CC BY
13
ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ «АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ», ПОСВЯЩЕННАЯ 90-ЛЕТИЮ РОССИЙСКОГО НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОГО ИНСТИТУТА ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ
Санкт-Петербург 30 июня - 1 июля 2022 г.
ное присутствие аллогенных клеток в месте введения. Однако эти работы проводились на реципиентах, у которых на момент инъекции клеток иммунитет был подавлен, а функциональный анализ МСК не проводился, поэтому они не могут быть строгим доказательством. Несмотря на имеющиеся противоречия, МСК считаются иммунопривилегированными стволовыми клетками.
Цель. Получение прямых экспериментальных свидетельств того, что МСК костного мозга, маркированные ксеногенным белком, являются иммунопривилегированными in vivo и сохраняют свою функциональность после длительного воздействия иммунной системы.
Материалы и методы. КМ трансгенных мышей линии Nestin-GFP имплантировали в виде фрагмента ткани под капсулу почки изогенным иммунокомпетентным реципиентам линии C57Black/6 (n = 14) для формирования очагов эктопического кроветворения. Nestin-GFP мыши были предоставлены исследовательским фондом государственного университета Нью-Йорка. Линия Nestin-GFP характеризуется усиленным зеленым флуоресцентным белком (eGFP) под регуляторными элементами гена Nes, что обеспечивает флуоресцентный иммуногенный маркер для небольшой фракции клеток КМ, включая CD45-Nes-GFP+ МСК. Через 42 дня после имплантации трансгенного КМ у части реципиентов (n = 8) оценивали наличие первичных очагов, выделяли клетки внутренней клеточной массы очагов. Клетки окрашивали моноклональными антителами против CD45, ядерным красителем Syto41, а также интеркалирующим ДНК красителем 7-AAD для исключения клеток с нарушенной целостностью поверхностной мембраны. С помощью многоцветной цитофлуорометрии измеряли долю CD45-Nes-GFP+ и
CD45+Nes-GFP+ клеток среди ядерных живых клеток. Остальные первичные очаги (п = 6) ретрансплантировали вторичным реципиентам линии Nestm-GFP. Вторичные очаги анализировали аналогично первичным.
Результаты. Несмотря на воздействие иммунитета, первичные очаги эктопического кроветворения сформировались. В них были обнаружены как CD45-Nes-GFP+, так и CD45+Nes-GFP+ клетки. Доля CD45-Nes-GFP+ клеток составила 1,6 х 10-5 (среднее геометрическое со стандартной ошибкой в 2,4 раза). Не было установлено статистически значимых отличий от син-генного контроля трансплантации в Nestin-GFP реципиентов, где доля таких клеток составила 1,2 х 10-5 (среднее геометрическое со стандартной ошибкой в 1,9 раза). Вторичные очаги также сформировались. В них доля CD45-Nes-GFP+ клеток составила 12 х 10-5 (среднее геометрическое со стандартной ошибкой в 1,5 раза), что не имело статистически значимых отличий от интактного КМ Nestin-GFR
Выводы. Согласно современным представлениям, иммунная система реципиентов должна была элиминировать клетки eGFP+, включая все Nes-GFP+ МСК. Эти результаты показывают, что МСК, маркированные ксеногенным белком, уклоняются от иммунных реакций. Результаты демонстрируют способность МСК к самообновлению и сохранению своей функциональности после длительного воздействия иммунитета, несмотря на наличие ксеногенного маркера. Успех этого исследования, вероятно, обусловлен имплантацией цельного фрагмента КМ без предварительной диссоциации клеток и того факта, что подавляющее большинство клеток были иммунологически эквивалентны клеткам реципиента.
Работа поддержана грантом РНФ № 22-25-00459.
1А.Н. Кириенко, iE.B. Мотыко, 1Д.В. Кустова, iE.B. Ефремова, 3Е.В. Морозова, 2Д.И. Шихбабаева, 2О.Ю. Виноградова, iB.A. Шуваев, iC.B. Волошин, C.B. 1Сидоркевич, 1И.С. Мартынкевич
СЕКВЕНИРОВАНИЕ СЛЕДУЮЩЕГО ПОКОЛЕНИЯ (NGS) В ДИАГНОСТИКЕ, ОПРЕДЕЛЕНИИ ПРОГНОЗА И ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ У PH-НЕГАТИВНЫХ ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМИ МИЕЛОИДНЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ
гФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург;
2ГБУЗ Городская клиническая больница имени С.П. Боткина Департамента здравоохранения города Москвы, Москва; 3Научно-исследовательский институт детской онкологии, гематологии и трансплантологии имени Р. М. Горбачевой, Санкт-Петербург
Введение. За последнее десятилетие высокопроизводительное секвенирование (NGS) расширило наши представления о геномном ландшафте гематологических злокачественных новообразований. Обнаруженные при NGS новые биомаркеры сегодня широко используются в клинической практике для улучшения диагностики, стратификации больных в прогностические группы и выборе современной, в том числе таргетной, терапии у Ph-негативных пациентов с МПН.
