа фрагмента 16S рРНК. Из выделенных штаммов экстрагировали ДНК. Спектр анти-биотикорезистентности определяли постановкой ПЦР на гены-кандидаты антибиотикорезистентно-сти с последующим секвенированием.
В результате проведенного анализа на антибиоти-корезистентность 16 штаммов H. pylori было выявлено наличие мутаций в гене 23S рРНК 56,25% T2182C, 12,5% и 6,25% A2142G, A2143G, соответственно. 25% AGA^TTC в гене 16STCR. 31,25% в гене rdxA смещение рамки считывания, а также 6,25% в гене rdxA ве-
дет к замене аминокислоты аланин на валин. 18,75% мутация в гене pbp1A ведет к замене аминокислоты Glu406^Ala. 4 штамма имели 2 мутации и более, что характерно для высокорезистентных штаммов бактерии.
Таким образом, 87,5% штаммов Helicobacter pylori в казахской популяции имели мутации, ассоциированные с антибиотикорезистентностью.
ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ ПРИ ОБОСНОВАНИИ ИХ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ РОЛИ В РАЗВИТИИ ИНФЕКЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ
Е.С. Кунилова1, И.С. Петрова2
1ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург
2ГКУ Инфекционная клиническая больница № 1, Москва
Подтверждение этиологической значимости условно-патогенного микроорганизма, выделенного из нестерильных полостей, является сложной задачей. При этом количественный показатель не всегда отражает этиологическое значение выделенного микроба. Так, при отитах, синуситах, бронхитах, пневмониях в 20—30% случаев со слизистых респираторного тракта выделяются Moraxella catarrhalis. При синуситах и длительных ринитах в 25—28% проб отделяемого синусовых пазух и носоглотки находят Staphylococcus epidermidis. Оценка результата лишь на основании вида выделенного микроорганизма и его количества может значительно снизить эффективность назначаемой врачом-клиницистом терапии.
Цель работы: обосновать значение генетических и фенотипических маркеров вирулентности штаммов M. catarrhalis и S. epidermidis при определении их этиологической роли в развитии инфекционных процессов респираторного тракта и среднего уха. Изучено 60 штаммов S. epidermidis, выделенных от больных с ринитом и синуситом, на наличие генов вирулентности sepA и icaA, кодирующих выработку протеазы SepA и интрацеллюлярного адгезина IcaA. Контролем служили 40 штаммов S. epidermidis, выделенных от здоровых людей. Изучены 10 штаммов M. catarrhalis, выделенных от больных с отитом, бронхитом и пневмонией, на наличие гена mcaP, кодирующего выработку бактерией белка McaP, принимающего участие в адгезии моракселл к клеткам слизистого эпителия. В качестве контроля исследованы 8 штаммов M. catarrhalis, выделенных от здоровых лиц. Фенотипические проявления действия гена sepA изучали по индексу лизированных нейтрофилов in vitro в присутствии штаммов S. epidermidis. Экспрессию гена mcaP подтверждали путем определения коэффициента адгезированных клеток M. catarrhalis на клетках буккального эпителия in vitro.
Установлено, что ген sepA выявлен у 90% штаммов S. epidermidis, выделенных от больных, в то время, как штаммы, полученные от здоровых лиц, имели его в 15% случаев. При этом 80% штаммов от больных, несущих ген sepA, имели высокий уровень лизирова-ния нейтрофилов по сравнению со штаммами, выделенными от здоровых лиц. Все штаммы M. catarrhalis, выделенные от больных, имели ген mcaP, в то время, как у здоровых лиц эти же бактерии его не содержали. Наибольшим коэффициентом адгезии к эпителиальным клеткам обладали штаммы M. catarrhalis, выделенные от больных с пневмонией.