Цель. Оценить возможности использования NGS технологии в диагностике и определении прогностических особенностей течения заболевания у Ph-негативных пациентов с МПН.
Материалы и методы. В пилотное исследование включены 36 пациентов (17 мужчин и 19 женщин) в возрасте от 27 до 79 лет (медиана Me=55 лет). Диагноз МПН (ИП, ЭТ, ПМФ, мДс, ОМЛ), не ассоциированный с филадельфийской хромосомой (Ph- МПН), был ранее установлен у всех 36 больных. У 20 из 36 исследованных пациентов (55%), у которых при цито- и молеку-лярно-генетической диагностике определен нормальный кари-отип, не обнаруживались драйверные в генах CARL, MPL, JAK2 и другие соматические мутации, NGS исследование проводилось с целью установления клональной природы заболевания. Вместе с этим у всех больных NGS анализ позволил выявить дополнительные прогностически значимые мутации. У всех пациентов секвенирование выполнялось с использованием миелоидной панели из 116 генов со средней глубиной прочтения 200х или
1000х на приборе MiSeq (Illumina). При анализе полученных данных применялся 3% порог частоты встречаемости аллеля (VAF). Клиническая значимость мутаций устанавливалась по базам данных COSMIC и ClinVar.
Результаты. В ходе выполнения NGS анализа были выявлены генетические аномалии у всех исследуемых пациентов, в среднем определялись 10 мутаций (от 4 до 43 у одного больного). При этом мутации соматической природы выявлены в 92% случаев (33/36) в количестве от 1 до 13 (в среднем 4 мутации у одного пациента). В 70% исследуемых проб (25/36) обнаруживались от 1 до 3 мутаций с известной клинической значимостью. У всех больных из группы без драйверных и соматических мутаций, без хромосомных аберраций с использованием дополнительного метода исследования NGS были найдены соматические мутации (как клинически значимые, так и c неизвестной клинической значимостью), что позволило подтвердить клональность заболевания. Для уточнения прогноза заболевания все пациенты были разделены на две группы - с благоприятным (пациенты с драйверными мутациями (16/36), нормальным кариотипом) и неблагоприятным прогнозом течения заболевания (с тринегативным мутационным статусом (20/36), с мутациями в генах эпигенетической регуляции (4/36)). У 8/16 (50%) пациентов с драйверными мутациями в генах CALR и JAK2 наблюдались дополнительные мутации в генах эпигенетической регуляции (ASXL1, EZH2, IDH1), у 3/16
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVIII, № 2, 2022
(19%) в гене-регуляторе процесса транскрипции (TET2), что является фактором неблагоприятного прогноза. У пациентов с диагнозом Ph-МПН с неблагоприятным прогнозом также обнаруживали мутации в генах эпигенетической регуляции (ASXL1, IDH1, SRSF2), в генах, ответственных за передачу сигнала (RAS-гены, PTPN11), TET2. Стоит отметить мутацию в гене ATM (R2912G), обнаруженную у пациентки с диагнозом ПМФ 0АК2-ассоциированный) и трансформацией в ОМЛ. По литературным данным, мутации в гене ATM влияют на прогрессию заболевания предположительно за счет накопления поврежде-
ний ДНК и геномной нестабильности.
Выводы. Данные, полученные при применении NGS технологии, позволяют подтвердить клональную природу заболевания, оценить прогноз течения заболевания и подобрать персонализированную терапию для Р^негативных пациентов с диагнозом МПН. На сегодняшний день актуальным является расширение панели секвенируемых генов для пациентов с диагнозом Р^МПН, а также исследование иных генетических механизмов, лежащих в основе патогенеза заболевания, например, изменения уровня
В.А. Кобилянская, Т.В. Морозова, Л.Р. Тарковская, Е.Р. Шилова
ВЛИЯНИЕ ТЕРАПИИ ЭКУЛИЗУМАБОМ НА СОСТОЯНИЕ ГЕМОСТАЗА У ПАЦИЕНТОВ С ПАРОКСИЗМАЛЬНОЙ НОЧНОЙ ГЕМОГЛОБИНУРИЕЙ
ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург
Введение. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) - это редкое клональное, прогрессирующее, инвалидизирую-щее заболевание, характерным проявлением которого является неконтролируемая активация системы комплемента. Характерным клиническим проявлением при значительном ПНГ - клоне (обычно более 10 % от общего числа клеток крови) является хронический внутрисосудистый гемолиз, приводящий при его высокой активности к развитию анемии, повышенной наклонности к тромбозам и ряду органных нарушений. Тромботиче-ские события могут иметь место при небольшом размере ПНГ-клона, минимальном гемолизе, легкой анемии. Существенно то, что стандартная антикоагулянтная терапия не предотвращает развитие тромботических осложнений. Вошедший в современную клиническую практику препарат Экулизумаб на сегодняшний день является единственным эффективным средством патогенетической терапии и представляет собой моноклональное антитело, блокирующее образование терминального комплекса активации комплемента на этапе активации С5-компонента и формирования мембран-атакующего комплекса. Клинически это проявляется значительным уменьшением частоты жизнеу-грожающего тромбоза, поражения почек и легочной гипертен-зии. В связи с этим представлялось важным оценить влияние Экулизумаба на состояние системы гемостаза у пациентов с ПНГ в динамике лечения.
Цель. Оценить изменения в системе гемостаза у пациентов с ПНГ под влиянием терапии Экулизумабом.
Материалы и методы. Обследовано 5 пациентов, страдающих ПНГ Из них 4 женщины и 1 мужчина в возрасте от 29 до 50 лет. На момент проведения исследований у всех пациентов определена гемолитическая ПНГ, в том числе у 2 пациенток, как трансформация из апластической анемии с полной ремиссией после комбинированной иммуносупрессивной терапии и у одной пациентки - сочетанная форма нетяжелой апластиче-ской анемии и ПНГ. Диагноз классической гемолитической ПНГ установлен исходно у 2 пациентов. Длительность заболевания от момента диагностики ПНГ до назначения таргетной терапии колебалась от 3 месяцев до 20 лет.
Результаты. У всех 5 пациентов до начала терапии Экули-
зумабом показатели общепринятых в клинической практике скрининговых тестов таких, как активированное парциальное тромбопластиновое время, протромбиновое время и концентрация фибриногена не отличались от нормы и сохранялись на таком же уровне через 2 месяца лечения. Аналогичная картина отмечалась и в отношении естественных антикоагулянтов: активность антитромбина, протеина С и уровень свободного протеина S, оставались в пределах нормальных значений на всем протяжении исследования. В то же время у всех пациентов до начала терапии Экулизумабом имело место значительное повышение активности фактора VIII - от 204 до 254 % ( норма 58-180 %) и уровня D-димера - от 357 до 531 нг/мл (норма <243 нг/мл), что, как известно, отражает состояние гиперкоагуляции. В ходе лечения Экулизумабом были получены данные, свидетельствующие о достижении нормальных значений уровня D-димера у всех обследованных пациентов и активности фактора VIII у 4 из 5 пациентов.
Исследование функциональной активности тромбоцитов с различными агрегирующими агентами было проведено у 5 пациентов. Только у 2 из 5 перед началом лечения наблюдалось повышение агрегации с АДФ в конечной концентрации 5 мкМ и коллагеном (максимальная амплитуда, МА) по сравнению с нормой. Эти пациенты отличались от других и более выраженными признаками гиперкоагуляции (отмечены самые высокие значения активности фактора VIII и уровня D-димера). На фоне лечения Экулизумабом отмечалась нормализация исходно повышенной агрегации тромбоцитов, равно как и снижение до нормальных значений плазменных показателей. У остальных пациентов различий показателей агрегации (МА) до и после лечения не обнаружено
Вывод. Лечение экулизумабом оказывает нормализующее действие на систему гемостаза пациентов с ПНГ. Об этом свидетельствуют снижение до нормальных значений уровня D-димера, активности фактора VIII и функциональной активности кровяных пластинок. Выявленные особенности действия Экулизумаба на систему гемостаза открывают новые возможности предупреждения развития опасных для жизни тромботиче-ских событий у больных ПНГ.
К.А. Комиссаров, В.. Солдатенков, С.И. Капустин, О.. Кузакбирдиева, О.В. Солдатенкова,
В.В. Бураков, Н.Б. Салтыкова, Л.П. Папаян
СИСТЕМА ГЕМОСТАЗА ПРИ ТРОМБООБЛИТЕРИРУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ АРТЕРИЙ:
КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ ПАРАЛЛЕЛИ
ФГБУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии ФМБА России», Санкт-Петербург
Введение. Тромбооблитерирующие заболевания артерий ных причин смертности и инвалидизации населения в цивили-и их осложнения в настоящее время являются одной из основ- зованных странах. Несмотря на то, что феномен тромбофилии
